Summary
כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.
Abstract
הסדרת שעתוק epigenetic מתווכת על-ידי 5-methylcytosine (5mC) שיחק תפקיד קריטי בהתפתחות האיקריוטים. Demethylation של אלה סימני epigenetic מושגת על ידי חמצון רציף על ידי 10-11 טרנסלוקציה dioxygenases (TET1-3), ואחריו התיקון glycosylase תלוית בסיס כריתה תימין-DNA. איון של הגן TET2 עקב מוטציות גנטיות, או על ידי אחרים מנגנוני epigenetic מזוהה עם פרוגנוזה גרועה אצל חולים עם סרטן מגוונות, במיוחד hematopoietic ממאירות. כאן, אנו מתארים של טיהור יעיל צעד בודד של enzymatically הפעיל לא מתויגות האנושי TET2 dioxygenase באמצעות כרומטוגרפיה קטיונים. אנו מספקים נוסף בגישה ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) זה יכול להפריד ולכמת את ארבעת הרגיל DNA בסיסים (A, T, G ו- C), כמו גם ארבעה בסיסי ציטוזין ששונתה (5-מתיל, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, 5-carboxyl). Assay זה יכול לשמש כדי להעריך את הפעילות של פראי סוג של מוטציה TET2 dioxygenases.
Introduction
המיקום C5 של ציטוזין בסיסים בתוך CpG dinucleotides הוא אתר מתילציה הדומיננטית (5mCpG) הגנום בתרבית של1. בנוסף, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו נרחב מתילציה ציטוזין C5 (5mC) באתרים שאינם-CpG (5mCpH, איפה H = A, T, או C)2,3. השינוי 5mC משמש משתיק קול תעתיק retrotransposons אנדוגני, ג'ין היזמים3,4,5. מתילציה DNA-5mC גם ממלא תפקידים חשובים איון כרומוזום X, ג'ין החתמה, התכנות גרעינית, רקמות ספציפיות ג'ין ביטוי5,6,7. מתילציה של ציטוזין במיקום C5 מבוצע על ידי ה-DNA methyltransferases, ולגרום מוטציות בגן אנזימים אלה ליקויים התפתחותיים משמעותיים8. הסרת סימני 5mC מבוצעים על-ידי-TET1-3 5mC oxidases9,10. אלה dioxygenases ט-המשפחה להמיר 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) ו- 5-carboxylcytosine (5caC) על ידי חמצון רציפים צעדים11,12,13. לבסוף, תימין-DNA glycosylase מחליפה 5fC או 5caC כדי שלא שונתה ציטוזין באמצעות כריתה בסיס תיקון מסלול11.
הגן TET2 האנושי זוהה גן שעבר מוטציה בתדירות גבוהה בממאירות hematopoietic מגוונים כולל myelodysplastic תסמונות (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative (neoplasms MDS-MPN), ו לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) שמקורם MDS ועוד MDS-MPN16. הרמות של שינוי 5hmC במח העצם DNA נמוכים בחולים עם מוטציות TET2 בהשוואה לאלו עם פראי סוג (wt)-TET214. מספר קבוצות פיתחו מודלים העכבר TET2-נוקאאוט התירי את תפקידה hematopoiesis רגיל וטרנספורמציה מיאלואידית17,18,19,20. אלו עכברים עם מוטציות בגן TET2 היו רגילים בתחילה בר -קיימא, אך באה לידי ביטוי מגוונות ממאירות hematopoietic כפי שהם הזדקנו גרימת מוות מוקדם שלהם. מחקרים אלו הראו את התפקידים החשובים בגילומו של TET2-wt ב בידול hematopoietic רגילה. מודלים אלה העכבר משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים תאי גזע hematopoietic (TET2+ /- HSCs), homozygous TET2- / - HSCs היו יתרון תחרותי על פני wt homozygous-TET2 HSCs ב לאכלס מחדש שושלות hematopoietic כמו שני TET2+ /- TET2- / - HSCs פיתחה מגוון גידולים ממאירים hematopoietic17,18. מחקרים אלה מדגימים את haploinsufficiency של TET2 dioxygenase הפיצולים הפיתוח של HSCs ותוצאות hematopoietic ממאירות.
