Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en effektiv enda steg rening av aktiva otaggade människa tio-elva translokation-2 (TET2) 5-metylcytosin dioxygenas använder jonbyteskromatografi- och dess analys med hjälp av en flytande kromatografi-tandem mass masspektrometri (LC-MS/MS)-baserat tillvägagångssätt.
Abstract
Epigenetiska transkription förordningen medieras av 5-metylcytosin (5mC) har spelat en avgörande roll i eukaryota utveckling. Demetylering av märkena epigenetiska åstadkoms genom sekventiell oxidation av tio-elva translokation dioxygenases (TET1-3), följt av tymin-DNA glykosylas-beroende base excision reparation. Inaktivering av TET2-genen på grund av genetiska mutationer eller genom andra epigenetiska mekanismer är associerade med en dålig prognos hos patienter med olika cancerformer, särskilt hematopoetiska maligniteter. Här beskriver vi en effektiv enda steg rening av enzymatiskt aktiva otaggade mänskliga TET2-dioxygenas med katjonbytare kromatografi. Vi tillhandahåller ytterligare en liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) tillvägagångssätt som kan separera och kvantifiera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5-metyl, 5-hydroxymetyl, 5-formyl, och en 5-karboxylgrupp). Denna analys kan användas för att utvärdera aktiviteten av vildtyp och mutant TET2 dioxygenases.
Introduction
Cytosin baser inom CpG dinucleotides C5 position är den dominerande metylering webbplatsen (5mCpG) i däggdjur genomen1. Dessutom ett antal nyligen genomförda studier har avslöjat omfattande C5 cytosin metylering (5mC) i icke-CpG platser (5mCpH, där H = A, T, eller C)2,3. 5mC modifiering fungerar som transkriptionell ljuddämpare på endogena retrotransposons och gen promotorer3,4,5. DNA-metylering på 5mC också spelar viktiga roller i X-kromosomen inaktivering, gen imprinting, nukleära omprogrammering och vävnadsspecifika gen uttryck5,6,7. Metylering av cytosin vid C5 position utförs av DNA-metyltransferaser och mutationer i dessa enzymer orsaka betydande defekter8. Avlägsnande av 5mC märken initieras av TET1-3 5mC oxidases9,10. Dessa TET-familjen dioxygenases konvertera 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) av sekventiell oxidation steg11,12,13. Slutligen, tymin-DNA glykosylas ersätter 5fC eller 5caC till omodifierade cytosin med base excision repair väg11.
Den mänskliga TET2 -genen identifierades som en ofta muterad gen i olika hematopoietiska maligniteter inklusive myelodysplastiskt syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferativa neoplasmer ( MDS-MPN), och akut myeloisk leukemi (AML) med ursprung från MDS och MDS-MPN16. Nivåerna av 5hmC ändring i benmärgen DNA är lägre hos patienter med TET2 mutationer jämfört med dem med vildtyp (wt)-TET214. Ett antal grupper har utvecklat TET2-knockout musmodeller för att belysa dess roll i normal blodbildning och myeloisk omvandling17,18,19,20. Dessa möss med mutationer i genen TET2 var initialt normal och lönsamt, men yttrar sig olika hematopoietiska maligniteter som de äldre orsakar deras tidiga död. Dessa studier visade de viktiga roller i wt-TET2 normala hematopoetiska differentiering. I dessa musmodeller, heterozygot hematopoetiska stamceller (TET2+/- Förenta) och homozygot TET2- / - hade Förenta en konkurrensfördel gentemot homozygot wt-TET2 Förenta i återinplantering hematopoetiska härstamningar som båda TET2+/- och TET2- / - Förenta utvecklat olika hematopoietiska maligniteter17,18. Dessa studier visar att haploinsufficiency av TET2 dioxygenas förändrar utvecklingen av Förenta och resulterar i hematopoetiska maligniteter.
Liknar möss med mutationer i genen TET2, de flesta leukemipatienter manifestera haploinsufficiency TET2 dioxygenas verksamhet. Dessa mestadels heterozygot somatiska mutationer inkluderar ram-Skift och nonsens mutationer spridda över hela TET2 gen kroppen medan missense mutationer som är mest klustrade i dioxygenas domän12. Hittills har rapporteras lite karakterisering av wt - och mutant-TET2 i litteraturen främst på grund av svårigheter med produktionen av TET2 dioxygenas och dess analys21. Vi rapporterar här, en enkel steg rening av infödda TET2-dioxygenas använder jonbyteskromatografi. Ytterligare, en kvantitativ LC-MS/MS-analys var optimerad och används för att mäta den enzymatiska aktiviteten av infödda TET2-dioxygenas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning och rening av otaggade mänskliga TET2 dioxygenas
- Klona mänskliga TET2 dioxygenas (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) i den pDEST14 destination vektor med platsspecifika rekombination teknik som tidigare beskrivits22.
