Summary
Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.
Abstract
La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l'attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.
Introduction
La posizione di C5 della citosina basi all'interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi1. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell'inattivazione del cromosoma X, gene imprinting, riprogrammazione nucleare e genica tessuto-specifica espressione5,6,7. La metilazione della citosina nella posizione C5 è svolta da methyltransferases del DNA e le mutazioni in questi enzimi causano difetti inerenti allo sviluppo significativo8. La rimozione di segni di 5mC vengono avviate da TET1-3 5mC ossidasi9,10. Questi diossigenasi TET-famiglia convertono 5mC in 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) di ossidazione sequenziale passaggi11,12,13. Infine, timina-DNA glicosilasi sostituiscono 5fC o 5caC a citosina non modificato utilizzando riparazione bassa di asportazione percorso11.
Il gene TET2 umano è stato identificato come un gene mutato frequentemente in varie malignità ematopoietiche compreso myelodysplastic (MDS) le sindromi14,15,16, neoplasie mieloproliferative MDS ( MDS-MPN) e leucemia mieloide acuta (AML) provenienti da MDS e MDS-MPN16. I livelli di modificazione di 5hmC nel midollo osseo del DNA sono più bassi nei pazienti con mutazioni di TET2 rispetto a quelli con wild type (wt)-TET214. Alcuni gruppi hanno sviluppato modelli murini TET2 knock-out per delucidare il suo ruolo nell'ematopoiesi normale e trasformazione mieloide17,18,19,20. Questi topi con mutazioni del gene TET2 erano inizialmente normale e praticabile, ma manifesta varie malignità ematopoietiche come età causando la loro morte prematura. Questi studi hanno dimostrato il ruolo importante svolto da wt-TET2 nel differenziamento ematopoietico normale. In questi modelli di topo, cellule staminali ematopoietiche eterozigoti (TET2+ /- HSCs) e omozigotica TET2- / - HSCs aveva un vantaggio competitivo rispetto omozigoti wt-TET2 HSCs a ripopolare filiere emopoietiche come entrambi TET2+ /- e TET2- / - HSCs sviluppato varie malignità ematopoietiche17,18. Questi studi dimostrano che il haploinsufficiency di TET2 diossigenasi altera lo sviluppo di HSCs e risultati nelle malignità ematopoietiche.
Simili ai topi con mutazioni del gene TET2, maggior parte dei pazienti affetti da leucemia manifestano haploinsufficiency di TET2 diossigenasi attività. Queste mutazioni somatiche principalmente eterozigoti comprendono mutazioni frame-shift e sciocchezze dislocate in tutto il corpo del gene TET2 mentre mutazioni missenso che sono la maggior parte dei cluster nel dominio diossigenasi12. Fin qui, poco caratterizzazione di TET2 wt e mutante è segnalato nella letteratura principalmente a causa di difficoltà con la produzione di TET2 diossigenasi e relativi test21. Qui, segnaliamo un semplice singolo passaggio di purificazione del nativo dioxygenase di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico. Ulteriormente, un dosaggio quantitativo di LC-MS/MS è stato ottimizzato e utilizzato per misurare l'attività enzimatica di nativo TET2 diossigenasi.
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Protocol
1. clonazione e purificazione di TET2 umana senza tag diossigenasi
- Clone umano TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) nel vettore pDEST14 destinazione usando la tecnica di ricombinazione site-specific come descritto in precedenza22.
Nota: Gli studi precedenti hanno dimostrato che il dominio C-terminale TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) è il minimo cataliticamente attiva dominio21,23. Per poter esprimere senza tag TET2 diossigenasi dominio utilizzando il vettore pDONR221, sequenze di Shine Dalgarno e Kozak sono state incorporate nell'iniettore in avanti durante la PCR (tabella 1). - Per trasformazione batterica, aggiungere 1 µ l di vettore di espressione pDEST14 ricombinante contenente diossigenasi TET2 umana senza tag (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) a 100 µ l di chimicamente competente e. coli BL21 (DE3) cellule in un tubo di 1,7 mL. Mantenere la miscela sul ghiaccio per almeno 15 minuti, seguita da shock termico a 42 ° C per 30 s in un bagno d'acqua.