בדומה לעכברים עם מוטציות בגן TET2, רוב חולי לוקמיה להתבטא haploinsufficiency של TET2 dioxygenase פעילות. מוטציות סומאטית בעיקר משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים אלה כוללות מסגרת-shift ושטויות מוטציות התפזרו בכל הגוף ג'ין TET2 תוך מוטציות missense ביותר באזור התחום dioxygenase12. עד כה, אפיון קטן של מוטציה, wt ו TET2 מדווח בספרות בעיקר עקב קשיים עם הייצור של TET2 dioxygenase ואת וזמינותו שלה21. כאן, מדווחים על טיהור צעד אחר צעד פשוט של יליד dioxygenase TET2 באמצעות כרומטוגרפיה יונים. עוד, וזמינותו כמותית LC-MS/MS היה ממוטב, המשמש למדידת פעילות אנזימטי של יליד TET2 dioxygenase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיבוט ולטיהור TET2 אנושיות לא מתויגות Dioxygenase
- לשבט TET2 אדם dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) לתוך הווקטור היעד pDEST14 בטכניקה רקומבינציה בייעודי לאתר כפי שתואר לעיל22.
הערה: מחקרים קודמים הדגימו כי התחום dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) TET2 C-מסוף הוא מינימלי תחום catalytically active21,23. כדי לבטא לא מתויגות TET2 dioxygenase המחשבים באמצעות וקטור pDONR221, סופחו Dalgarno לזרוח, קוזאק רצפים פריימר לפנים במהלך ה-PCR (טבלה 1). - לטרנספורמציה חיידקי, להוסיף 1 µL של pDEST14 רקומביננטי וקטור ביטוי המכיל לא מתויגות האנושי TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) כדי µL 100 של כשיר מבחינה כימית e. coli BL21 (DE3) תאים בשפופרת 1.7 מ ל. לשמור את התערובת על קרח לפחות 15 דקות ולאחריו הלם החום 42 ° C ל 30 s באמבט מים.
- מיד לאחר הלם חום, לשמור את התאים חזרה על קרח על מינימום של 2 דקות. בעקבות זאת, להוסיף 250 µL מרק סופר אופטימלית עם דיכוי catabolite (S.O.C מדיה) לתאים. דגירה של תאים חיידקיים עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר.
- לאחר דגירה, ספין למטה התאים על ידי צריך שתוציאו את הצינור ב g 9,000 x לקבלת תגובת שיקוע 70% 1 מינימלית להשליך על-ידי pipetting, להמיס בגדר שמאל על פני המדיה.
- מורחים התליה תא על צלחת מרק (LB) לוריא אגר המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.
- בחרו אחד המושבה מבודד, לחסן אותו לתוך 10 מ"ל של התקשורת LB-אמפיצילין שפופרת 50 מ. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר נלון. בעקבות זאת, השתמש µL 100 של תרבות מהצינור 50 מ ל לחסן 100 מ ל LB-אמפיצילין המדיה. דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף-סל ד 180 ולהשתמש בו בתור ראשי תרבות. ביום למחרת, להשתמש 6 מ ל כל אחד של תרבות ראשי כדי לחסן 15 מבחנות, בכל מדיה 600 מ ל LB-אמפיצילין המכיל. עכשיו, דגירה 15 מבחנות ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף-180 סל ד.
הערה: עבור אימות שיבוטים טרנספורמציה, לבצע DNA רצף או הגבלת העיכול עם פלסמיד מבודד הדנ א. - כדי לבדוק את הצפיפות של התרבות חיידקי, למדוד שלה OD600 באמצעות ספקטרופוטומטרים. לאחר התרבות מגיע צפיפות של 0.8-OD600, זירוז הביטוי של חלבון TET2 µL 300 של IPTG 1 מ' (הריכוז הסופי של 0.5 מ מ 600 מ ל) בכל הבקבוק ולגדול עוד יותר התרבות של h 16-17 מעלות צלזיוס.
- לאחר 16 ה', להעביר את התרבות חיידקי צנטריפוגה בקבוקים. Centrifuge התרבות חיידקי לבטא את האנזים TET2-g 5,250 x עבור 45 דקות השימוש בגדר חיידקי לטיהור TET2.
הערה: בצע את כל שלבי טיהור הנותרים של חלבון או על הקרח או ב 4 º C. - Resuspend בגדר חיידקי ב- 100 מ של 50 מ מ MES (2-(N-מורפולינו) חומצה ethanesulfonic) מאגר, ה-pH 6 ו sonicate עבור s 5 × 30 בעוצמה 20 עם s 60 מרווחי זמן קירור.
