Summary
Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.
Abstract
De epigenetische transcriptieregulatie gemedieerd door 5-methylcytosine (5mC) heeft een cruciale rol gespeeld in eukaryotische ontwikkeling. Demethylatie van deze epigenetische merken gebeurt door oxidatie van de sequentiële door tien-elf translocatie dioxygenases (TET1-3), gevolgd door de thymine-DNA glycosylase-afhankelijke base excision repair. Inactivering van het TET2 gen als gevolg van de genetische mutaties of door andere Epigenetische mechanismen wordt geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten met uiteenlopende kankers, vooral hematopoietische maligniteiten. Hier beschrijven we een efficiënte Macrostap zuivering van enzymatisch actieve niet-gelabelde menselijke TET2 dioxygenase met cation exchange chromatografie. Verder bieden we een benadering van de vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) die kan scheiden en kwantificeren van de vier normale DNA-basen (A, T, G en C), evenals de vier gewijzigde cytosine honken (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl en 5-carboxyl). Deze test kan worden gebruikt om te evalueren van de activiteiten van wild type en mutant TET2 dioxygenases.
Introduction
De C5-positie van cytosine honken binnen apr dinucleotides is de site (5mCpG) van de overheersende methylering in zoogdieren genomen1. Daarnaast een aantal recente studies hebben blootgelegd uitgebreide C5 cytosine methylering (5mC) in niet-CpG sites (5mCpH, waar H = A, T of C)2,3. 5mC wijziging dient als een transcriptionele demper op endogene retrotransposons en gene initiatiefnemers3,4,5. Methylation van DNA bij 5mC speelt ook een belangrijke rol in de inactivering van het X-chromosoom, gene inprenting, nucleaire herprogrammering en weefsel-specifieke gen expressie5,6,7. Methylering van cytosine op de C5-positie is uitgevoerd door DNA methyltransferases en mutaties in deze enzymen veroorzaken aanzienlijke developmental gebreken8. De verwijdering van 5mC merken worden geïnitieerd door TET1-3 5mC oxidasen9,10. Deze TET-familie dioxygenases converteren 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) door oxidatie van de opeenvolgende stappen11,12,13. Tot slot vervangt thymine-DNA glycosylase 5fC of 5caC naar ongewijzigde cytosine met behulp van de base excision repair traject11.
Het menselijk TET2 -gen werd geïdentificeerd als een vaak gemuteerde gen in uiteenlopende hematopoietische maligniteiten waaronder myelodysplastic syndromes (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferatieve gezwellen ( MDS-MPN), en acute myeloïde leukemie (AML) afkomstig van MDS en MDS-MPN16. De niveaus van 5hmC wijziging in het beenmerg DNA zijn lager bij patiënten met TET2 mutaties vergeleken met degenen met wild-type (wt)-TET214. Een aantal groepen hebben ontwikkeld TET2-knock-out Muismodellen te verhelderen van haar rol in de normale Haematopoiese en myeloïde transformatie17,18,19,20. Deze muizen met mutaties in het gen TET2 waren aanvankelijk normale en levensvatbaar, maar uiteenlopende hematopoietische maligniteiten gemanifesteerd als ze ouder die hun vroege dood veroorzaakt. Deze studies toonden de belangrijke rollen gespeeld door de wt-TET2 bij normale hematopoietische differentiatie. In deze Muismodellen heterozygoot hematopoietische stamcellen (TET2+/- HSCs) en het homozygoot TET2- / - had HSCs een concurrentievoordeel ten opzichte van homozygoot wt-TET2 HSCs in de hematopoietische lineages repopulatie als beide TET2+/- en TET2- / - HSCs ontwikkeld divers hematopoietische maligniteiten17,18. Deze studies tonen aan dat haploinsufficiency van TET2 dioxygenase de ontwikkeling van HSCs verandert en resulteert in de hematopoietische maligniteiten.
