Summary
여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.
Abstract
5-methylcytosine (5mC)에 의해 중재 후 전사 조절 핵 개발에 중요 한 역할을 담당해 왔습니다. 이 후 성적인 표의 demethylation thymine DNA glycosylase 종속 기본 절단 복구 뒤 10-11 전 dioxygenases (TET1-3)에 의해 계속적인 산화에 의해 수행 됩니다. 유전 돌연변이 또는 다른 후 성적인 기계 장치에 의해 TET2 유전자의 비활성화 다양 한 암, 특히 조 혈 악성 종양을 가진 환자에 있는 빈약한 예 지와 연결 됩니다. 여기, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 태그 한 인간 효소 활성 TET2 dioxygenase의 효율적인 단일 단계 정화를 설명 합니다. 우리는 더 분리 하 고 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5-메 틸, 5-hydroxymethyl 일까 지, 5 formyl 그리고 5-carboxyl) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 정할 수 있는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 접근을 제공 합니다. 이 분석 결과 야생 유형 및 돌연변이 TET2 dioxygenases의 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
CpG 디 내에서 시 토 신 기지의 C5 위치는 포유류 유전자1에 주된 메 틸 화 사이트 (5mCpG)입니다. 또한, 최근 연구 된 광범위 한 C5 시 토 신 메 틸 화 (5mC) 비 CpG 사이트에서 발견 (5mCpH, 어디 H = A, T, 또는 C)2,3. 5mC 수정 생 retrotransposons 및 유전자 발기인3,,45에 transcriptional 소음 기 역할을 합니다. 5mC에서 DNA 메 틸 화는 또한 X 염색체 비활성화, 유전자 각 인, 핵 프로그래밍 및 조직 관련 유전자 식5,,67에 중요 한 역할을 재생합니다. C5 위치에서 시 토 신 메 틸 화 DNA methyltransferases에 의해 수행 됩니다 그리고이 효소에 돌연변이 발생할 상당한 발달 결함8. 5mC 표시의 제거는 TET1 3 5mC oxidases9,10에서 시작 됩니다. 이러한 TET 가족 dioxygenases 변환 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)와 5-carboxylcytosine (5caC) 순차 산화 단계11,,1213. 마지막으로, thymine DNA glycosylase 5 fC 또는 기본 절단 복구 통로11를 사용 하 여 수정 되지 않은 시 토 신을 5caC 대체 합니다.
인간 TET2 유전자 형성 증후군 (MDS)14,,1516, MDS myeloproliferative 신생 (를 포함 하 여 다양 한 조 혈 악성 종양에서 자주 돌연변이 유전자로 확인 됐다 MDS-MPN), 및 MDS와 MDS MPN16에서 발생 하는 급성 골수성 백혈병 (AML). 5hmC 수정 골 DNA에서에서의 레벨은 야생 타입 (wt)와 그에 비해 TET2 돌연변이와 환자에서 더 낮은-TET214. 그룹 수 일반 조 및 골수성 변환17,18,,1920에서 역할을 명료 하 게 TET2 녹아웃 마우스 모델을 개발 했습니다. TET2 유전자에 있는 돌연변이와이 쥐 되었고 처음 정상 가능한, 하지만 그들은 그들의 이른 죽음을 일으키는 노인으로 다양 한 조 혈 악성을 각 성. 이러한 연구는 정상적인 조 혈 차별화에서 wt-TET2에 의해 재생 중요 한 역할을 보여주었다. 이 마우스 모델, heterozygous 조 혈 줄기 세포 (TET2+ HSCs) 및에서 homozygous TET2-/- HSCs homozygous wt-TET2 HSCs 두 TET2+ 로 조 혈 계보를 다시 채우기에 비해 경쟁 우위를 했다 그리고 TET2-/- HSCs 개발 다양 한 조 혈 악성 종양17,18. 이러한 연구는 haploinsufficiency TET2 dioxygenase HSCs의 개발을 변경 하 고 조 혈 악성의 보여 줍니다.