- ספין lysate-g 5,250 x עבור 45 דקות לאסוף את תגובת שיקוע המכילים את האנזים TET2 מסיסים ועובר דרך 0.45-מיקרומטר מסנן לפני הטעינה במערכת FPLC.
הערה: בניסויים אלה, האנזים TET2 היה יציב מאוד, אבל אם יש צורך פרוטאז מעכב קוקטייל המכיל 1 מ benzamidine-HCl, 1 מ phenylmethylsulphonyl פלואוריד (PMSF) ו- 0.5 מ מ 1,10 -o- phenanthroline ניתן להוסיף לתא lysate כדי למנוע השפלה של האנזים TET2. הימנעו משימוש EDTA או EGTA בתוך החומר המדכא קוקטייל אלה עלולים להפריע כרומטוגרפיה קטיון הבאים. - חבילת 30 מ של שרף קטיון חזק לתוך עמודה FPLC. Equilibrate את העמודה עם 10 כרכים המיטה של מאגר לשטוף (מאגר MES 50 מ מ, ה-pH 6) בקצב זרימה מתמדת של 0.3 mL/דקה באמצעות מערכת FPLC.
- לטעון את שקופה lysate עמודה equilibrated מראש ועל לשטוף עם ∼10 מיטה כרכים של מאגר לשטוף עד הזרימה הופך ברור.
- Elute TET2 באמצעות 0-100% מעבר צבע מתוך המאגר לשטוף את המאגר • תנאי (מאגר MES 50 מ מ, ה-pH 6, 1 M NaCl) 15 כרכים מיטה ואחריו להחזיק מאגר • תנאי 100% עבור אמצעי אחסון שתי מיטות.
הערה: לאסוף דגימות (100 µL כל) של תא lysate לפני ואחרי עמודה טעינה יחד עם כל השברים • תנאי ולנתח על 10% לפתרון מרחביות-דף. - בריכה שברים המכיל חלבון TET2, ההקפאה יבש, להמיס משטחים אנזים 10 מ"ל מים, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
2. 5mC חמצון על ידי TET2 Dioxygenase
- לבצע כל התגובות demethylation שהפקידים עם 3 µg של מצע (DNA נטושים כפול 25-mer, בטבלה 2).
- להוסיף 100 µg של האנזים TET2 מטוהרים µL 50 התגובה הכולל מאגר המכיל 50 מ מ HEPES (pH 8.0), מכל 200 מיקרומטר4, 2 מ מ 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), ו- 2 מ מ ascorbate דגירה ב 37 ° C 1 h21.
- להרוות תגובות חמצון TET2 מזורז עם 5 µL של 500 מ מ EDTA.
- לאחר שכבתה תגובות TET2, להכין דוגמאות לניתוח LC-MS/MS על-ידי הפרדת ה-DNA של תערובת התגובה TET2 תוך שימוש בעמודות oligo טיהור.
- להוסיף 100 µL oligo איגוד מאגר 55 µL של תגובה מתרצה.
- בעקבות זאת, להוסיף 400 µL של 100% כוהל התערובת. להעביר את התערובת דרך עמודת איגוד oligo.
- רוחצים DNA מאוגד עם 750 מאגר לשטוף µL את elute במים µL 20.
- לעכל את ה-DNA מבודדות עם 2 יחידות של DNase אני ו- 60 יחידות של S1 נוקלאז ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות כדי לייצר nucleoside בודדים-monophosphates.
- בעקבות עיכול, להוסיף 2 יחידות של עגל phosphatase אלקליין מעיים (CIAP) הדגימות, תקופת דגירה של תוספת 12 שעות ב 37 ° C כדי להסיר את קבוצות פוספט מסוף nucleoside-monophosphates להשיג נוקלאוזידים.
- לכמת כל נוקלאוזידים, ששונה cytosines במיוחד, באמצעות השיטה LC-MS/MS המתוארות להלן.
3. פיתוח Assay LC-MS/MS-בסיס כמותי
- להכין 100 מיקרומטר פתרון מניות של כל נוקלאוזידים ציטוזין ששונה [5-מתיל-2 ′-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2 ′-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 ′-deoxycytidine (5fdC) ו- 5-carboxy-2 ′-deoxycytidine (5cadC)], הרגיל DNA בסיסים (אדנין, תימין, ציטוזין ו גואנין) במים HPLC-ציונים עבור הפיתוח של שיטת LC-MS/MS.