Gelijkaardig aan muizen met mutaties in het gen TET2, meeste leukemie-patiënten manifesteren haploinsufficiency van TET2 dioxygenase activiteit. Deze meestal heterozygoot somatische mutaties omvatten frame-shift en nonsense mutaties verspreid over het TET2 gen lichaam terwijl missense mutaties die het meeste geclusterd in het dioxygenase domein12. Tot op heden wordt weinig karakterisering van de wt - en mutant-TET2 gemeld in de literatuur voornamelijk te wijten aan problemen met de productie van TET2 dioxygenase en haar assay-21. Wij rapporteren hier een eenvoudige stap voor stap zuivering van de inheemse TET2 dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie. Een kwantitatieve bepaling van de LC-MS/MS was verder geoptimaliseerd en gebruikt voor het meten van de enzymatische activiteit van inheemse TET2 dioxygenase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klonen en zuivering van niet-gecodeerde menselijke TET2 Dioxygenase
- Het klonen van menselijke TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) in de pDEST14 bestemming vector met behulp van de site-specifieke recombinatie techniek als eerder beschreven22.
Opmerking: De vorige studies hebben aangetoond dat de C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) domein de minimale catalytically actieve domein21,23 is. Om uit te drukken de ongecodeerde TET2 dioxygenase domein met behulp van het pDONR221 vector, werden Shine Dalgarno en Kozak sequenties verwerkt in de voorwaartse primer tijdens PCR (tabel 1). - Voor bacteriële transformatie, voeg 1 µL van recombinante pDEST14 expressie vector met niet-gecodeerde menselijke TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) naar 100 µL van chemisch bevoegde E. coli BL21 (DE3) cellen in een tube van 1,7 mL. Houd het mengsel op het ijs gedurende ten minste 15 minuten gevolgd door warmte schok bij 42 ° C gedurende 30 s in een waterbad.
- Houd onmiddellijk na de schok van de warmte, de cellen terug op het ijs gedurende ten minste 2 min. Daarop 250 µL van super optimale bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (S.O.C media) aan cellen toevoegen. Incubeer de bacteriecellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een shaker.
- Na incubatie, spin down de cellen door centrifugeren van de buis bij 9000 x g gedurende 1 min. Discard 70% supernatant door pipetteren en ontbinden van de pellet in links over media.
- Verspreid de celsuspensie op een Luria Bouillon (LB) agarplaat met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 37 ° C.
- Selecteer één geïsoleerde kolonie en het in LB-ampicilline media in een tube van 50 mL 10 mL beënten. Incubeer de buis bij 37 ° C in een shaker voor overnachting. Daarop kunt 100 µL van de cultuur van de tube 50 mL 100 mL LB-ampicilline media beënten. Incubeer de kolf bij 37 ° C op een shaker bij 180 t/min en gebruik het als primaire cultuur. Volgende dag gebruik 6 mL elke primaire cultuur om te enten 15 kolven, elk met 600 mL LB-ampicilline-media. Nu, incubeer 15 kolven bij 37 ° C op een shaker bij 180 t/min.
Opmerking: Voor het verifiëren van getransformeerde klonen, uitvoeren DNA sequencing of beperking spijsvertering met de geïsoleerde plasmide DNA. - Om te controleren de dichtheid van bacteriële cultuur, meten de OD600 met een spectrofotometer. Nadat de cultuur een bevolkingsdichtheid van 0,8 OD600 bereikt, de uitdrukking van TET2 eiwit met 300 µL van 1 M (eindconcentratie van 0,5 mM in 600 mL) IPTG in elke kolf induceren en verder groeien de cultuur voor 16 h bij 17 ° C.
- Na 16 h, wordt de bacteriecultuur overbrengen door centrifuge flessen. Centrifugeer de bacteriecultuur uiting van het TET2-enzym bij 5,250 x g gedurende 45 min. Gebruik de bacteriële pellet voor zuivering van de TET2.
