Summary
Vi præsenterer her, en protokol for en effektiv enkelt trin rensning af den aktive ukodede menneskelige ti-elleve omplantning-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase ved hjælp af ion-udveksling kromatografi og sin analyse ved hjælp af en liquid chromatography-tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS)-baseret tilgang.
Abstract
Forordningen epigenetiske transskription medieret af 5-methylcytosine (5mC) har spillet en afgørende rolle i eukaryote udvikling. Demetylering af disse epigenetiske mærker opnås ved sekventiel oxidation af ti-elleve translokation dioxygenases (TET1-3), efterfulgt af thymin-DNA glycosylase-afhængige base excision reparation. Inaktivering af TET2 gen som følge af genetiske mutationer eller af andre epigenetiske mekanismer er forbundet med en dårlig prognose hos patienter med forskellige former for kræft, især hæmatopoietisk maligniteter. Her beskriver vi en effektiv enkelt trin rensning af enzymaktive ukodede menneskelige TET2 dioxygenase ved hjælp af kationbytter kromatografi. Vi giver yderligere en liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) tilgang, der kan adskille og kvantificere de fire normale DNA-baser (A, T, G og C), samt de fire ændrede cytosin baser (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl). Denne analyse kan anvendes til at evaluere aktiviteterne vildtype og mutant TET2 dioxygenases.
Introduction
Cytosin baser i CpG dinucleotides C5 stilling er den fremherskende methylering site (5mCpG) i pattedyr genomer1. Derudover en række nylige undersøgelser har afsløret omfattende C5 cytosin methylering (5mC) i ikke-CpG websteder (5mCpH, hvor H = A, T, eller C)2,3. 5mC ændring fungerer som en transcriptional lyddæmper på endogene retrotransposons og gen initiativtagere3,4,5. DNA methylering på 5mC også spiller vigtige roller i X-kromosom Inaktiveringen, gen prægning, nukleare omprogrammering og væv-specifikke gen expression5,6,7. Methylering af cytosin startposition C5 er udført af DNA methyltransferases, og mutationer i disse enzymer forårsager betydelige udviklingsmæssige defekter8. Fjernelse af 5mC mærker er initieret af TET1-3 5mC oxidases9,10. Disse TET-familien dioxygenases konvertere 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) ved sekventiel oxidation trin11,12,13. Endelig, thymin-DNA glycosylase erstatter 5fC eller 5caC til umodificeret cytosin ved hjælp af base excision reparation vej11.
Det menneskelige TET2 gen var identificeret som en ofte muterede gen i forskellige hæmatopoietisk maligniteter herunder myelodysplastisk syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative neoplasmer ( MDS-MPN), og akut myeloid leukæmi (AML) med oprindelse fra MDS og MDS-MPN16. 5hmC ændring i knoglemarven DNA er lavere hos patienter med TET2 mutationer i forhold til dem med vildtype (wt)-TET214. En række grupper har udviklet TET2-knockout musemodeller for at belyse sin rolle i normal bloddannelsen og myeloide transformation17,18,19,20. Disse mus med mutationer i TET2 genet blev oprindeligt normale og levedygtig, men manifesterede forskelligartede hæmatopoietisk maligniteter, som de i alderen forårsager deres tidlige død. Disse undersøgelser viste den vigtige roller spilles af wt-TET2 i normale hæmatopoietisk differentiering. I disse musemodeller, heterozygous hæmatopoietisk stamceller (TET2+/- HSCs) og homozygote TET2- / - havde HSCs en konkurrencemæssig fordel over homozygot wt-TET2 HSCs i genopretning hæmatopoietisk lineages som begge TET2+/- og TET2- / - HSCs udviklet forskellige hæmatopoietisk maligniteter17,18. Disse undersøgelser viser, at haploinsufficiency af TET2 dioxygenase ændrer udviklingen af HSCs og resulterer i hæmatopoietisk maligniteter.