- מטב תלויי-nucleoside MS/MS פרמטרים על-ידי החדרת פתרונות מניות, אחד בכל פעם, בספקטרומטר מסה בספיקה של µL 10/min ב- EMS מצב הסריקה. מיטוב בעקבות פרמטרים: Declustering פוטנציאליים (DP), הכניסה פוטנציאליים (EP), התנגשות תא הכניסה פוטנציאליים (CEP), התנגשות אנרגיה (CE) ו התנגשות תא יציאה פוטנציאליים (CXP) כל שימוש nucleoside DNA אוטומטיות אופטימיזציה כמותיים תכונה של התוכנה.
- מטב תלויי-מקור MS/MS פרמטרים על-ידי שהזרקת µL 10 מניות פתרון באמצעות מעבר צבע עם 25% ממס B בספיקה של 0.3 mL לדקה היכן הממס A 10 מ מ אמוניום אצטט (pH 4.0) והוא ממיס B 20% acetonitrile עם 10 מ מ אמוניום אצטט (pH 4.0). למטב בעקבות פרמטרים: וילון גז (נוכ): 10-50, טמפרטורה: 0-600 º C, 1 זרימת גז (GS1): 0-50, 2 זרימת גז (GS2): 0-50, Collisionally מופעל דיסוציאציה (CAD): נמוכה-בינונית-גבוהה, יון לרסס מתח (IS): 4000-5500 עבור כל nucleoside הדנ א באמצעות ידני התכונה מיטוב כמותית של התוכנה במצב FIA (ניתוח הזרקת זרימה).
- כדי להפריד כל שמונה DNA נוקלאוזידים, לבצע כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות מעבר הצבע הבאים: 0% ממס B (0-2 דקות), 0-20% ממס B (2-5 דקות), 20-60% ממס B (5-9 דקות), 60-0% ממס B (9-10 דקות), ואז equilibrate עם הממס A עבור 5 דקות בספיקה של 0.3 mL/min על עמודה סי18 (גודל החלקיקים: 5 מיקרומטר, גודל הנקבוביות: 120 Å).
- באמצעות הפרמטרים MS/MS אופטימום (שלב 3.2 ו- 3.3) יחד עם המילוי ההדרגתי כרומטוגרפיה נוזלית הנ ל (שלב 3.4), לקבוע את התגובה ליניאריות, גבול של זיהוי (לוד), ואת הגבול התחתון של שימוש כמת (LLOQ) כפולה דילול טורי של תערובת 100 מיקרומטר סטנדרטית המכילה כל נוקלאוזידים שמונה. לצייר עיקולים סטנדרטי עבור כל נוקלאוזידים דנ א 8.
- לזהות ולכמת כל נוקלאוזידים, במיוחד ששונה cytosines, מיוצר שלב 2.4 באמצעות שיטת LC-MS/MS רגיל עקומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שינוי דינמי של 5mC ב- DNA על-ידי dioxygenases ט-המשפחה ממלאת תפקידים חשובים בתקנות תעתיק epigenetic. TET2 dioxygenase הוא מוטציה בתדירות גבוהה מגוונות ממאירות hematopoietic12. כדי לחקור את התפקיד של האנזים TET2 להתפתחות התקינה, מחלה, לנו יש משובטים המחשבים catalytically פעיל מינימלי ללא כל זיקה תג לתוך וקטור pDEST1422. Dioxygenase TET2 לא מתויגת ב ∼5% חלבון מסיס הכולל מפיקי מרחביות-דף ניתוח בקטריאלי e. coli BL21 תאים (DE3). מאז תחום קטליטי של TET2 יש גבוהה יחסית איזואלקטרית (∼7.49), לעומת ביותר הילידים e. coli חלבונים24,25,26, תהליך טיהור יעיל ניצול הקטיון חילופי גזים פותחה. טיהור זה הניב > 90% אנזים TET2 טהור בשלב אחד (איור 1).