- Immediatamente dopo la scossa di calore, mantenere le cellule torna sul ghiaccio per minimo di 2 min. In seguito, aggiungere 250 µ l di brodo super ottima con la repressione dei cataboliti (S.O.C media) alle celle. Incubare le cellule batteriche per 1h a 37 ° C in un agitatore.
- Dopo l'incubazione, rotazione verso il basso le cellule mediante centrifugazione il tubo a 9.000 x g per 1 min. Discard 70% surnatante pipettando e dissolva la pallina a sinistra sopra la media.
- Diffondere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo (LB) di Luria contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.
- Selezionare una colonia isolata e inoculare esso in 10 mL di terreno LB-ampicillina in una provetta da 50 mL. Incubare la provetta a 37 ° C in un agitatore per il pernottamento. In seguito, è possibile utilizzare 100 µ l di cultura dal tubo 50 mL per inoculare 100 mL di terreno LB-ampicillina. Incubare la beuta a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min e usarlo come coltura primaria. Giorno successivo, utilizzare 6 mL ciascuno di coltura primaria per inoculare 15 boccette, ciascuna contenente media mL 600 LB-ampicillina. Ora, Incubare 15 matracci a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min.
Nota: Per la verifica di cloni trasformati, eseguire la digestione di restrizione o sequenziamento del DNA con il DNA del plasmide isolato. - Per controllare la densità di coltura batterica, misurare sua OD600 utilizzando uno spettrofotometro. Dopo la cultura raggiunge una densità di 0,8 a OD600, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 µ l di 1 M (concentrazione finale di 0,5 mM in 600 mL) IPTG in ciascuna beuta e crescere ulteriormente la cultura per 16 h a 17 ° C.
- Dopo le 16h, trasferire la coltura batterica a centrifuga bottiglie. Centrifugare la coltura batterica che esprimono l'enzima TET2 a 5.250 x g per 45 min. uso il pellet batterico per TET2 purificazione.
Nota: Eseguire tutti i passaggi di purificazione della proteina rimanenti sul ghiaccio o a 4 ° C. - Risospendere il pellet batterico in 100 mL di 50mm MES (2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido) tampone, pH 6 e Sonicare per 5 × 30 s a potenza 20 con intervalli di raffreddamento di 60 s.
- Spin il lisato a 5.250 x g per 45 min. raccolta il surnatante contenente l'enzima TET2 solubile e passa attraverso 0,45 µm filtri prima di caricarla su un sistema FPLC.
Nota: In questi esperimenti, l'enzima di TET2 era molto stabile, ma se necessario una proteasi inibitore cocktail contenenti 1 mM benzamidine-HCl, fenilmetilsolfonilfluoruro 1 mM (PMSF) e 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina può essere aggiunto alla cella lysata per prevenire il degrado di TET2 enzima. Evitare di utilizzare EDTA o EGTA nell'inibitore cocktail in quanto questi potrebbero interferire con la cromatografia di scambio cationico seguente. - Confezione da 30 mL di una resina a scambio cationico forte in una colonna FPLC. Equilibrare la colonna con 10 volumi di letto di tampone di lavaggio (tampone MES 50 mM, pH 6) presso il tasso di flusso costante di 0,3 mL/min utilizzando un sistema FPLC.
- Caricare il chiarificato lisato nella colonna pre-equilibrato e lavare con ∼10 il volume del letto del tampone di lavaggio fino a quando il flusso attraverso diventa chiaro.
- Eluire TET2 usando un 0-100% di pendenza dal tampone di lavaggio per il buffer di eluizione (tampone MES 50 mM, pH 6, NaCl di 1m) in 15 volumi di letto seguita da holding al tampone di eluizione di 100% per i volumi di due letti.
Nota: Raccogliere campioni (100 µ l) di cella lysata prima e dopo la colonna di carico insieme a tutte le frazioni di eluizione e analizzare il 10% SDS-PAGE di risoluzione. - Piscina le frazioni contenenti proteina TET2, congelare asciutto, sciogliere pallet di enzima in 10 mL di acqua e conservare a-80 ° C.
2. 5mC ossidazione di TET2 diossigenasi
- Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con 3 µ g del substrato (25-mer DNA a doppio filamento, tabella 2).
