Summary
هنا، فإننا نقدم بروتوكول لتنقية خطوة واحدة بكفاءة الإنسان معلم نشط إزفاء عشر-11-2 (TET2) ديوكسيجيناسي 5-ميثيلسيتوسيني باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والتحليل استخدام كتلة سائل اللوني-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS)-النهج القائم.
Abstract
تنظيم النسخ جينية توسط 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) لعبت دوراً حاسما في تنمية حقيقية النواة. يتم إنجاز demethylation هذه علامات جينية باكسدة متسلسلة بعشر-أحد عشر إزفاء ديوكسيجيناسيس (TET1-3)، تليها إصلاح الختان جليكوسيلاسي-تعتمد على قاعدة ثايمين-الحمض النووي. المنظمة الجينات TET2 بسبب الطفرات الوراثية أو عن طريق آليات جينية أخرى يقترن سوء تشخيص في المرضى الذين يعانون من سرطانات متنوعة، خصوصا من المكونة للدم الأورام الخبيثة. وهنا يصف لنا تنقية كفاءة خطوة واحدة من النشطة انزيماتيكالي ديوكسيجيناسي TET2 معلم البشرية باستخدام كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة. كذلك نقدم نهجاً سائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) التي يمكن فصل وتحديد مقدار أربع قواعد الحمض النووي العادي (A و T، ز وج)، فضلا عن أربع قواعد السيتوزين المعدلة (5-ميثيل، 5-هيدروكسيميثيل، 5-فورميل، و 5-الكربوكسيل). يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم نشاط نوع البرية والمسخ ديوكسيجيناسيس TET2.
Introduction
موقف C5 قواعد السيتوزين داخل دينوكليوتيديس البد هو الموقع مثلايشن الغالبة في جينومات الثدييات1(5mCpG). وبالإضافة إلى ذلك، عدد من الدراسات التي أجريت مؤخرا كشفت C5 واسعة السيتوزين مثلايشن (5mC) في مواقع غير المعبأة (5mCpH، حيث ح = A, T, أو C)2،3. تعديل 5mC بمثابة كاتم الصوت النسخي على ريتروترانسبوسونس الذاتية والجينات المروجين3،،من45. مثلايشن الحمض النووي في 5mC كما تلعب أدواراً هامة في المنظمة كروموسوم إكس، طابعة الجينات، وإعادة برمجة النووي والجينات الخاصة بالانسجة التعبير5،،من67. مثلايشن سيتوزين في موقف C5 تضطلع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي، والطفرات في هذه الإنزيمات تسبب عيوب إنمائية كبيرة8. تبدأ إزالة علامات 5mC TET1-3 5mC أوكسيداسيس،من910. تحويل هذه الأسرة تيت ديوكسيجيناسيس 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) عن طريق الأكسدة متسلسل الخطوات11،،من1213. وأخيراً، يستبدل ثيمين-DNA glycosylase إف سي 5 أو 5caC على السيتوزين غير معدلة باستخدام مسار إصلاح الختان القاعدة11.
واعتبرت TET2 الجينات البشرية كثيرا ما تحور جين في الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة بما في ذلك myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين)14،،من1516، حركة الديمقراطيين الاشتراكيين myeloproliferative الأورام ( مدسمبن)، واللوكيميا النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) التي تنشأ من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، وحركة الديمقراطيين الاشتراكيين MPN16. مستويات تعديل 5hmC في نخاع العظام الحمض النووي أقل في المرضى مع الطفرات TET2 مقارنة بتلك التي مع نوع البرية (wt)-TET214. ووضعت عددا من المجموعات TET2-خروج المغلوب الماوس نماذج توضيح دورها في هيماتوبويسيس العادية وتحول النقوي17،18،،من1920. كانت هذه الفئران مع حدوث طفرات في الجين TET2 في البداية طبيعية وقابلة للاستمرار، ولكن تظهر الأورام الخبيثة المكونة للدم المختلفة كما أنها تتراوح أعمارهم في التسبب الوفاة المبكرة. وأظهرت هذه الدراسات الأدوار الهامة التي تقوم بها الوزن TET2 في تمايز المكونة للدم العادي. في هذه النماذج الماوس ومتخالف الخلايا الجذعية المكونة للدم (TET2+/- هسكس) متماثل TET2-/- قد هسكس ميزة تنافسية على هسكس TET2 وزن متماثل في إعادة إسكانها يكونوا الأنساب المكونة للدم ككل TET2+/- ووضع TET2-/- هسكس الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة17،18. تبين هذه الدراسات أن هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي يغير وضع هسكس والنتائج في الأورام الخبيثة المكونة للدم.