Opmerking: Alle resterende eiwit zuivering stappen op het ijs of bij 4 ° C. uitvoeren - Resuspendeer de pellet van bacteriële in 100 mL 50 mM MES (2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur) buffer, pH 6 en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 × 30 s op kracht 20 met 60 s koeling intervallen.
- Draai de lysate bij 5,250 x g gedurende 45 min. verzamelen het supernatant met het oplosbare TET2 enzym en passeren van 0,45 µm filters vóór het laden op een FPLC systeem.
Opmerking: In deze experimenten, het enzym van de TET2 was zeer stabiel, maar indien nodig een protease inhibitor cocktail met 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), en 0,5 mM 1,10 -o- phenanthroline kunnen worden toegevoegd aan de cel lysate aan voorkomen dat de afbraak van TET2 enzym. Vermijd het gebruik van EDTA of EGTA in de Inhibitor van de omwenteling cocktail als dit met de volgende catie-uitwisseling-chromatografie interfereren kunnen. - Pack 30 mL van een sterke cation exchange hars in een kolom van de FPLC. Equilibreer de kolom met 10 kolomvolumina van was buffer (50 mM MES buffer, pH 6) tegen het tarief van de constante stroom van 0.3 mL/min met behulp van een FPLC systeem.
- Laden de geklaarde lysate op de kolom vooraf zijn geëquilibreerd en wassen met ∼10 kolomvolumina van was buffer totdat de stroom door duidelijk wordt.
- Elueer TET2 met behulp van een 0-100% helling uit de buffer wassen aan de elutie buffer (50 mM MES buffer, pH 6, 1 M NaCl) in 15 kolomvolumina gevolgd door bedrijf aan 100% elutie buffer voor twee-kolomvolumina.
Opmerking: Het verzamelen van monsters (van elke 100 µL) van cel lysate vóór en na kolom laden samen met de elutie van alle fracties en analyseren op 10% oplossing van SDS-pagina. - Zwembad de breuken die TET2 eiwitten bevatten, droge bevriezen, ontbinden enzym pallet in 10 mL water en winkel bij-80 ° C.
2. 5mC oxidatie door TET2 Dioxygenase
- Voer alle demethylatie reacties in drievoud met 3 µg substraat (25-mer dubbele gestrande DNA, tabel 2).
- Toevoegen van 100 µg van gezuiverde TET2 enzym in 50 µL van de totale reactie buffer met 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), en 2 mM ascorbaat en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h21.
- Doven TET2 gekatalyseerd oxidatiereacties met 5 µL van 500 mM EDTA.
- Na het blussen van TET2 reacties, voorbereiden op monsters LC-MS/MS analyse door het scheiden van het DNA van TET2 reactiemengsel oligo zuivering kolommen gebruiken.
- Voeg 100 µL van oligo bindende buffer aan 55 µL van gehard reactie.
- Voeg daarop 400 µL ethanol 100% toe aan het mengsel. Laat dit mengsel door een oligo bindende kolom.
- Wassen van afhankelijke DNA met 750 µL was buffer en elueer in 20 µL water.
- De geïsoleerde DNA met 2 eenheden van DNase verteren I en 60 eenheden van S1 nuclease bij 37 ° C gedurende 12 h tot individuele nucleoside-monophosphates.
- Na vertering, 2 units van kalf intestinale alkalisch fosfatase (CIAP) toevoegen in de monsters en incubeer gedurende toevoeging 12u bij 37 ° C om de terminal fosfaat groepen van nucleoside-monophosphates nucleosiden verkrijgen.
- Kwantificeren van alle nucleosiden, vooral gemodificeerde cytosines, met behulp van de onderstaande LC-MS/MS methode.
3. kwantitatieve LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling
- Bereiden van 100 µM-stockoplossing van alle gewijzigde cytosine nucleosiden [5-methyl-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine (5hmdC) 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) en 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] en normale DNA bases (adenine, thymine, cytosine, en guanine) in HPLC-grade water voor de ontwikkeling van de LC-MS/MS methode.