- Aggiungere 100 µ g di enzima purificato di TET2 in 50 µ l di tampone di reazione totale contenente 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2mm 2OG (2-ossoglutarato/α-chetoglutarato) e 2 mM l'ascorbato e incubare a 37 ° C per 1 h21.
- Placare le reazioni di ossidazione di TET2 catalizzata con 5 µ l di 500 mM EDTA.
- Dopo tempra reazioni di TET2, preparare i campioni per analisi LC-MS/MS separando il DNA dalla miscela di reazione di TET2 utilizzando colonne di purificazione di oligo.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di oligo a 55 µ l di reazione estiguuto.
- In seguito, aggiungere 400 µ l di etanolo al 100% per la miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di associazione oligo.
- Lavare il DNA associato con 750 µ l di tampone di lavaggio ed eluire in acqua di 20 µ l.
- Digerire il DNA isolato con 2 unità di dnasi I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 ° C per 12 h per produrre singoli nucleosidici-monofosfati.
- A seguito di digestione, aggiungere 2 unità della fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIAP) nei campioni e incubare per oltre 12 ore a 37 ° C per rimuovere i gruppi fosfato terminale da nucleosidici-monofosfati ottenere nucleosidi.
- Quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, utilizzando il metodo di LC-MS/MS descritto di seguito.
3. sviluppo di analisi LC-MS/MS-based quantitativa
- DNA normale basi (adenina, e preparare la soluzione di riserva 100 µM di tutti i nucleosidi modificati citosina [5-metil-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-idrossimetil-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formil-2 '-deoxycytidine (5fdC) e 5-carbossi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] timina, citosina e guanina) in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS.
- Ottimizzare i parametri di MS/MS di nucleosidici-dipendente mediante infusione di soluzioni di riserva, uno alla volta, in uno spettrometro di massa ad una portata di 10 µ l/min a EMS modalità di scansione. Ottimizzare i seguenti parametri: Declustering potenziale (DP), ingresso potenziale (EP), collisione cella ingresso potenziale (CEP), energia di collisione (CE) e collisione cella uscita potenziale (CXP) per ogni utilizzo di analoghi nucleosidici DNA automatizzato ottimizzazione quantitativa funzionalità del software.
- Ottimizzare i parametri di MS/MS di origine-dipendente da iniettare 10 µ l di soluzione madre utilizzando un gradiente con solvente B al 25% ad una portata di 0,3 mL/min dove solvente A è 10 mM ammonio acetato (pH 4.0) e solvente B è 20% acetonitrile con acetato di ammonio 10 mM (pH 4.0). Ottimizzare i seguenti parametri: tenda Gas (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, dissociazione collisioni attivato (CAD): bassa-media-alta, Ion spruzzo tensione (IS): 4000-5500 per ogni nucleosidici DNA facendo uso del manuale funzionalità di ottimizzazione quantitativa del software in modalità FIA (Flow Injection Analysis).
- Per separare tutti i nucleosidi di DNA otto, eseguire cromatografia liquida utilizzando il seguente gradiente: solvente B 0% (0-2 min), 0-20% di solvente B (2-5 min.), 20-60% di solvente B (5-9 min.), solvente di 60-0% B (9-10 min) e poi equilibrare con solvente A per 5 min ad una portata di 0,3 mL/min su una colonna C18 (dimensione delle particelle: 5 µm, dimensione dei pori: 120 Å).
- Utilizzando i parametri ottimali di MS/MS (passo 3.2 e 3.3) accoppiati con il gradiente di cromatografia liquida di cui sopra (punto 3.4), determinare la linearità di risposta, limite di rilevabilità (LOD) e limite inferiore di quantificazione (LLOQ) utilizzando un duplice diluizione seriale di una miscela standard di 100 µM contenenti tutti i otto nucleosidi. Disegnare curve standard per tutte le otto nucleosidi di DNA.
- Rilevare e quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, prodotte nel passaggio 2.4 utilizzando il metodo di LC-MS/MS e curve standard.