مشابهة للفئران مع الطفرات في الجينات TET2، معظم مرضى اللوكيميا المجاهرة هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي النشاط. تشمل هذه الطفرات الجسدية معظمهم متخالف الطفرات تحول الإطار وهراء المنتشرة في جميع أنحاء الجسم الجينات TET2 بينما مغلطه الطفرات الأكثر متفاوت في المجال ديوكسيجيناسي12. حتى الآن، يقال توصيف قليلاً من TET2 wt والمسخ في الأدب أساسا بسبب صعوبات في إنتاج ديوكسيجيناسي TET2 وبه المقايسة21. هنا، نحن التقرير على تنقية خطوة واحدة بسيطة ديوكسيجيناسي TET2 الأصلية باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. علاوة على ذلك، كان مقايسة LC-MS/MS كمية الأمثل والمستخدمة لقياس النشاط الأنزيمي من الأم TET2 ديوكسيجيناسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الاستنساخ وتنقية ديوكسيجيناسي TET2 البشرية غير المميزة
- استنساخ البشر TET2 ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) إلى ناقل الوجهة pDEST14 استخدام تقنية جزئ الخاصة بالموقع كما هو موضح سابقا22.
ملاحظة: قد أثبتت الدراسات السابقة أن المجال ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) ج-محطة TET2 هو21،مجال نشاط حفازة الحد الأدنى23. من أجل التعبير عن ليس تمييز المجال ديوكسيجيناسي TET2 باستخدام ناقلات pDONR221، أدرجت متواليات تلميع دالجارنو وكوزاك في التمهيدي إلى الأمام خلال PCR (الجدول 1). - من أجل التحول البكتيري، إضافة 1 ميليلتر من ناقلات التعبير المؤتلف pDEST14 التي تحتوي على ديوكسيجيناسي TET2 معلم البشرية (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) إلى 100 ميليلتر من كيميائيا المختصة كولاي BL21 الخلايا (DE3) في أنبوب 1.7 مل. الحفاظ على الجليد الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل تليها صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في حمام مائي.
- فورا بعد صدمة الحرارة، إبقاء الخلايا مرة أخرى على الجليد للحد الأدنى من 2 دقيقة. وفي أعقاب ذلك، إضافة 250 ميليلتر من مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (S.O.C وسائل الإعلام) إلى الخلايا. احتضان الخلايا البكتيرية ح 1 في 37 درجة مئوية في شاكر.
- وبعد الحضانة، تدور أسفل الخلايا قبل سينتريفوجينج الأنبوبة في س 9,000 ز لتجاهل الحد الأدنى 1 70% المادة طافية من بيبيتينج حل بيليه في اليسار عبر وسائل الإعلام.
- نشر تعليق خلية على طبق أغار لوريا مرق (رطل) تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان لوحة ح 16 عند 37 درجة مئوية.
- حدد أحد مستعمرة معزولة وتطعيم ذلك إلى 10 مل الإعلام الأمبيسلّين رطل في أنبوب 50 مل. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في شاكر لبين عشية وضحاها. وفي أعقاب ذلك، استخدام 100 ميليلتر للثقافة من أنبوب 50 مل لتطعيم 100 مل الإعلام الأمبيسلّين رطل. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية على شاكر 180 لفة في الدقيقة واستخدامها كالثقافة الأولية. في اليوم التالي، استخدم مل 6 كل من الثقافة الأولية لتطعيم قوارير 15، كل الوسائط التي تحتوي على مل 600 رطل-الأمبيسلّين. والآن، احتضان قوارير 15 في 37 درجة مئوية على شاكر 180 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: للتحقق من استنساخ محولة، إجراء الهضم تسلسل أو تقييد الحمض النووي مع بلازميد عزل الحمض النووي. - للتحقق من كثافة ثقافة البكتيرية، قياس لها OD600 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. بعد الثقافة تصل إلى كثافة 0.8 في التطوير التنظيمي600، الحث على التعبير عن البروتين TET2 مع 300 ميليلتر من 1 م (تركيز النهائي من 0.5 مم في 600 مل) إيبتج في كل قارورة، وكذلك تنمو ثقافة ح 16 في 17 درجة مئوية.