Svarende til mus med mutationer i TET2 genet, de fleste leukæmi patienter manifestere haploinsufficiency af TET2 dioxygenase aktivitet. Disse for det meste heterozygous somatiske mutationer omfatter ramme-Skift og nonsens mutationer spredt TET2 gen kroppen mens missense mutationer, der er mest grupperet i dioxygenase domæne12. Til dato, er lille karakterisering af wt - og mutant-TET2 rapporteret i litteraturen primært på grund af vanskeligheder med produktionen af TET2 dioxygenase og dens assay21. Her rapporterer vi en enkel trinvis rensning af indfødte TET2 dioxygenase ved hjælp af ionbyttende kromatografi. Desuden var en kvantitativ LC-MS/MS analyse optimeret og bruges til at måle den enzymatiske aktivitet af indfødte TET2 dioxygenase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning og rensning af ukodede menneskelige TET2 Dioxygenase
- Klone humane TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) til den pDEST14 destination vektor ved hjælp af lokationsspecifikke rekombination teknik som tidligere beskrevet22.
Bemærk: Tidligere undersøgelser har vist, at C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domæne er minimal katalytisk aktive domæne21,23. For at udtrykke de ukodede TET2 dioxygenase domæne ved hjælp af pDONR221 vektor, blev skinne Dalgarno og Kozak sekvenser indarbejdet i den fremadrettede primer under PCR (tabel 1). - For bakteriel omdannelse, tilføje 1 µL af rekombinante pDEST14 udtryk vektor indeholdende ukodede menneskelige TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) til 100 µL af kemisk kompetente E. coli BL21 (DE3) celler i en 1,7 mL tube. Holde blandingen på køl i mindst 15 minutter fulgt af heat shock på 42 ° C til 30 s i et vandbad.
- Umiddelbart efter varme chok, holde cellerne tilbage på isen for mindst 2 min. Efter dette, skal du tilføje 250 µL af super optimal bouillon med catabolite undertrykkelse (S.O.C media) til cellerne. Inkuber bakterieceller i 1 timer ved 37 ° C i en shaker.
- Efter inkubationen spin ned celler ved centrifugering tube på 9.000 x g i 1 min. udsmid 70% supernatanten af pipettering og opløse pellet i venstre over medier.
- Sprede cellesuspension på en Luria bouillon (LB) agar plade med 100 µg/mL ampicillin. Inkuber plade i 16 timer ved 37 ° C.
- Vælg en isoleret koloni og podes det til 10 mL af LB-ampicillin medier i en 50 mL tube. Inkuber rør ved 37 ° C i en shaker til natten. Efter dette, skal du bruge 100 µL af kultur fra 50 mL tube til podes 100 mL af LB-ampicillin medier. Inkuber i kolben ved 37 ° C på en shaker på 180 rpm og bruge det som primær kultur. Næste dag, bruge 6 mL af primære kultur til podes 15 kolber, hver indeholdende 600 mL LB-ampicillin medier. Nu, Inkuber 15 kolber ved 37 ° C på en shaker på 180 rpm.
Bemærk: For at kontrollere transformerede kloner, udføre DNA-sekventering eller begrænsning fordøjelse med den isolerede plasmid DNA. - For at kontrollere tætheden af bakteriekulturen, måle dets OD600 bruger et spektrofotometer. Efter kulturen når en massefylde på 0,8 på OD600, inducerer udtryk af TET2 protein med 300 µL 1 M (endelig koncentration på 0,5 mM i 600 mL) IPTG i hver kolbe og yderligere vokse kultur for 16t på 17 ° C.
- Efter 16 h, overføre bakteriekulturen til centrifuge flasker. Der centrifugeres bakteriekulturen udtrykker TET2 enzymet ved 5,250 x g i 45 min. Brug den bakterielle pellet for TET2 rensning.
Bemærk: Udfør alle resterende protein oprensning skridt på isen eller ved 4 ° C. - Bakteriel resuspenderes i 100 mL 50 mm MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre) buffer, pH 6 og Rens med ultralyd i 5 × 30 s på power 20 med 60 s afkøling mellemrum.
- Spin den lysate ved 5,250 x g i 45 min. indsamle supernatanten der indeholder opløselige TET2 enzymet og passere gennem 0,45 µm filtre før pålæsning på et FPLC system.
Bemærk: I disse eksperimenter, TET2 enzym var meget stabil, men hvis det er nødvendigt en protease hæmmer cocktail indeholdende 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 0,5 mM 1,10 -o- phenanthroline kan føjes til celle lysate til forhindre nedbrydning af TET2 enzym. Undgå at bruge EDTA eller EGTA i den hæmmer cocktail, da disse kan forstyrre den følgende kationbytter chromatografi. - Pack 30 mL af en stærk kationbytter harpiks i en kolonne, FPLC. Blandingen henstår kolonnen med 10 bed mængde vaskebuffer (50 mM MES buffer, pH 6) ved en konstant gennemstrømningshastighed på 0,3 mL/min. ved hjælp af et FPLC system.