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Representative Results
Modifica dinamica di 5mC nel DNA di diossigenasi TET-famiglia svolge i ruoli importanti nel regolamento trascrizionale epigenetica. Dioxygenase di TET2 è frequentemente mutato in varie malignità ematopoietiche12. Per studiare il ruolo dell'enzima TET2 nello sviluppo normale e nella malattia, abbiamo clonato il suo dominio cataliticamente attivo minimo senza qualsiasi tag di affinità nel vettore pDEST1422. Il dioxygenase di TET2 senza tag è stato prodotto al ∼5% delle proteine totali solubili da analisi SDS-PAGE in batteri e. coli BL21 (DE3) cellule. Poiché il dominio catalitico di TET2 ha un punto isoelettrico relativamente alto (∼7.49), confrontato con l'indigeno Escherichia coli proteine24,25,26, un processo di purificazione efficiente utilizzando un catione la cromatografia di scambio è stata sviluppata. Ha reso questa purificazione > 90% puro TET2 enzima in un unico passaggio (Figura 1).
Al fine di separare e quantificare diversi deoxycytidines derivati e altri quattro basi di DNA naturale seguendo la reazione enzimatica di TET2, un'analisi LC-MS/MS-basata sensibile è stata ottimizzata. La cromatografia liquida usato una fase inversa C18 le colonne. Le curve standard sono stata elaborate utilizzando diluizioni seriali di una miscela contenente tutti i nucleosidi (Figura 2). Il gradiente usato per cromatografia liquida, descritto nella procedura sperimentale, è stato in grado di risolvere tutti i otto nucleosidi (Figura 3). La ritenzione di LC volte (tr) per tutte le otto nucleosidi sono descritti nella tabella 3. Abbiamo ulteriormente ottimizzato la rilevazione di MS di ogni genitore dello ione del nucleoside (Q1), lo ione più intenso di prodotto (Q3) determinando il loro potenziale declustering (DP), potenziale di ingresso (EP), collisione cella ingresso potenziale (CEP), limite di energia di collisione (CE) rilevazione (LOD) e limite inferiore di quantificazione (LLOQ) (tabella 3). Infine, è stato sviluppato un metodo di LC-MS/MS che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico) (Figura 3).
L'attività di senza tag TET2 diossigenasi è stata determinata utilizzando un dsDNA 25-mer contenente uno 5mC in un'isola di CpG in ogni filamento di DNA (tabella 2). Dopo le reazioni enzimatiche di TET2, oligonucleotides del DNA sono stati purificati e convertiti in nucleosidi. Quindi questi nucleosidi sono stati sottoposti ad analisi LC-MS/MS. Nelle reazioni senza l'enzima TET2 (controllo negativo), sono stati osservati soli picchi dA, dT, dG, dC e 5mdC. Tuttavia, nella reazione di controllo positivo, che conteneva il dioxygenase di TET2, due nuovi picchi corrispondenti a d5hmC e d5fC sono stati osservati. Non eravamo in grado di rilevare la formazione di d5caC nucleosidici possibilmente dovuto i suoi livelli di rilevamento poveri (Figura 2). Questi risultati dimostrano che il dioxygenase di TET2 senza tag purificato in questa procedura è cataliticamente attiva e può essere utilizzato per caratterizzare l'enzima wt-TET2 e suoi mutanti cliniche.
Figura 1. Analisi SDS-PAGE delle purificata TET2 diossigenasi da e. coli BL21 (DE3) cellule. Lane A indica marcatore mentre corsia che b indica TET2 proteina purificata mediante resina a scambio ionico sepharose SP. La dimensione totale della senza tag dioxygenase di TET2 è kDa ∼54 come indicato dalla freccia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Le curve standard era sorteggio per quattro naturale DNA nucleosidi e derivati della citosina differenti, che sono stati poi utilizzati per la loro quantificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Cromatografia liquida (in basso) e MS/MS (sopra) metodo utilizzato per separare e caratterizzare quattro naturale DNA nucleosidi e derivati diversi citosina.
| Nome di primer | Sequenza più superelegante | |||
| TET2 forward primer | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Reverse Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tabella 1: Sequenza degli iniettori del oligonucleotide del DNA usato per l'amplificazione di PCR del dominio catalitico di dioxygenase di TET2 umana senza tag.
| Nome di primer | Sequenza più superelegante |
| Filamento senso | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Antisenso Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tabella 2: Sequenza di 25-mer senso e anti-dsDNA oligonucleotide utilizzato come TET2 substrato per le reazioni di ossidazione in vitro .