- بعد 16 ساعة، نقل ثقافة البكتيرية لزجاجات أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية التعبير عن إنزيم TET2 في س 5,250 ز 45 دقيقة استخدام بيليه البكتيرية لتنقية TET2.
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات المتبقية في تنقية البروتين على الجليد أو عند 4 درجة مئوية. - ريسوسبيند بيليه البكتيرية في 100 مل من 50 مم مس (2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك) المخزن المؤقت، الرقم الهيدروجيني 6، و sonicate عن 5 × 30 ثانية في السلطة 20 مع 60 s فترات التبريد.
- تدور جمع المادة التي تحتوي على الإنزيم TET2 القابلة للذوبان طافية في س 5,250 ز عن 45 دقيقة ويمر 0.45 ميكرومتر مرشحات قبل التحميل على نظام فبلك.
ملاحظة: في هذه التجارب، كان الإنزيم TET2 مستقرة جداً، ولكن إذا لزم الأمر حوزتي المانع كوكتيل يحتوي على 1 مم بينزاميديني-HCl، وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف) و 0.5 مم 1,10-س-فينانثروليني يمكن أن تضاف إلى الخلية إلى منع تدهور إنزيم TET2. تجنب استخدام يدتا أو عطا في المانع الكوكتيل هذه قد تتداخل مع كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة التالية. - علبة 30 مل راتنج تبادل الأيونات الموجبة القوية في عمود فبلك. حجته العمود مع 10 مجلدات سرير الغسيل المخزن المؤقت (العازلة مس 50 مم، الرقم الهيدروجيني 6) بمعدل تدفق ثابت من 0.3 مل/دقيقة باستخدام نظام فبلك.
- تحميل توضيح على العمود قبل متوازن والمياه والصرف الصحي مع ∼10 سرير حجم المخزن المؤقت الغسيل حتى يصبح من الواضح التدفق من خلال.
- الوت TET2 استخدام 0-100% التدرج من المخزن المؤقت الغسيل إلى شطف المخزن المؤقت (العازلة مس 50 مم، الرقم الهيدروجيني 6، 1 م كلوريد الصوديوم) في 15 سرير حجوم متبوعاً بعقد في المخزن المؤقت شطف 100% لوحدات التخزين اثنين سريراً.
ملاحظة: جمع عينات (100 ميليلتر في كل) خلية قبل وبعد العمود تحميل جنبا إلى جنب مع جميع الكسور شطف وتحليل على 10 ٪ حل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. - تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين TET2، وتجميد الجافة، حل البالته الإنزيم في 10 مل ماء ومخزن في-80 درجة مئوية.
2-أكسدة 5mC من ديوكسيجيناسي TET2
- أداء جميع ردود الفعل ديميثيليشن في ثلاث نسخ مع 3 ميكروغرام من الركازة (25-مير الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة، الجدول 2).
- إضافة 100 ميكروغرام لتنقية TET2 الإنزيم في 50 ميليلتر من رد فعل مجموع المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم حبيس (pH 8.0)، 200 ميكرومتر فيسو4، 2OG 2 مم (2-أوكسوجلوتاراتي/α-كيتوجلوتاراتي)، واسكوربات 2 مم واحتضان في 37 درجة مئوية ل 1 ح21.
- إخماد تفاعلات أكسدة TET2 حفزت مع 5 ميليلتر 500 مم يدتا.
- بعد تبريد ردود فعل TET2، إعداد العينات للتحليل LC-MS/MS بفصل الحمض النووي من خليط رد فعل TET2 باستخدام أعمدة تنقية اليغو.
- إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم اليغو ميليلتر 55 تطفئ رد الفعل.
- وفي أعقاب ذلك، إضافة 400 ميليلتر من الإيثانول 100% إلى الخليط. تمرير هذا الخليط من خلال عمود ربط اليغو.
- يغسل الحمض النووي منضم مع 750 العازلة أغسل ميليلتر والوت في 20 ميليلتر المياه.
- هضم الحمض النووي المعزولة مع وحدات 2 من الدناز أنا ووحدات 60 من نوكلاس S1 في 37 درجة مئوية ح 12 لإنتاج الفرد نوكليوزيد-مونوفوسفاتيس.
- وبعد الهضم، إضافة وحدات 2 للعجل الفوسفاتيز القلوية المعوية (سياب) في العينات واحتضانها لإضافة ح 12 في 37 درجة مئوية لإزالة مجموعات الفوسفات الطرفي من نوكليوزيد-مونوفوسفاتيس للحصول على نوكليوسدس.
- التحديد الكمي لجميع نوكليوسدس، وبخاصة تعديل سيتوسينيس، استخدام الأسلوب LC-MS/MS الموصوفة أدناه.
3-كمية الإنزيم LC-MS/MS-تعتمد التنمية
- إعداد 100 ميكرومتر الأسهم حل جميع نوكليوسدس السيتوزين تم التعديل [5-الميثيل-2 '-ديوكسيسيتيديني (5mdC)، 5-هيدروكسيميثيل-2'-ديوكسيسيتيديني (5hmdC)، 5-فورميل-2 '-ديوكسيسيتيديني (5fdC)، و 5-كاربوكسي-2'-ديوكسيسيتيديني (5cadC)] وقواعد الحمض النووي العادي (الأدنين، ثايمين، سيتوزين، وجوانين) في المياه [هبلك]-الصف لتطوير أسلوب LC-MS/MS.
- تحسين نوكليوزيد-تعتمد على MS/MS المعلمات عن طريق غرس حلول الأسهم، في وقت واحد، في مطياف الشامل بمعدل تدفق 10 ميليلتر/دقيقة في EMS وضع الالتقاط بالماسح. تحسين أثر المعلمات: ديكلوستيرينج المحتملة (DP) ومدخل المحتملة (EP) والاصطدام خلية مدخل المحتملة (CEP)، الطاقة الاصطدام (CE) والاصطدام خلية الخروج المحتملة (ككسب) لكل نوكليوزيد الحمض النووي باستخدام الآلي التحسين الكمي ميزة البرنامج.
- تحسين معلمات MS/MS تعتمد على المصدر بالحقن ميليلتر 10 من الأسهم الحل باستخدام تدرج مع المذيب 25% ب بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة حيث المذيبات A خلات الأمونيوم 10 ملم (pH 4.0) ومذيب ب 20% الاسيتو الانيتريل مع خلات الأمونيوم 10 ملم (pH 4.0). تحسين أثر المعلمات: ستارة الغاز (لئيم): 10-50، درجة الحرارة: 0-600 درجة مئوية، 1 تدفق الغاز (GS1): 0-50، 2 تدفق الغاز (GS2): 0-50، كوليسيونالي المنشط الانفصال (CAD): منخفض-متوسط-مرتفع، وأيون رذاذ الجهد (ق. أ): 4000-5500 لكل نوكليوزيد الحمض النووي باستخدام دليل التحسين الكمي ميزة في البرنامج في وضع الاتحاد الدولي للسيارات (تحليل تدفق الحقن).
- لفصل كل ثمانية نوكليوسدس الحمض النووي، نفذ اللوني السائل باستخدام التدرج التالي: المذيبات 0% ب (0-2 دقيقة)، 0-20% المذيب ب (2-5 دقائق)، 20-60 ٪ مذيب ب (5-9 دقيقة)، 60-0% المذيب ب (9-10 دقيقة) وحجته ثم مع المذيب A لمدة 5 دقائق بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة على عمود C18 (حجم الجسيمات: 5 ميكرومتر، "حجم المسام": 120).