כדי להפריד בין לכמת נגזרים deoxycytidines שונות, ארבע טבעי DNA בסיסים אחרים בעקבות התגובה אנזימטי TET2, עבור אופטימיזציה assay רגיש LC-MS/MS-מבוסס. כרומטוגרפיה נוזלית בשימוש של עמודות סי18 הפוך-פאזי. עקומות סטנדרטי נמשכו באמצעות דילולים טורי של תערובת המכילה כל נוקלאוזידים (איור 2). המילוי ההדרגתי המשמש עבור כרומטוגרפיה נוזלית, שמתואר בהליך ניסיוני, הצליח לפתור כל שמונה נוקלאוזידים (איור 3). השמירה LC פעמים (tr) עבור כל נוקלאוזידים שמונה מתוארים בטבלה3. אנחנו עוד יותר ממוטב הגילוי MS של כל הורה יון nucleoside (Q1), יון האינטנסיבי ביותר המוצר (Q3) על-ידי קביעת פוטנציאל declustering (DP) שלהם, פוטנציאל הכניסה (EP), התנגשות תא הכניסה פוטנציאליים (CEP), אנרגיית התנגשות (CE), גבול של זיהוי (לוד), הגבול התחתון של כימות (LLOQ) (טבלה 3). בסופו של דבר, פותחה שיטה LC-MS/MS זה יכול להפריד ולכמת את ארבעת הרגיל DNA בסיסים (A, T, G ו- C), כמו גם ארבעה בסיסי ציטוזין ששונתה (5-מתיל, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, 5-carboxyl) (איור 3).
הפעילות של dioxygenase TET2 לא מתויגות נקבע באמצעות dsDNA 25-מר המכיל 5mC אחד באי CpG בתוך כל צירוף ד. נ (טבלה 2). לאחר TET2 אנזימטיות, DNA oligonucleotides טהור, שהוסב נוקלאוזידים. ואז נוקלאוזידים האלה היו נענשים assay LC-MS/MS. בתגובות בלי האנזים TET2 (בקרה שלילית), נצפו רק פסגות dA, dT, די. ג'י, dC, ו- 5mdC. עם זאת, בעקבות תגובות בקרה חיובית, אשר הכיל את dioxygenase TET2, נצפו שני לשיאים חדשים המתאימים d5hmC ו- d5fC. לא הצלחנו לזהות את היווצרות d5caC nucleoside כנראה עקב רמות זיהוי המסכן שלה (איור 2). תוצאות אלו ממחישות כי dioxygenase TET2 לא מתויגות מטוהרים בהליך זה פעיל catalytically, יכול לשמש כדי לאפיין את האנזים wt-TET2 ומוטציות הקליניים שלה.
איור 1. ניתוח מרחביות-דף של מטוהרים dioxygenase TET2 מ- e. coli BL21 תאים (DE3). ליין A מציין סמן תוך ליין ש-b מציין TET2 חלבון מטוהרים באמצעות שרף חילוף יונים sepharose SP. הגודל הכולל של dioxygenase TET2 לא מתויגות הוא ∼54 kDa כפי שמציין החץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. עקומות רגיל היה צייר עבור ארבע טבעי נוקלאוזידים DNA ו ציטוזין שונים נגזרים, ששימשו לאחר מכן על כימות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. כרומטוגרפיה נוזלית (למטה) ו- MS/MS (מעל) השיטה נעשה שימוש כדי להפריד ולאפיין ארבע נוקלאוזידים DNA טבעי ונגזרות שונות ציטוזין.
| פריימר שם | פריימר רצף | |||
| פריימר לפנים TET2 | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 פריימר הפוכה | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
טבלה 1: רצף DNA לנוקלאוטידים המשמש PCR הגברה של המחשבים קטליטי של dioxygenase TET2 אנושיות לא מתויגות.
| פריימר שם | פריימר רצף |
| הגיוני סטרנד | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| סטרנד antisense | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
בטבלה 2: רצף חוש וחוש אנטי-25-מר dsDNA oligonucleotide משמש מצע TET2 במבחנה תגובות חמצון.