- Optimaliseren van nucleoside-afhankelijke MS/MS parameters door infusie van stamoplossingen, één filter tegelijk, in massaspectrometer op een debiet van 10 µL/min bij EMS scanmodus. Optimaliseren na parameters: Declustering potentiële (DP), ingang potentiële (EP), botsing cel ingang potentiële (CEP), botsing energie (CE) en botsing cel Exit potentiële (CXP) voor elk DNA nucleoside met kwantitatieve optimalisatie geautomatiseerde functie van de software.
- Optimaliseren bron-afhankelijke MS/MS parameters door injecterend 10 µL van stockoplossing met behulp van een verloop met 25% oplosmiddel B op een debiet van 0.3 mL/min waar oplosmiddel A is 10 mM ammoniumacetaat (pH 4.0) en oplosmiddel B is 20% acetonitril met 10 mM ammoniumacetaat (pH 4.0). Optimaliseren na parameters: gordijn Gas (CUR): 10-50, temperatuur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally geactiveerd dissociatie (CAD): laag-Medium-High, Ion spuiten spanning (IS): 4000-5500 voor elke DNA nucleoside met behulp van de handleiding kwantitatieve optimalisatie functie van de software in de modus van de FIA (Flow injectie analyse).
- Uitvoeren om te scheiden van alle acht DNA nucleosiden, vloeibare chromatografie met behulp van de volgende verloop: 0% oplosmiddel B (0-2 min), 0-20% oplosmiddel B (2-5 min), 20-60% oplosmiddel B (5-9 min), 60-0% oplosmiddel B (9-10 min) en vervolgens equilibreer met oplosmiddel A gedurende 5 minuten op een debiet van 0.3 mL/min in een C18 kolom (deeltjesgrootte: 5 µm, porie-grootte: 120 Å).
- Met behulp van de optimale parameters voor MS/MS (stap 3.2 en 3.3) in combinatie met het bovengenoemde vloeistofchromatografie verloop (stap 3.4), bepalen de reactie lineariteit aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de ondergrens van de kwantificering (Ondergrens) met behulp van een twee-voudige seriële verdunning van een 100 µM standaard mengsel dat bevat alle acht nucleosiden. Standaard curven voor alle acht DNA nucleosiden tekenen.
- Detecteren en kwantificeren van alle nucleosiden, vooral gemodificeerde cytosines, geproduceerd in stap 2.4 met behulp van de LC-MS/MS methode en standaard curven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dynamische wijziging van 5mC in DNA door TET-familie dioxygenases speelt belangrijke rol in de epigenetische transcriptionele verordeningen. TET2 dioxygenase is vaak gemuteerd in uiteenlopende hematopoietische maligniteiten12. Om te onderzoeken de rol van het TET2-enzym bij normale ontwikkeling en ziekte, hebben we het minimale catalytically actieve domein zonder enige affiniteit-tag in de pDEST14 vector22gekloond. De niet-gecodeerde TET2 dioxygenase werd geproduceerd op ∼5% van de totale oplosbare proteïne door SDS-pagina analyse in bacteriële BL21 E. coli (DE3) cellen. Aangezien de katalytische domein van TET2 een relatief hoge elektrisch punt (∼7.49) heeft, in vergelijking met de meeste inheemse E. coli eiwitten24,25,26, een efficiënte zuiveringsproces met behulp van een catie uitwisseling chromatografie werd ontwikkeld. Deze reiniging leverde > 90% zuivere TET2 enzym in een enkele stap (Figuur 1).