- استخدام معلمات MS/MS الأمثل (الخطوة 3، 2 و 3-3) مقترنة بالتدرج اللوني السائل المذكور أعلاه (الخطوة 3، 4)، تحديد الرد الخطي، والحد من الكشف عن (اللد)، والحد الأدنى للقياس الكمي (للوق) باستخدام تمييع شقين المسلسل خليط القياسية 100 ميكرومتر، يحتوي على جميع نوكليوسدس ثمانية. رسم المنحنيات القياسية لكل ثمانية نوكليوسدس الحمض النووي.
- كشف وتحديد جميع نوكليوسدس، وبخاصة تعديل سيتوسينيس، أنتجت في الخطوة 2، 4 باستخدام أسلوب LC-MS/MS والمنحنيات القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعديل الديناميكي ل 5mC في الحمض النووي من ديوكسيجيناسيس تيت-الأسرة تلعب أدواراً هامة في الأنظمة النسخي جينية. كثيرا ما يتم تحور ديوكسيجيناسي TET2 في الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة12. للتحقيق في دور إنزيم TET2 في التطور الطبيعي والمرض، ونحن قد المستنسخة مجالها حفازة نشطة الحد الأدنى دون أي علامة تقارب إلى ناقل pDEST1422. وأنتج ديوكسيجيناسي TET2 معلم ∼5 في المائة من مجموع البروتين للذوبان بتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي في البكتيريا BL21 كولاي الخلايا (DE3). منذ المجال الحفاز من TET2 نقطة isoelectric عالية نسبيا (∼7.49)، بالمقارنة مع معظم السكان الأصليين كولاي البروتينات24،،من2526، عملية تنقية كفاءة الاستفادة من الأيونات الموجبة وقد وضعت تبادل اللوني. أثمر هذا التنقية > 90% إنزيم TET2 نقية في خطوة واحدة (الشكل 1).
بغية فصل وتحديد كمية مشتقات ديوكسيسيتيدينيس مختلفة وأخرى أربع قواعد الحمض النووي الطبيعية بعد أن رد الفعل الأنزيمي TET2، كان الأمثل مقايسة LC-MS/MS-تعتمد حساسة. كروماتوغرافيا سائلة تستخدم عكس مرحلة C18 أعمدة. ورسمت المنحنيات القياسية باستخدام تخفيف المسلسل من خليط يحتوي على جميع نوكليوسدس (الشكل 2). التدرج الذي سيتم استخدامه اللوني السائل، هو موضح في الإجراء التجريبي، كان قادراً على حل جميع نوكليوسدس ثمانية (الشكل 3). الاحتفاظ LC مرات (تيآر) لجميع نوكليوسدس ثمانية موصوفة في الجدول 3. ونحن كذلك الأمثل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد لكل والد أيون نوكليوزيد (Q1)، أيون المنتج الأكثر كثافة (Q3) بتحديد إمكانيات ديكلوستيرينج (DP) وإمكانات مدخل (الجيش الشعبي)، ومدخل الخلية التصادم المحتملة (CEP)، الطاقة الاصطدام (CE) والحد من الكشف عن (اللد)، والحد الأدنى للقياس الكمي (لوك) (الجدول 3). وأخيراً، وضعت طريقة LC-MS/MS يمكن فصل وتحديد مقدار أربع قواعد الحمض النووي العادي (A و T، ز وج)، فضلا عن أربع قواعد السيتوزين المعدلة (5-ميثيل، 5-هيدروكسيميثيل، 5-فورميل، و 5-الكربوكسيل) (الشكل 3).