- Indlæse den klarede lysate på forhånd afbalancerede kolonne og vask med ∼10 bed mængde vaskebuffer indtil strømmen gennem bliver klar.
- Elueres TET2 ved hjælp af en 0-100% gradient fra wash buffer til eluering buffer (50 mM MES buffer, pH 6, 1 M NaCl) i 15 bed mængder efterfulgt af bedriften ved 100% eluering buffer for to-sengs diskenheder.
Bemærk: Indsamle prøver (100 µL) af cellen lysate før og efter kolonnen lastning sammen med alle eluering fraktioner og analysere på 10% løsning af SDS-PAGE. - Pool fraktioner der indeholder TET2 protein, fryse tør, opløse enzym Palle i 10 mL vand og opbevares ved-80 ° C.
2. 5mC Oxidation af TET2 Dioxygenase
- Udføre alle demetylering reaktioner i tre eksemplarer med 3 µg af substrat (25-mer dobbelt strandede DNA, tabel 2).
- Tilføj 100 µg renset TET2 enzym i 50 µL af samlede reaktion buffer indeholdende 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarat), og 2 mM Ascorbat og inkuberes ved 37 ° C i 1 h21.
- Dæmpning af TET2 katalyseret oxidation reaktioner med 5 µL af 500 mM EDTA.
- Efter dæmper TET2 reaktioner, forberede prøverne for LC-MS/MS analyse af adskiller DNA fra TET2 reaktionsblanding ved hjælp af oligo rensning kolonner.
- Tilføje 100 µL af oligo binding buffer til 55 µL af bratkølet reaktion.
- Efter dette, skal du tilføje 400 µL af 100% ethanol til blandingen. Videregive denne blandingen gennem en oligo bindende kolonne.
- Vaske bundne DNA med 750 µL wash buffer og elueres i 20 µL vand.
- Fordøje det isolerede DNA med 2 enheder af DNase jeg og 60 enheder af S1 nukleasen ved 37 ° C i 12 timer at producere individuelle nucleoside-monophosphates.
- Efter fordøjelse, tilføje 2 enheder af kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIAP) i prøverne og Inkuber i tilføjelse 12t ved 37 ° C til at fjerne terminal fosfat-grupper fra nucleoside-monophosphates at opnå Nukleosider.
- Kvantificere alle Nukleosider, især modificerede cytosines, ved hjælp af LC-MS/MS metoden beskrevet nedenfor.
3. kvantitative LC-MS/MS-baseret analyse udvikling
- Forberede 100 µM stamopløsning af alle modificerede cytosin Nukleosider [5-methyl-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) og 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] og normale DNA baser (adenin, thymin, cytosin og guanin) i vand af HPLC-renhed for udvikling af metoden LC-MS/MS.
- Optimere nucleoside-afhængige MS/MS parametre ved infusion af stamopløsninger, en ad gangen, i massespektrometer med en væskehastighed på 10 µL/min i EMS scan mode. Optimere efter parametre: Declustering potentielle (DP), indgangen potentielle (EP), kollision celle indgangen potentielle (CEP), kollisionen energi (CE) og kollision celle Exit potentielle (CXP) for hver DNA nucleoside ved hjælp af automatiseret kvantitative optimering funktionen af softwaren.
- Optimere kilde-afhængige MS/MS parametre ved at indsprøjte 10 µL af stamopløsningen ved hjælp af en gradient med 25% opløsningsmiddel B med en væskehastighed på 0,3 mL/min. hvor opløsningsmiddel A er 10 mM ammoniumacetat (pH 4,0) og opløsningsmiddel B er 20% acetonitril med 10 mM ammoniumacetat (pH 4.0). Optimere efter parametre: gardin Gas (CUR): 10-50, temperatur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktiveret Dissociation (CAD): lav-Medium-høj, Ion spray spænding (IS): 4000-5500 for hver DNA nucleoside ved hjælp af manuel kvantitative optimering funktionen af softwaren i FIA (Flow injektion analyse) tilstand.