Om te scheiden en te kwantificeren van de verschillende deoxycytidines derivaten en andere vier natuurlijke DNA-basen na de enzymatische reactie van TET2, is een gevoelige LC-MS/MS-based test geoptimaliseerd. De vloeibare chromatografie gebruikt een reversed-phase C18 kolommen. Standaard krommen werden getekend met seriële verdunningen van een mengsel dat bevat alle nucleosiden (Figuur 2). Het verloop gebruikt voor vloeistofchromatografie, beschreven in de experimentele procedure, was in staat om op te lossen alle acht nucleosiden (Figuur 3). Het aanhouden van de LC tijden (tr) voor alle acht nucleosiden staan beschreven in tabel 3. We verder de MS detectie van elke ouder ion nucleoside (Q1), de meest intense product ion (Q3) geoptimaliseerd door het bepalen van hun declustering potentieel (DP), ingang potentieel (EP), botsing cel entree potentiële (CEP), botsing energie (CE), een limiet van detectie (LOD) en lagere bepaalbaarheidsgrens (Ondergrens) (tabel 3). Tot slot een LC-MS/MS methode ontwikkeld die kunnen scheiden en kwantificeren van de vier normale DNA-basen (A, T, G en C), evenals de vier gewijzigde cytosine honken (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl en 5-carboxyl) (Figuur 3).
De activiteiten van niet-gecodeerde TET2 dioxygenase werd bepaald met behulp van een 25-mer dsDNA met één 5mC in een CpG eiland in elke bundel van DNA (tabel 2). Na TET2 enzymatische reacties, waren de DNA oligonucleotides gezuiverd en omgezet in nucleosiden. Vervolgens werden deze nucleosiden onderworpen aan LC-MS/MS assay. In de reacties zonder het TET2 enzym (negatieve controle), de enige dA, dT, dG, dC en 5mdC pieken werden waargenomen. Echter in de reactie van de positieve controle, die de TET2 dioxygenase, werden twee nieuwe pieken overeenkomt met d5hmC en d5fC waargenomen. We waren niet kundig voor speurder van de vorming van d5caC nucleoside mogelijk te wijten aan de slechte opsporing-niveaus (Figuur 2). Deze resultaten tonen aan dat de niet-gecodeerde TET2 dioxygenase gezuiverd in deze procedure catalytically actief is en kan worden gebruikt voor het karakteriseren van het enzym wt-TET2 en de klinische mutanten.
Figuur 1. SDS-pagina analyse van gezuiverde TET2 dioxygenase van E. coli BL21 (DE3) cellen. Lane A geeft aan marker terwijl lane B geeft aan TET2 eiwit gezuiverd met behulp van SP sepharose ionenwisseling hars. De totale grootte van de niet-gecodeerde TET2 dioxygenase is ∼54 kDa zoals aangegeven door de pijl. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Standaard curven was loting voor vier natuurlijke DNA nucleosiden en verschillende cytosine derivaten, die vervolgens werden gebruikt voor hun kwantificering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Vloeistofchromatografie (onder) en MS/MS (boven) methode gebruikt voor het scheiden en karakteriseren van vier natuurlijke DNA nucleosiden en verschillende cytosine derivaten.
| De naam van de primer | Primer volgorde | |||
| TET2 vooruit primer | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Omgekeerde Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tabel 1: Opeenvolging van DNA oligonucleotide inleidingen voor PCR versterking van het katalytische domein van niet-gecodeerde menselijke TET2 dioxygenase gebruikt.
| De naam van de primer | Primer volgorde |
| Zin Strand | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Antisense Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tabel 2: Volgorde van het gevoel en anti-gevoel 25-mer dsDNA oligonucleotide gebruikt als een TET2 substraat voor in vitro oxidatiereacties.