TET2 유전자에 있는 돌연변이와 마우스와 마찬가지로, 대부분의 백혈병 환자 haploinsufficiency TET2 dioxygenase 활동의 명단. 이 주로 heterozygous 체세포 돌연변이 포함 가장 missense 돌연변이 동안 TET2 유전자 신체에 걸쳐 분산 프레임 시프트와 넌센스 돌연변이 dioxygenase 도메인12클러스터. 날짜 하려면, 작은 특성의 wt 및 돌연변이 TET2 TET2 dioxygenase 및 그것의 분석 결과21의 생산 어려움 때문에 주로 문학에 보고 됩니다. 여기, 우리는 이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 네이티브 TET2 dioxygenase의 간단한 단일 단계 정화를 보고 합니다. 또한, 양적 LC-MS/MS 분석 결과 최적화 되었고 네이티브 TET2 dioxygenase의 효소 활동을 측정 하는 데 사용.
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Protocol
1. 복제 및 태그 인간 TET2 Dioxygenase의 정화
- 앞에서 설명한22으로 사이트별 재조합 기술을 사용 하 여 pDEST14 대상 벡터에 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 복제.
참고: 이전 연구 C 터미널 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 도메인은 최소한의 촉매로 활성 도메인21,23증명 하고있다. PDONR221 벡터를 사용 하 여 태그 TET2 dioxygenase 도메인을 표현 하기 위하여 빛나는 Dalgarno 및 Kozak 시퀀스는 PCR (표 1) 중 앞으로 뇌관에 통합 했다. - 세균성 변환에 대 한 추가 태그가 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843)의 화학적으로 유능한 대장균 100 µ L 포함 하는 재조합 pDEST14 식 벡터의 1 µ L BL21 (DE3) 셀 1.7 mL 튜브에. 30 42 ° C에서 열 충격 이어서 적어도 15 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 물 욕조에 s.
- 열 충격 후 즉시 다시 최소 2 분의 얼음에 셀을 계속. 이것 다음, 셀에 catabolite 억압 (S.O.C 미디어) 슈퍼 최적의 국물의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 세균 세포를 품 어.
- 부 화, 후 pipetting으로 1 분 취소 70% 상쾌한 9000 x g에서 튜브 centrifuging 여 셀 아래로 회전 하 고 미디어를 통해 왼쪽에 펠 릿을 녹.
- Luria 국물 (파운드) 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 하에 세포 현 탁 액을 확산. 16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
- 하나의 고립 된 식민지를 선택 하 고 50 mL 튜브에 파운드-암 피 실린 미디어의 10 mL에 접종. 하룻밤을 위해 통에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 이 어 50 mL 튜브에서 문화의 100 µ L를 사용 하 여 미디어 파운드-암 피 실린의 100 mL를 접종 하. 기본 문화권으로 사용 하 여 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 다음 날, 주 문화의 각 6 mL를 사용 하 여 접종 15 플라스 크, 각 포함 600 mL 파운드-암 피 실린 미디어. 자, 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 15 플라스 크를 품 어.
참고: 변환 된 클론을 확인에 대 한 격리 된 플라스 미드 DNA와 DNA 시퀀싱 또는 제한 소화를 수행 합니다. - 세균성 문화의 밀도 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 그것의 OD600 을 측정 합니다. 문화에는 OD600에서 0.8의 밀도 도달 하면, 각 플라스 크에 1 M (600 mL에 0.5 m m의 최종 농도) IPTG의 300 µ L와 TET2 단백질의 표현을 유도 하 고 16 h 17 ° c.에 대 한 문화를 더욱 성장
- 16 h 후 원심 분리기 병 세균성 문화를 전송 합니다. 원심 45 분 사용에 대 한 5250 x g에 TET2 효소를 표현 하는 세균성 문화 TET2 정화에 대 한 세균 펠 릿.