| Nucleosidi | 1 ° TRIMESTRE | Q3 | tr (min) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deossiadenosina | 252,2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243,2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0,999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268,2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7,8 | 25,74 | 0,999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0,33 | 0,998 | |
| 5-metil-2'-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0.1 | 0,998 | |
| 5-idrossimetil-2'-deoxycytidine | 258,2 | 142,1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0,993 | |
| 5-formil-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140,1 | 10,92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0,66 | 0,998 | |
| 5-carbossi-2'-deoxycytidine | 272,2 | 156,1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12,87 | 0,993 | |
Tabella 3: Parametri ottimizzati di LC-MS/MS di quattro nucleosidi di DNA naturale e citosina diversi derivati sotto modalità ioni positivi. Per ogni genitore dello ione nucleoside (Q1), è stato rilevato l'ione di prodotto più intenso (Q3).
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Discussion
Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti12. Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET214. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno ricapitolato gli effetti di queste mutazioni sui livelli di 5hmC in cellule trasfettate14. Risultati da modelli murini di TET2-knockout hanno dimostrato che il livello di TET2 enzima inversamente correlato con la progressione di malignità ematopoietiche17,18,19,20. Coerentemente, Zhang et al. , recentemente dimostrato che il giù-regolamento di TET2 livelli di espressione è un potenziale biomarcatore prognostico e predittivo nella leucemia mieloide acuta citogeneticamente normale27.
Nonostante la crescente evidenza che TET2 gioca un ruolo fondamentale nell'ematopoiesi normale e trasformazione mieloide, caratterizzazione biochimica di wt - e mutante TET2 rimangono alle fasi rudimentale a causa di difficoltà connesse con la produzione di TET2 attivo e la sua analisi. Maggior parte degli studi hanno prodotto sistema di baculovirus ricombinante TET2 utilizzando sia che richiede tempo in cellule di insetto14, o come un tag di affinità di S-transferasi in cellule batteriche che richiede la rimozione di affinità tag21il glutatione.
In questa procedura sperimentale, abbiamo descritto la clonazione di senza tag umano TET2 diossigenasi catalitico dominio utilizzando una tecnica di ricombinazione sito-specifica e la sua espressione efficiente utilizzando il vettore di destinazione (pDEST14) in e. coli. Perché il punto isoelettrico di TET2 senza tag è relativamente alto (∼7.49) rispetto a proteine di e. coli più indigeni, abbiamo sviluppato un processo di purificazione efficiente utilizzando la cromatografia di scambio cationico, un rendimento > 90% puro senza tag TET2 enzima in un unico passaggio.
Inoltre, ulteriori sfide esistano nella quantificazione dell'attività di dioxygenase di TET2 wt - e mutante. Per questi esperimenti, la maggior parte degli studi hanno contato su saggi basati su anticorpi come dot-blot14,28, enzima-collegata dell'immunosorbente dosaggi (ELISA)29, ecc. , perché questi test utilizzano generalmente un solo anticorpo, ad esempio, 5hmC o 5fC or5caC, per il rilevamento di 5mC modificazione nel DNA, substrato non forniscono un quadro completo della reazione catalitica trasportato da TET isoforme. Per questi motivi, l'analisi LC-MS/MS-based è emerso come il solo test per quantificare le modifiche differenti citosina. A questo proposito, abbiamo sviluppato un metodo di cromatografia liquida romanzo che può separare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5mC, 5hmC, 5 fC e 5caC).
Per quantificare i otto nucleosidi da reazioni di TET2 catalizzata, abbiamo abbiamo accoppiato nostro metodo migliorato cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. Questa analisi LC-MS/MS sensibile è stato poi utilizzata per determinare l'attività dell'enzima TET2 ricombinante umano senza tag. L'approccio descritto qui permetterà di migliorare notevolmente la valutazione delle attività di dioxygenase di TET2 wt - e mutante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun interessi finanziari di dichiarare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal dipartimento della difesa sotto forma di un'Idea Award (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplastica & MDS Foundation Grant e grant UMRB a M.M. Authors ringraziare Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar per clonazione iniziale di TET2 nel vettore pDEST14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
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