| נוקלאוזידים | Q1 | Q3 | tr (דקות) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | לסה נ (V) | לוד (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0.06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0.33 | 0.998 | |
| 5-מתיל-2'-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-carboxy-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
טבלה 3: פרמטרים LC-MS/MS אופטימיזציה של ארבעה נוקלאוזידים DNA טבעי ונגזרות שונות ציטוזין במצב יון חיובי. עבור כל nucleoside יון האב (Q1), זוהה יונים המוצר האינטנסיבי ביותר (Q3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מוטציות בגן TET2 הם חלק לשינויים גנטיים שזוהו בתדירות הגבוהה ביותר בחולים עם ממאירויות hematopoietic מגוונות. עד כה מאות של מוטציות TET2 שונים, הכוללים שטויות, מסגרת-shift ו missense מוטציות, זוהו חולים12. חולים עם מוטציות TET2 מראים רמות נמוכות של 5hmC גנומית במח העצם בהשוואה לאלו עם wt-TET214. TET2 מוטציה בטוק הניסויים יש recapitulated את ההשפעות של מוטציות אלה ברמות 5hmC תאים transfected14. תוצאות TET2-נוקאאוט העכבר מודלים הוכיח כי רמת האנזים TET2 הפוך בקורלציה עם ההתקדמות של מחלות ממאירות hematopoietic17,18,19,20. באופן עקבי, ג'אנג. et al. לאחרונה הפגינו הזה למטה-ויסות TET2 רמות הביטוי הוא סמן prognostic, ניבוי פוטנציאליים cytogenetically נורמלי לוקמיה מיאלואידית חריפה27.
למרות עדויות TET2 ממלא תפקיד מהותי hematopoiesis נורמלי וטרנספורמציה מיאלואידית, איפיון ביוכימי של wt, מוטציה TET2 נשארים שלבים בסיסיים עקב קשיים הקשורים בייצור TET2 פעיל ואת וזמינותו שלה. רוב המחקרים יצרו מערכת baculovirus רקומביננטי TET2 גם שימוש זמן רב תאים חרקים14, או כמו של גלוטתיון תג זיקה S-טרנספראז בתאי חיידקים אשר דורש הסרה של זיקה תג21.
בהליך זה ניסיוני, אנחנו תיאר את שכפול של לא מתויגות האנושי TET2 dioxygenase קטליטי המחשבים באמצעות טכניקה רקומבינציה בייעודי לאתר לבין ביטויה יעיל באמצעות וקטור היעד (pDEST14) ב- e. coli. כי נקודה איזואלקטרית של TET2 לא מתויגות היא גבוהה יחסית (∼7.49) לעומת חלבונים e. coli ביותר הילידים, פיתחנו תהליך טיהור יעיל ניצול כרומטוגרפיה קטיון מניב > 90% טהור לא מתויגות TET2 אנזים בשלב אחד.
אתגרים נוספים, נוספים קיימים כימות של wt - מוטציה TET2 dioxygenase פעילות. לניסויים אלה, רוב המחקרים צריכים לסמוך על מבחני נוגדן מבוססי כגון נקודה-שהכלים14,28, מקושרים-אנזים immunosorbent מבחני (אליסה)29, וכו ' כי מבחני אלה בדרך כלל להשתמש נוגדן אחד בלבד, למשל, 5hmC או or5caC 5fC, גילוי של 5mC שינוי בהמצע הדנ א, הם לא מספקים תמונה מלאה של התגובה קטליטי נישא על ידי ט איזופורמים. מסיבות אלו, התפתחה וזמינותו LC-MS/MS מבוססי וזמינותו בלבד כדי לכמת את השינויים ציטוזין שונים. בהקשר זה, פיתחנו שיטת כרומטוגרפיה נוזלית הרומן להפריד את ארבעת הרגיל DNA בסיסים (A, T, G ו- C), כמו גם ארבעה בסיסי ציטוזין ששונתה (5mC, 5hmC, 5 fC ו 5caC).
כדי לכמת את נוקלאוזידים שמונה מן התגובות TET2 מזורז, לנו יש בשילוב שיטת כרומטוגרפיה נוזלית משופר שלנו עם ספקטרומטר מסה טנדם. Assay LC-MS/MS רגיש הזה היה מנוצל ואז לקבוע את הפעילות של האנזים רקומביננטי TET2 לא מתויגות אנושי. הגישה המתוארת כאן יהיה מאוד לשפר את ההערכה של wt - מוטציה TET2 dioxygenase ופעילויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אינטרסים כלכליים לא להכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי לנו משרד ההגנה בדמות בפרס Idea (W81XWH-13-1-0174), אנמיה אפלסטית & מענק קרן MDS, ותודה UMRB גרנט למחברים ועותרת מוהיט Jaiswal ו Subhradeep Bhar שכפול הראשונית של TET2 ב pDEST14 וקטורית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