وكان يحدد نشاط مميز TET2 ديوكسيجيناسي باستخدام دسدنا 25-مير التي تحتوي على 5mC واحدة في جزيرة البد في كل حبلا الحمض النووي (الجدول 2). وبعد TET2 التفاعلات الانزيمية، تنقية النوكليوتيد الحمض النووي وتحويلها إلى نوكليوسدس. ثم تعرض هذه نوكليوسدس للمقايسة LC-MS/MS. في ردود الفعل دون الإنزيم TET2 (المراقبة السلبية)، لوحظت قمم دا dT والمديرية العامة، العاصمة، و 5mdC فقط. بيد لوحظت في رد فعل الرقابة الإيجابية، التي تضمنت ديوكسيجيناسي TET2، اثنين من قمم جديدة المقابلة ل d5hmC و d5fC. ونحن لم تكن قادرة على الكشف عن تشكيل نوكليوزيد d5caC ربما بسبب مستويات الكشف عن الفقراء (الشكل 2). تبين هذه النتائج أن ديوكسيجيناسي TET2 معلم تنقيتها في هذا الإجراء حفازة نشطة ويمكن استخدامها لتوصيف الإنزيم wt TET2 وبه طفرات السريرية.
الشكل 1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل المنقي ديوكسيجيناسي TET2 من BL21 كولاي الخلايا (DE3). لين أ يشير إلى علامة بينما لين ب يشير إلى تنقية البروتين TET2 باستخدام راتنج التبادل الأيوني سيفاروسي SP. الحجم الإجمالي ديوكسيجيناسي TET2 غير المميز كاتشين ∼54 كما هو مبين بالسهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. وكان المنحنيات القياسية رسم لأربعة طبيعية الحمض النووي نوكليوسدس ومشتقات السيتوزين مختلفة، ثم استخدمت كمياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. كروماتوغرافيا سائلة (أسفل) و MS/MS (أعلاه) الطريقة المستخدمة لفصل وتميز أربعة نوكليوسدس الحمض النووي الطبيعية ومشتقات السيتوزين مختلفة.
| اسم الدليل | تسلسل التمهيدي | |||
| التمهيدي إلى الأمام TET2 | --جججاكاجتتجتاكاااااجكاجكتكجاجاجاتاجاككاتجتكتجتكتكاتاتتتاتاج 5 '-3' | |||
| TET2 عكس التمهيدي | --جججاككاكتتجتاكاجااجكتججتكتكاجككاتاكتتتكاكاك 5 '-3' | |||
الجدول 1: تسلسل الحمض النووي اليغنوكليوتيد الإشعال المستخدمة للتضخيم PCR المجال الحفاز ليس تمييز ديوكسيجيناسي TET2 البشرية.
| اسم الدليل | تسلسل التمهيدي |
| معنى حبلا | 5-أجكككجكجككج/iMe-dC/جككجتكجاجكج-3 ' |
| العقاقير حبلا | 5-ككجكتكجاككجكج/iMe-dC/جكجكججكت-3 ' |
الجدول 2: تسلسل الشعور والإحساس بمكافحة 25-مير دسدنا اليغنوكليوتيد المستخدمة كركيزة TET2 في المختبر تفاعلات أكسدة.
| نوكليوسدس | Q1 | Q3 | تيآر (دقيقة) | موانئ دبي (V) | الجيش الشعبي (V) | المجلس الانتخابي المؤقت (V) | CE (V) | اللد (بمول) | لوك | R2 | |
| 2-ديوكسيادينوسيني | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0.06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2-ديوكسيثيميديني | 243.2 | بين 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2-ديوكسيجوانوسيني | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2-ديوكسيسيتيديني | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0.33 | 0.998 | |
| 5-الميثيل-2 '--ديوكسيسيتيديني | 242.2 | 126.1 | 9، 85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-هيدروكسيميثيل-2 '--ديوكسيسيتيديني | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-فورميل-2 '--ديوكسيسيتيديني | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-كاربوكسي-2 '--ديوكسيسيتيديني | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
الجدول 3: محسن LC-MS/MS المعلمات الأربعة نوكليوسدس الحمض النووي الطبيعية ومشتقات السيتوزين مختلفة تحت وضع أيون إيجابية. لكل والد أيون نوكليوزيد (Q1)، تم الكشف عن أيون المنتج الأكثر كثافة (Q3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطفرات في الجينات TET2 بعض التغييرات الوراثية المكتشفة الأكثر شيوعاً في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة. حتى الآن مئات من الطفرات TET2 المختلفة، التي تشمل هراء وتحول الإطار والطفرات مغلطه، قد حددت في12من المرضى. المرضى الذين يعانون من الطفرات TET2 إظهار مستويات منخفضة من 5hmC الجينوم في نخاع العظام مقارنة بتلك التي مع wt TET214. وقد لخص TET2 متحولة تدق في التجارب آثار هذه الطفرات على مستويات 5hmC في الخلايا ترانسفيكتيد14. وأظهرت النتائج من نماذج الماوس TET2-خروج المغلوب أن مستوى الإنزيم TET2 ارتباطاً عكسيا مع تطور الأورام الخبيثة المكونة للدم17،18،،من1920. دأبت، تشانغ وآخرون مؤخرا أظهرت أن الأسفل التنظيم من TET2 مستويات التعبير هو العلامات البيولوجية التنبؤية وتنبؤاتها محتملة في سرطان الدم النقوي الحاد سيتوجينيتيكالي العادي27.