얼음 또는 4 ° c.에 모든 나머지 단백질 정화 단계를 수행 하는 참고: - 50mm MES의 100 mL에서 세균 펠 릿 resuspend (2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산) 버퍼, pH 6 및 전력 20 60 s 냉각 간격에서 5 × 30 s sonicate.
- 회전 45 분에 대 한 5250 x g에서 lysate 수용 성 TET2 효소를 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 0.45 μ m 통과 FPLC 시스템에 로드 하기 전에 필터링 합니다.
참고:이 실험에서 TET2 효소 매우 안정 하지만 필요한 프로 테아 제 억제 물 칵테일 포함 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl 불 (PMSF), 그리고 0.5 m m 1,10-o-phenanthroline lysate를 셀에 추가할 수 있습니다. TET2 효소의 저하를 방지 합니다. 로이 다음 양이온 교환 크로마토그래피를 방해할 수 있습니다 칵테일 억제제에 EDTA 또는 EGTA를 사용 하지 마십시오. - FPLC 열에 강한 양이온 교환 수 지의 30 mL 팩. 10 침대 양의 워시 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6) 0.3 mL/min FPLC 시스템을 사용 하 여 일정 한 유량으로 열 equilibrate
- 로드는 명확히 미리 equilibrated 열에 ∼10 침대 양의 워시 버퍼를 통해 흐름 취소 될 때까지 세척 lysate.
- TET2 elute 0-100을 사용 하 여 15 침대 볼륨에서 차입 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6, 1 M NaCl) 워시 버퍼에서 그라데이션 % 다음 2 침대 볼륨 100% 차입 버퍼에서 개최.
참고: 셀 열 모든 차입 분수와 함께 로드 전후 lysate의 샘플 (100 µ L 각)를 수집 하 고 10 %SDS-PAGE 해결에 분석. - 포함 하는 TET2 단백질 분수 풀, 동결 건조, 분해 효소 팔레트 10 mL 물에-80 ° c.에 게
2. TET2 Dioxygenase에 의해 5mC 산화
- 3 µ g (25-메 르 이중 좌초 DNA, 표 2) 기판의와 3 중에서 모든 demethylation 반응을 수행 합니다.
- 순화 TET2 효소의 100 µ g 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µ M FeSO4, 2mm 2OG 포함 하는 전체 반응 버퍼의 50 µ L에 추가 (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), 그리고 2 mM 하는데 1 h2137 ° C에서 품 어와.
- 500 mM EDTA의 5 µ L와 TET2 촉매 산화 반응을 끄다.
- TET2 반응, 냉각 후 올리고 정화 열을 사용 하 여 TET2 반응 혼합물에서 DNA를 분리 하 여 LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.
- 침묵과 반응의 55 µ L를 올리고 바인딩 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
- 이 따라 400 µ L 100% 에탄올의 혼합물에 추가 합니다. 이 혼합 올리고 바인딩 열을 통해 전달 합니다.
- 750 µ L 워시 버퍼와 바운드 DNA를 세척 하 고 20 µ L 물에 elute.
- 소화 DNase의 2 대와 고립 된 DNA 나 고 S1 nuclease 12 h 37 ° C에서 60 단위 개별 nucleoside monophosphates를 생산 하.
- 소화, 다음 샘플에서 종 아리 장 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (CIAP)의 2 대를 추가 하 고 또한 nucleosides를 nucleoside monophosphates에서 터미널 인산 염 그룹을 제거 하려면 37 ° C에 12 h에 대 한 품 어.
- 모든 nucleosides, 아래에 설명 된 LC-MS/MS 방법을 사용 하 여 특히 수정 된 cytosines 계량.
3. 양적 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발
- [5-메 틸-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2-deoxycytidine (5fdC), 및 5-카-2-deoxycytidine (5cadC)] 모든 수정된 시 토 신 nucleosides의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 하 고 정상적인 DNA 기초 (아데닌, thymine, 구 아닌, 시 토 신) LC-MS/MS 방법의 개발을 위한 HPLC 급 물.