Obs: Tidigare studier har visat att C-terminal TET2 dioxygenas (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domänen är den minimala catalytically aktiv domän21,23. För att uttrycka otaggade TET2 dioxygenas domänen med pDONR221 vector, införlivades Shine Dalgarno och Kozak sekvenser framåt primer under PCR (tabell 1). - För bakteriell omvandling, tillsätt 1 µL av rekombinant pDEST14 uttryck vektor som innehåller otaggade mänskliga TET2 dioxygenas (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) till 100 µL av kemiskt behöriga E. coli BL21 (DE3) celler i en 1,7 mL tub. Hålla blandningen på is i minst 15 minuter följt av värme chock vid 42 ° C i 30 s i ett vattenbad.
- Omedelbart efter värme chock, hålla cellerna tillbaka på isen i minst 2 min. Efter detta, tillsätt 250 µL av super optimal buljong med catabolite förtryck (S.O.C media) till celler. Inkubera bakteriecellerna för 1 h vid 37 ° C i en shaker.
- Efter inkubation, snurra ner cellerna genom centrifugering röret vid 9 000 x g i 1 min. kasta 70% supernatanten genom pipettering och lös pelleten i vänster över massmedia.
- Sprida cellsuspension på en agarplatta för Luria-buljong (LB) innehållande 100 µg/mL ampicillin. Inkubera plattan för 16 timmar vid 37 ° C.
- Välj en isolerad koloni och Inokulera det till 10 mL LB-ampicillin media i en 50 mL tub. Inkubera röret vid 37 ° C i en shaker för övernattning. Efter detta använder du 100 µL av kultur från 50 mL röret för att Inokulera 100 mL LB-ampicillin media. Inkubera kolven vid 37 ° C i en shaker vid 180 rpm och använda den som primära kultur. Nästa dag, Använd 6 mL varje primär kultur för att Inokulera 15 kolvar, varje innehållande 600 mL LB-ampicillin-media. Nu, inkubera 15 kolvar vid 37 ° C i en shaker vid 180 rpm.
Obs: För att kontrollera transformerad kloner, utföra DNA sekvensering eller begränsning matsmältningen med isolerade plasmiden DNA. - För att kontrollera tätheten av bakterieodling, mäta dess OD600 med en spektrofotometer. Efter kulturen når en täthet 0.8 på OD600, inducerar uttrycket TET2 protein med 300 µL av 1 M (slutliga koncentration av 0,5 mM i 600 mL) IPTG i varje kolv och ytterligare växa kulturen för 16 h på 17 ° C.
- Efter 16 h, överföra den bakteriella kulturen till centrifug flaskor. Centrifugera den bakteriekultur som uttrycker enzymet TET2 vid 5,250 x g i 45 min. Använd den bakteriella pelleten för TET2 rening.
Obs: Utför alla återstående protein reningssteg antingen på isen eller vid 4 ° C. - Återsuspendera bakteriell pelleten i 100 mL 50 mM MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra) buffert, pH 6 och Sonikera för 5 × 30 s vid effekt 20 med 60 s kyla intervall.
- Snurra den lysate vid 5,250 x g i 45 min. samla supernatanten innehållande lösliga TET2 enzymet och passera genom 0,45 µm filter före lastning på en FPLC system.
Obs: I dessa experiment, enzymet TET2 var mycket stabil, men om det behövs en proteas hämmare cocktail innehållande 1 mM benzamidinen-HCl, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 0,5 mM 1,10 -o- phenanthroline kan läggas till cell lysate till förhindra nedbrytning av TET2 enzym. Undvik att använda EDTA eller EGTA i den cocktail hämmaren eftersom dessa kan störa följande katjon-exchange kromatografi. - 30 mL förpackning med en stark katjonbytarharts i en FPLC kolumn. Jämvikta kolonnen med 10 bed volymer av tvättbuffert (50 mM MES buffert, pH 6) vid en konstant flödeshastighet på 0,3 mL/min FPLC system med.