على الرغم من تزايد الأدلة أن TET2 يلعب دوراً أساسيا في هيماتوبويسيس العادية وتحول النقوي، يظل توصيف البيوكيميائية wt والمسخ TET2 في مراحل بدائية بسبب الصعوبات المرتبطة بإنتاج TET2 النشطة وفي التحليل. معظم الدراسات قد أنتجت نظام باكولوفيروس المؤتلف TET2 أما باستخدام تستغرق وقتاً طويلاً في خلايا الحشرات14، أو كمن الجلوتاثيون S-ترانسفيراز تقارب العلامة في الخلايا البكتيرية التي يتطلب إزالة العلامة تقارب21.
في هذا الإجراء التجريبي، وصفت لنا استنساخ معلم البشرية TET2 ديوكسيجيناسي الحفاز المجال باستخدام تقنية خاصة بالموقع جزئ والتعبير عن كفاءة استخدام ناقل الوجهة (pDEST14) في كولاي. لأن نقطة isoelectric TET2 مميز مرتفع نسبيا (∼7.49) مقارنة مع معظم السكان الأصليين كولاي البروتينات، قمنا بتطوير عملية تنقية كفاءة استخدام كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة تسفر عن > 90 ٪ نقية تمييز TET2 إنزيم في خطوة واحدة.
توجد تحديات إضافية، وزيادة في التحديد الكمي لنشاط ديوكسيجيناسي TET2 wt والمسخ. لهذه التجارب، وقد اعتمدت معظم الدراسات على فحوصات المستندة إلى جسم مثل البقع دوت14،28، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا)29، و ما إلى ذلك نظراً لاستخدام هذه الاختبارات عموما جسم واحد فقط، مثلاً، 5hmC أو or5caC إف سي 5، للكشف عن تعديل 5mC في الركيزة الحمض النووي، وأنها لا توفر صورة كاملة عن رد فعل الحفاز قام isoforms تيت. لهذه الأسباب، برز المقايسة LC MS/MS-على أساس مقايسة فقط تحديد حجم التعديلات السيتوزين مختلفة. وفي هذا الصدد، قمنا بتطوير أسلوب لوني سائل رواية التي يمكن أن تفصل أربع قواعد الحمض النووي العادي (A و T، ز وج)، فضلا عن أربع قواعد السيتوزين المعدلة (5mC، 5hmC، ونادي 5 و 5caC).
كمياً نوكليوسدس ثمانية ردود الفعل TET2 حفزت، أننا قد يقترن باسلوبنا كروماتوغرافيا سائلة محسنة الكتلي جنبا إلى جنب. ثم استخدم هذا التحليل LC-MS/MS حساسة لتحديد نشاط إنزيم TET2 البشرية ليس تمييز المؤتلف. النهج المذكور هنا ستعزز إلى حد كبير في تقييم أنشطة ديوكسيجيناسي TET2 wt والمسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين لها أية مصالح مالية تعلن.
Acknowledgments
ومولت هذه البحوث "وزارة الدفاع الأمريكية" في شكل فكرة جائزة (W81XWH-13-1-0174)، وفقر الدم اللاتنسجي ومنحة من مؤسسة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ومنحة أومرب للمؤلف م. م. أشكر جايسوال هامور وبهار سوبهراديب لاستنساخ الأولية من TET2 في ناقلات pDEST14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