- 재고 솔루션을 한 번에 하나씩 일으키는 nucleoside 종속 MS/MS 매개 변수 최적화, EMS에 10 µ L/min 흐름 속도에 질량 분석기에서 스캔 모드. 다음 매개 변수 최적화: 양적 최적화 자동 각 DNA nucleoside 사용에 대 한 잠재적인 (DP), 입구 잠재력 (EP), 충돌 셀 입구 잠재적인 (CEP), 충돌 에너지 (CE), 및 충돌 셀 출구 잠재적인 (CXP) Declustering 소프트웨어의 기능입니다.
- 25% 용 매 B 용 매 A는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0) 및 용 매 B는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0)와 20% 이기 0.3 mL/min의 유량과 그라디언트를 사용 하 여 재고 솔루션의 주입 10 µ L 여 소스 종속 MS/MS 매개 변수를 최적화 합니다. 다음 매개 변수 최적화: 커튼 가스 (CUR): 10-50, 온도: 0-600 ° C, 가스 흐름 1 (GS1): 0-50, 가스 흐름 2 (GS2): 0-50, Collisionally 활성화 분리 (CAD): 낮은-중간-높은, 이온 스프레이 전압 (IS): 4000-5500 설명서를 사용 하 여 각 DNA nucleoside에 대 한 FIA (흐름 주입 분석) 모드에서 소프트웨어의 양적 최적화 기능.
- 모든 8 개의 DNA nucleosides, 별도로 수행 다음 그라디언트를 사용 하 여 액체 착 색 인쇄기: 0% 용 매 B (0-2 분), 0-20% 용 매 B (2-5 분), 20-60% 용 매 B (5-9 분), 60-0% 용 매 B (9-10 분)와 다음 0.3의 흐름 율에 5 분에 대 한 용 매 A와 equilibrate C18 열에 mL/min (입자 크기: 5 µ m, 기 공 크기: 120 Å).
- 위에서 언급 한 액체 크로마토그래피 그라데이션 (단계 3.4)와 결합 하 여 최적의 MS/MS 매개 (3.2 및 3.3 단계)를 사용 하 여 확인 응답 선형성, 탐지 (LOD)의 제한 및 정량화 (LLOQ)를 사용 하 여 낮은 두 배 모두 8 개의 nucleosides를 포함 하는 100 µ M 표준 혼합 직렬 희석 모든 8 개의 DNA nucleosides에 대 한 표준 곡선을 그립니다.
- 검색 및 모든 nucleosides, 특히 수정 된 cytosines 단계 2.4 LC-MS/MS 방법 및 표준 곡선을 사용 하 여에서 생산 계량.
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Representative Results
TET 가족 dioxygenases에 의해 DNA에 5mC의 동적 수정 epigenetic transcriptional 규칙에 중요 한 역할을 담당합니다. TET2 dioxygenase는 다양 한 조 혈 악성 종양12자주 변경 됩니다. 일반 개발 및 질병 TET2 효소의 역할을 조사, 우리 pDEST14 벡터22에 어떤 선호도 태그를 하지 않고 최소한의 촉매로 활성 도메인을 복제 있다. 태그 TET2 dioxygenase 총 수용 성 단백질의 ∼5 %SDS 페이지 분석 박테리아에 의해 제작 되었다 대장균 BL21 (DE3) 세포. 때문에 TET2의 촉매 도메인은 대부분 원주민 대장균 단백질24,25,26, 양이온을 활용 하 여 효율적인 정화 과정에 비해 상대적으로 높은 전자 포인트 (∼7.49) 교환 크로마토그래피 개발 되었다. 이 정화 나왔고 > 단일 단계 (그림 1)에서 90% 순수 TET2 효소.