- Ladda den klargj橬一j lysate på förhand skakad kolumn och tvätta med ∼10 säng volymer av tvättbuffert tills flödet genom blir tydlig.
- Eluera TET2 med en 0-100% lutning från tvättlösning till eluering bufferten (50 mM MES buffert, pH 6, 1 M NaCl) i 15 säng volymer följt av innehav vid 100% eluering buffert för två-säng volymer.
Obs: Samla prover (100 µL varje) i cell lysate före och efter kolumn laddar tillsammans med alla eluering fraktioner och analysera på 10% att lösa SDS-PAGE. - Pool fraktioner innehållande TET2 protein, frysa torr, lös enzym pall i 10 mL vatten och förvaras vid-80 ° C.
2. 5mC Oxidation av TET2 dioxygenas
- Utföra alla demetylering reaktioner i tre exemplar med 3 µg av substrat (25-mer dubbel stranded DNA, tabell 2).
- Lägga till 100 µg av renat TET2 enzym i 50 µL av total reaktion buffert innehållande 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarat), och 2 mM askorbat och inkubera vid 37 ° C i 1 h21.
- Släcka TET2 katalyseras oxidationsreaktioner med 5 µL av 500 mM EDTA.
- Efter kylning TET2 reaktioner, förbereda prover för LC-MS/MS-analys genom att separera DNA från TET2 reaktionsblandningen hjälp oligo rening kolumner.
- Tillsätt 100 µL av oligo bindande buffert till 55 µL av kylda reaktion.
- Efter detta, tillsätt 400 µL av 100% etanol till blandningen. Passera blandningen genom en oligo bindande kolonn.
- Tvätta bundna DNA med 750 µL tvättlösning och eluera i 20 µL vatten.
- Smälta isolerad DNA med 2 enheter av DNAS jag och 60 enheter av S1 nuclease vid 37 ° C i 12 h att producera individuella nukleosid-monophosphates.
- Efter matsmältningen, Lägg till 2 enheter av kalv intestinal alkaliskt fosfatas (CIAP) i proverna och inkubera i tillägg 12 timmar vid 37 ° C att ta bort de terminal fosfatgrupper från nukleosid-monophosphates att erhålla nukleosider.
- Kvantifiera alla nukleosider, särskilt modifierade cytosin, med LC-MS/MS-metoden beskrivs nedan.
3. kvantitativa LC-MS/MS-baserad analys utveckling
- Förbereda 100 µM stamlösningen av alla modifierade cytosin nukleosider [5-metyl-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymetyl-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) och 5-karboxi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] och normal DNA baser (adenin, tymin, cytosin och guanin) i HPLC-kvalitet vatten för utveckling av LC-MS/MS metod.
- Optimera nukleosid-beroende MS/MS parametrar genom infusion stamlösningar, en i taget, i masspektrometer med en flödeshastighet av 10 µL/min i EMS skanningsläge. Optimera följande parametrar: Declustering potentiella (DP), ingång potentiella (EP), kollision Cell ingången potentiella (CEP), kollision energi (CE) och kollision Cell Exit potentiella (CXP) för varje DNA nukleosid med automatiserade kvantitativa optimering funktion i programvaran.
- Optimera källa-beroende MS/MS parametrar genom att injicera 10 µL av stamlösning med en övertoning med 25% lösningsmedel B med en flödeshastighet på 0,3 mL/min där lösningsmedel A är 10 mM ammoniumacetat (pH 4.0) och lösningsmedel B är 20% acetonitril med 10 mM ammoniumacetat (pH 4.0). Optimera följande parametrar: gardin Gas (CUR): 10-50, temperatur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, rekombinationslinjer aktiveras Dissociation (CAD): låg-Medium-hög, Ion spraya spänning (IS): 4000-5500 för varje DNA nukleosid med manuell funktionen för kvantitativa optimering av programvaran i FIA (Flow Injection Analysis)-läge.
- För att separera alla åtta DNA nukleosider, utföra vätskekromatografi med följande övertoningen: 0% lösningsmedel B (0-2 min), 0-20% lösningsmedel B (2-5 min), 20-60% lösningsmedel B (5-9 min), 60-0% lösningsmedel B (9-10 min) och sedan jämvikta med lösningsmedel A för 5 min med en flödeshastighet av 0,3 mL/min en C18 kolonnen (partikelstorlek: 5 µm, Pore storlek: 120 Å).