| Nucleosiden | Q1 | Q3 | tr (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | ONDERGRENS | R-2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252,2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243,2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5,94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268,2 | 152,1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7,8 | 25,74 | 0.999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-methyl-2'-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258,2 | 142,1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140,1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0,66 | 0.998 | |
| 5-carboxy-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156,1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tabel 3: Geoptimaliseerde LC-MS/MS parameters van vier natuurlijke DNA nucleosiden en verschillende cytosine derivaten onder positief ion modus. Voor elke ouder ion nucleoside (Q1), werd de meest intense product ion (Q3) ontdekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutaties in TET2 gen zijn enkele van de meest frequent aangetroffen genetische veranderingen bij patiënten met uiteenlopende hematopoietische maligniteiten. Tot nu toe honderden van verschillende TET2 mutaties, waaronder onzin, frame-shift en missense mutaties, zijn geïdentificeerd in patiënten12. Patiënten met TET2 mutaties weergeven lage niveaus van genomische 5hmC in het beenmerg vergeleken met degenen met wt-TET214. Mutant TET2 knock-in experimenten hebben de effecten van deze mutaties op 5hmC niveaus in transfected cellen14gerecapituleerd. Resultaten uit TET2-knock-out Muismodellen aangetoond dat niveau van TET2 enzym omgekeerd gecorreleerd met de progressie van hematopoietische maligniteiten17,18,19,20. Consequent, Zhang et al. onlangs aangetoond dat down-regulatie van TET2 expressie niveaus is een mogelijke prognostische en voorspellende biomarker in cytogenetically normale acute myeloïde leukemie27.
Ondanks het steeds meer aanwijzingen dat TET2 een fundamentele rol bij normale Haematopoiese en myeloïde transformatie speelt, biochemische karakterisering van wt- en mutant TET2 blijven rudimentair stadium als gevolg van moeilijkheden in verband met de productie van actieve TET2 en haar kwantitatieve analyse. De meeste studies hebben recombinant TET2 ofwel met behulp van tijdrovende baculovirus systeem in insect cellen14, of als een glutathione S-transferase affiniteit tag in bacteriële cellen die verwijdering van affiniteit label21 vereistgeproduceerd.
In deze experimentele procedure beschreven we het klonen van niet-gecodeerde menselijke TET2 dioxygenase katalytische domein met behulp van een site-specifieke recombinatie techniek en zijn efficiënte uitdrukking bestemming vector (pDEST14) met E. coli. Omdat het elektrisch punt van niet-gecodeerde TET2 relatief hoog is (∼7.49) in vergelijking met meest inheemse E. coli eiwitten, ontwikkelden we een efficiënte zuiveringsproces met behulp van een cation exchange chromatografie opbrengst > 90% zuivere ongecodeerde TET2 enzym in een enkele stap.
Verdere, extra uitdagingen bestaan in de kwantificering van wt- en mutant TET2 dioxygenase activiteit. Voor deze experimenten, meeste studies hebben vertrouwd op antilichaam gebaseerde testen zoals dot-blots14,28, enzym-verbonden immunosorbent testen (ELISA)29, etc. omdat deze tests in het algemeen slechts één antilichaam, gebruiken bijvoorbeeld, 5hmC of 5fC or5caC, voor de detectie van 5mC wijziging in substraat DNA, zij bieden niet een volledig beeld van de katalytische reactie door TET isoforms uitgevoerd. Om deze redenen heeft de LC-MS/MS-gebaseerde bepaling ontpopt als de enige bepaling te kwantificeren van de verschillende cytosine wijzigingen. In dit verband hebben we een nieuwe vloeistofchromatografie-methode die van de vier normale DNA-basen (A, T, G en C), evenals de vier gewijzigde cytosine basen (5mC, 5hmC, 5 fC en 5caC scheiden kan) ontwikkeld.
Om te kwantificeren van de acht nucleosiden uit TET2 gekatalyseerde reacties, hebben we onze verbeterde vloeistofchromatografie-methode in combinatie met de Spectrometrie van de massa van de tandem. Deze gevoelige LC-MS/MS assay werd vervolgens gebruikt om te bepalen van de activiteit van recombinante niet-gelabelde menselijke TET2 enzym. De hier beschreven aanpak zal sterk verbeteren van de evaluatie van wt- en mutant TET2 dioxygenase activiteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangen te verklaren.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van defensie in de vorm van een idee Award (W81XWH-13-1-0174), Aplastic bloedarmoede & MDS Stichting Grant, en toekenning van de UMRB aan M.M. Authors Mohit Jaiswal en Subhradeep Bhar bedanken voor het eerste klonen van TET2 in pDEST14 vector.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