분리 하 고 다른 deoxycytidines 유도체 및 TET2 효소 반응에 따라 다른 4 개의 자연적인 DNA 기초 계량, 민감한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 최적화 되었다. 액체 크로마토그래피는 반전 단계 C18 열을 사용합니다. 표준 곡선 모든 nucleosides (그림 2)를 포함 하는 혼합물의 직렬 희석을 사용 하 여 그려 했다. 실험 절차에서 설명 하는 액체 크로마토그래피에 사용 되는 그라데이션의 모든 8 nucleosides (그림 3) 해결할 수 있었습니다. 모든 8 개의 nucleosides에 대 한 시간 (tr) LC 보존 표 3에 설명 되어 있습니다. 우리는 더 그들의 declustering 잠재력 (DP), 입구 잠재력 (EP), 충돌 셀 입구 잠재적인 (CEP), 충돌 에너지 (CE)의 한도 결정 하 여 각 부모 이온 nucleoside (1 분기), 가장 강렬한 제품 이온 (Q3)의 MS 검색 최적화 (LOD), 탐지 그리고 정량화 (LLOQ) (표 3)에의 한. LC-MS/MS 방법이 개발 되었다 마지막으로, 분리 하 고 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5-메 틸, 5-hydroxymethyl 일까 지, 5 formyl 그리고 5-carboxyl) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 계량 수 있습니다 (그림 3).
태그 TET2 dioxygenase의 활동은 포함 된 각 DNA 가닥 (표 2)에 CpG 섬에 한 5mC 25 메 르 dsDNA를 사용 하 여 결정 했다. TET2 효소 반응 후 DNA oligonucleotides 정화 되었고 nucleosides로 변환. 다음이 nucleosides LC-MS/MS 분석 결과를 받게 되었다. TET2 효소 (부정적인 제어) 없이 반응에만 다, dT, dG, dC 및 5mdC 봉우리 관찰 되었다. 그러나, 긍정적인 제어 반응, 포함 TET2 dioxygenase, d5hmC 및 d5fC에 해당 하는 두 개의 새로운 봉우리 관찰 되었다. 우리는 불 쌍 한 검출 레벨 (그림 2)으로 인해 d5caC nucleoside의 형성을 검출 하지 못했습니다. 이러한 결과 입증이 절차에서 정화 된 TET2 dioxygenase 촉매로 활성화 wt-TET2 효소 및 그것의 임상 돌연변이 특성을 사용할 수 있습니다.
그림 1. 대장균 BL21에서 순화 TET2 dioxygenase의 SDS 페이지 분석 (DE3) 세포. 레인 A 레인 B TET2 단백질 정화 SP sepharose 이온 교환 수 지를 사용 하 여 표시 하는 동안 마커를 나타냅니다. 태그 TET2 dioxygenase의 전체 크기는 ∼54 kDa 화살표에 표시 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 표준 곡선 4 개의 자연적인 DNA nucleosides와 다른 시 토 신 유도체, 그들의 정량화에 대 한 다음 사용에 대 한 무승부를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 액체 착 색 인쇄기 (하단) 고 MS/MS (위) 분리 하 고 4 개의 자연적인 DNA nucleosides 및 다른 시 토 신 유도체를 특성화 하는 데 사용 하는 방법.
| 뇌관 이름 | 뇌관 순서 | |||
| TET2 앞으로 뇌관 | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 역 뇌관 | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
표 1: 태그 없는 인간 TET2 dioxygenase의 촉매 도메인의 PCR 증폭에 사용 되는 DNA oligonucleotide 뇌관의 시퀀스입니다.
| 뇌관 이름 | 뇌관 순서 |
| 감각 가닥 | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| 센스 가닥 | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
표 2: 의미와 반대로 감각 25 메 르 dsDNA oligonucleotide TET2 기판으로 사용 하는 체 외에서 산화 반응에 대 한 시퀀스입니다.
| Nucleosides | 1 분기 | 3 분기 | tr (최소) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0.06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0.33 | 0.998 | |
| 5-메 틸-2-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-카-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
표 3: 4 자연 DNA nucleosides 및 다른 시 토 신 유도체 긍정적인 이온 모드에서의 최적화 된 LC-MS/MS 매개 변수입니다. 각 부모 이온 nucleoside (1 분기)에 대 한 가장 강렬한 제품 이온 (Q3) 검색 되었습니다.