- Med optimal MS/MS parametrar (steg 3.2 och 3.3) tillsammans med den ovannämnda vätskekromatografi övertoningen (steg 3,4), Bestäm svar linjäritet, detektionsgränsen (LOD) och nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) använder en tvåfaldiga seriella utspädning av en 100 µM standard blandning som innehåller alla åtta nukleosider. Rita standard kurvor för alla åtta DNA nukleosider.
- Identifiera och kvantifiera alla nukleosider, särskilt modifierade cytosin, produceras i steg 2,4 med hjälp av LC-MS/MS metod och standard kurvor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dynamisk ändring av 5mC i DNA av TET-familjen dioxygenases spelar viktiga roller i epigenetiska transkriptionell förordningar. TET2 dioxygenas är ofta muterad i olika hematopoietiska maligniteter12. För att undersöka betydelsen av enzymet TET2 i normala utveckling och sjukdom, har vi klonade dess minimala catalytically aktiv domän utan någon affinitet tagg in pDEST14 vector22. De otaggade TET2-dioxygenas producerades på ∼5% av det totala lösligt proteinet av SDS-PAGE analys i bakteriell E. coli BL21 (DE3) celler. Eftersom den katalytiska domänen av TET2 har en relativt hög isoelektrisk punkt (∼7.49), jämfört med de flesta inhemska E. coli proteiner24,25,26, en effektiv reningsprocess som utnyttjar en cation Exchange-kromatografi utvecklades. Denna rening gav > 90% ren TET2 enzym i ett enda steg (figur 1).
För att separera och kvantifiera olika deoxycytidines derivat och andra fyra naturliga DNA-baser efter TET2 enzymatiska reaktionen, var en känslig LC-MS/MS-baserad analys optimerad. Vätskekromatografi används en omvänd fas C18 kolumner. Standard kurvor drogs med seriespädningar av en blandning som innehåller alla nukleosider (figur 2). Toningen som används för vätskekromatografi, experimentell proceduren, kunde lösa alla åtta nukleosider (figur 3). LC lagring gånger (tr) för alla åtta nukleosider beskrivs i tabell 3. Vi ytterligare optimerat MS detektion av varje förälder ion nukleosid (Q1), den mest intensiva produkt ion (Q3) genom att fastställa deras declustering potential (DP), ingång potential (EP), kollision cell ingång potentiella (CEP), kollision energi (CE), gränsen för identifiering (LOD), och nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) (tabell 3). Slutligen en LC-MS/MS-metoden utvecklades som kan separera och kvantifiera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5-metyl, 5-hydroxymetyl, 5-formyl, och en 5-karboxylgrupp) (figur 3).
Aktiviteten av otaggade TET2 dioxygenas bestämdes med hjälp av en 25-mer dsDNA innehållande en 5mC i en CpG ö i varje DNA-strängen (tabell 2). Efter TET2 enzymatiska reaktioner, var DNA oligonukleotider renas och omvandlas till nukleosider. Sedan utsattes dessa nukleosider för LC-MS/MS-analys. I reaktionerna utan enzymet TET2 (negativ kontroll) observerades endast dA, dT, GD, dC och 5mdC toppar. Dock i den positiva kontrollreaktionen, som innehöll den TET2-dioxygenas, observerats två nya toppar motsvarande d5hmC och d5fC. Vi har inte kunnat upptäcka bildandet av d5caC nukleosid möjligen på grund av dess dåliga detektionsnivåer (figur 2). Dessa resultat visar att de otaggade TET2-dioxygenas renas i den här proceduren är katalytiskt aktiv och kan användas för att karaktärisera enzymet wt-TET2 och dess kliniska mutanter.
Figur 1. SDS-PAGE analys av renat TET2 dioxygenas från E. coli BL21 (DE3) celler. Lane A anger markör medan lane B indikerar TET2 protein renas med hjälp av SP sepharose jonbytare. Den totala storleken på de otaggade TET2-dioxygenas är ∼54 kDa som anges av pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Standard kurvor var dragningen för fyra naturliga DNA nukleosider och olika cytosin derivat, som användes sedan för deras kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Vätskekromatografi (nederst) och MS/MS (ovan) metod som används för att separera och karakterisera fyra naturliga DNA nukleosider och olika cytosin derivat.
| Primer namn | Primer sekvens | |||
| TET2 framåt primer | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Reverse Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tabell 1: Sekvens av DNA oligonukleotiden primers för PCR-amplifiering av den katalytiska domänen av otaggade mänskliga TET2-dioxygenas.