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Discussion
TET2 유전자에 있는 돌연변이 다양 한 조 혈 악성 종양 환자에서 가장 많이 검색 된 유전자 변화입니다. 말도, 프레임 이동 및 missense 돌연변이 포함 하는 다른 TET2 돌연변이의 수백까지 환자12에서 확인 되었습니다. TET2 돌연변이 가진 환자 wt-TET214와 그에 비해 골에서 게놈 5hmC의 낮은 레벨을 표시 합니다. 실험 노크에서 돌연변이 TET2 transfected 세포145hmC 수준에이 돌연변이의 효과 지 있다. TET2-녹아웃 마우스 모델에서 결과 시연 TET2 효소의 수준은 반비례 조 혈 악성 종양17,,1819,20의 진행과 상관. 일관 되 게, 장 외. 최근 그 다운 레 귤 레이 션 TET2의 시연 식 레벨은 cytogenetically 정상 급성 골수성 백혈병27에 잠재적인 전조 및 예측 바이오 마커.
TET2 일반 조 및 골수성 변화에 근본적인 역할을 담당 하는 증거, 성장에 불구 하 고 wt-및 돌연변이 TET2의 생 화 확 적인 특성 활성 TET2의 생산과 관련 된 어려움 때문에 기초 단계에서 남아 그리고 그 분석 결과입니다. 대부분의 연구는 재조합 TET2 사용 시간이 걸리는 잠재 시스템 곤충 세포14또는 티 선호도 태그21의 제거는 세균 세포에 S-전이 효소 선호도 태그를 생산 했습니다.
이 실험적인 절차에서 우리 태그 인간 TET2 dioxygenase 촉매 사용 하 여 도메인 사이트 재조합 기술과 효율적인 표현 대상 벡터 (pDEST14)를 사용 하 여 대장균에서 복제 설명. (∼7.49) 가장 토착 대장균 단백질와 비교 된 TET2의 전자 점은 상대적으로 높은 있기 때문에 양이온 교환 크로마토그래피 저조한 활용 하 여 효율적인 정화 과정 개발 > 90% 순수 지정 TET2 한 단계에서 효소입니다.
또한, 추가 과제 wt-및 돌연변이 TET2 dioxygenase 활동의 정량화에 존재 한다. 이 실험에 대 한 대부분의 연구는 점 오 점14,28등 항 체 기반 분석에 의존 해야, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA)29, 등 이러한 분석은 일반적으로 하나의 항 체를 사용 하기 때문에 예를 들어, 5hmC 또는 5mC 수정 기판 DNA에서 검색을 위한 5 fC or5caC 그들은 TET isoforms에 의해 실시 하는 촉매 반응의 전체 그림을 제공 하지 않습니다. 이러한 이유로, LC-MS/MS 기반 분석 결과 다른 시 토 신 수정 계량 분석 하는 유일한 결과로 떠오르고 있다. 이와 관련, 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5mC, 5hmC, 5 fC, 및 5caC) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 분리할 수 있는 새로운 액체 크로마토그래피 방법을 개발 했습니다.
TET2 촉매 반응에서 8 nucleosides 계량, 우리 탠덤 질량 분석 우리의 향상 된 액체 크로마토그래피 방법을 결합 했습니다. 이 민감한 LC-MS/MS 분석 결과 다음 재조합 된 인간 TET2 효소의 활동을 결정 하기 위해 이용 되었다. 여기서 설명 하는 방법은 크게 wt-및 돌연변이 TET2 dioxygenase 활동의 평가 강화할 것 이다.
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Disclosures
저자는 선언에 아무런 재정적 이익이 있다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국방부의 아이디어 상 (W81XWH-13-1-0174), Aplastic 빈 혈 및 MDS 재단 보조금의 형태로 의해 투자 되었다 그리고 mm은 저자 UMRB 그랜트 감사 Mohit Jaiswal Subhradeep Bhar pDEST14 벡터에 TET2의 초기 복제에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