| Primer namn | Primer sekvens |
| Sense Strand | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Antisense Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tabell 2: Sekvens av den känsla och anti känsla 25-mer dsDNA oligonukleotiden används som TET2 substrat för in vitro- oxidationsreaktioner.
| Nukleosider | Q1 | Q3 | tr (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosin | 252,2 | 136,1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0,198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243,2 | 117,1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0,999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268,2 | 152,1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7,8 | 25.74 | 0,999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228,1 | 112,1 | 6,29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0,1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-metyl-2'-deoxycytidine | 242,2 | 126.1 | 9,85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0,1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymetyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142,1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140,1 | 10,92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0,66 | 0.998 | |
| 5-karboxi-2'-deoxycytidine | 272,2 | 156,1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12,87 | 0.993 | |
Tabell 3: Optimerad LC-MS/MS parametrar av fyra naturliga DNA nukleosider och olika cytosin derivat under positiv Jon läge. För varje förälder ion nukleosid (Q1) upptäcktes den mest intensiva produkt ion (Q3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutationer i TET2-genen är några av de vanligaste identifierade genetiska förändringarna hos patienter med varierande hematopoetiska maligniteter. Hittills hundratals olika TET2-mutationer, bland annat nonsens, ram-Skift och missense mutationer, har identifierats i patienter12. Patienter med TET2 mutationer uppvisar låga nivåer av genomisk 5hmC i benmärgen jämfört med dem med wt-TET214. Mutant TET2 inpressning experiment har återgetts effekterna av dessa mutationer på 5hmC nivåer i transfekterade celler14. Resultat från TET2-knockout musmodeller visade att nivån på TET2 enzymet omvänt korrelerad med progression av hematopoetiska maligniteter17,18,19,20. Konsekvent, Zhang et al. nyligen visat att down-förordning av TET2 uttrycksnivåerna är en potentiella prognostiska och Prediktiva biomarkörer i cytogenetiskt normala akut myeloisk leukemi27.
Trots växande bevis att TET2 spelar en grundläggande roll i normal blodbildning och myeloisk omvandling, biokemisk karakterisering av wt- och mutant TET2 fortfarande rudimentära skeden på grund av svårigheter i samband med produktion av aktiva TET2 och dess analys. De flesta studier har producerat rekombinant TET2 antingen med tidskrävande baculoviridae system i insekt celler14, eller som en glutation S-transferas affinitet tagg i bakterieceller som kräver avlägsnande av affinitet tag21.
I detta experimentella tillvägagångssätt beskrev vi kloning av otaggade mänskliga TET2-dioxygenas katalytiska domänen med hjälp av en platsspecifik rekombination teknik och dess effektiva uttryck med destination vektor (pDEST14) i E. coli. Eftersom den isoelektriska punkten av otaggade TET2 är relativt hög (∼7.49) jämfört med de flesta inhemska E. coli proteiner, vi utvecklat en effektiv reningsprocess som utnyttjar en katjonbytare kromatografi framställning > 90% ren omärkta TET2 enzym i ett enda steg.
Det finns ytterligare, ytterligare utmaningar i kvantifiering av wt- och mutant TET2 dioxygenas aktivitet. För dessa experiment, de flesta studier har förlitat sig på antikroppsbaserade analyser såsom dot-blotting14,28, glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analyser (ELISA)29, etc. eftersom dessa analyser använder i allmänhet endast en antikropp, t.ex. 5hmC eller 5fC or5caC, för detektion av 5mC ändring i substrat DNA, de ger inte en fullständig bild av katalytisk reaktion bärs av TET isoformer. Av dessa skäl har LC-MS/MS-baserad analysen framträtt som enda analysen att kvantifiera olika cytosin ändringar. I detta avseende har vi utvecklat en roman vätskekromatografi metod som kan separera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5mC, 5hmC, 5 fC och 5caC).
För att kvantifiera de åtta nukleosider från TET2 katalyseras reaktioner, har vi kopplat vår förbättrade vätskekromatografi metod med tandem mass spectrometry. Denna känsliga LC-MS/MS-analys var sedan utnyttjas för att bestämma aktiviteten hos rekombinant otaggade mänskliga TET2 enzym. Den metod som beskrivs här kommer att förbättra utvärderingen av wt- och mutant TET2 dioxygenas verksamhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av US-avdelningen av försvar i form av en Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi och MDS Foundation Grant, och UMRB bidrag till M.M. Authors tacka Mohit Jaiswal och Subhradeep Bhar för inledande kloning av TET2 i pDEST14 vektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