- For at adskille alle otte DNA Nukleosider, udføre væskekromatografi ved hjælp af de følgende forløb: 0% opløsningsmiddel B (0-2 min.), 0-20% opløsningsmiddel B (2-5 min), 20-60% opløsningsmiddel B (5-9 min), 60-0% opløsningsmidler B (9-10 min) og derefter reagensglasset med opløsningsmiddel A i 5 min. med en væskehastighed på 0,3 mL/min. på en C18 kolonne (partikelstørrelse: 5 µm, Pore størrelse: 120 Å).
- Bruger de optimale MS/MS parametre (trin 3.2 og 3.3) kombineret med ovennævnte væskekromatografi gradient (trin 3,4), bestemme svar linearitet, detektionsgrænsen (LOD) og nedre grænse for kvantificering (LLOQ) ved hjælp af en dobbelt seriel fortynding af en 100 µM standard blanding, der indeholder alle otte Nukleosider. Tegne standard kurver for alle otte DNA Nukleosider.
- Detektere og kvantificere alle Nukleosider, især modificerede cytosines, produceret i trin 2.4 ved hjælp af LC-MS/MS metoden og standard kurver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dynamisk ændring af 5mC i DNA af TET-familien dioxygenases spiller vigtige roller i epigenetiske transcriptional forordninger. TET2 dioxygenase er ofte muteret i forskellige hæmatopoietisk maligniteter12. For at undersøge rollen, som TET2 enzymet i normal udvikling og sygdom, har vi klonet sit minimal katalytisk aktive domæne uden nogen affinitet tag i pDEST14 vektor22. De ukodede TET2 dioxygenase blev produceret på ∼5% af den samlede opløseligt protein af SDS-PAGE analyse i bakteriel E. coli BL21 (DE3) celler. Da den katalytiske domæne af TET2 har en relativt høj isoelektriske punkt (∼7.49), sammenlignet med de fleste indfødte E. coli proteiner24,25,26, en effektiv rensningsproces udnytter en kation Exchange chromatografi blev udviklet. Denne rensning givet > 90% ren TET2 enzym i et enkelt trin (figur 1).
For at adskille og kvantificere forskellige deoxycytidines derivater og andre fire naturlige DNA-baser efter TET2 enzymatisk reaktion, blev en følsom LC-MS/MS-baseret analyse optimeret. Den væskekromatografi anvendes en omvendt fase C18-kolonner. Standard kurver blev udarbejdet ved hjælp af serielle fortyndinger af en blanding, der indeholder alle Nukleosider (figur 2). Den graduering, der benyttes til højpræstationsvæskekromatografi, beskrevet i eksperimentel procedure, var i stand til at løse alle otte Nukleosider (figur 3). LC opbevaring gange (tr) for alle otte Nukleosider er beskrevet i tabel 3. Vi yderligere optimeret MS påvisning af hver forælder ion nucleoside (Q1), den mest intense produkt ion (Q3) ved at bestemme deres declustering potentiale (DP), indgangen potentiale (EP), kollision celle indgangen potentielle (CEP), kollisionen energi (CE), begrænsning af påvisning (LOD), og nedre grænse for kvantificering (LLOQ) (tabel 3). Endelig en LC-MS/MS metoden blev udviklet, kan adskille og kvantificere de fire normale DNA-baser (A, T, G og C), samt de fire ændrede cytosin baser (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl) (figur 3).
Aktiviteten af ukodede TET2 dioxygenase blev bestemt ved hjælp af en 25-mer dsDNA indeholdende én 5mC i en CpG ø i hver DNA strand (tabel 2). Efter TET2 enzymatiske reaktioner, blev DNA oligonukleotider renset og omdannet til Nukleosider. Derefter blev disse Nukleosider udsat for LC-MS/MS analyse. I reaktioner uden TET2 enzym (negativ kontrol), blev kun dA, dT, GD, dC og 5mdC toppe observeret. Men i den positive kontrol reaktion, som indeholdt TET2 dioxygenase, to nye toppe svarende til d5hmC og d5fC blev observeret. Vi har ikke kunnet påvise dannelsen af d5caC nucleoside muligvis på grund af sin fattige påvisning niveauer (figur 2). Disse resultater viser, at de ukodede TET2 dioxygenase renset i denne procedure er katalytisk aktive og kan bruges til at karakterisere wt-TET2 enzym og dens kliniske mutanter.
Figur 1. SDS-PAGE analyse af renset TET2 dioxygenase fra E. coli BL21 (DE3) celler. Lane A angiver markør mens lane B angiver TET2 protein renset ved hjælp af SP sepharose ionbytteren. Den samlede størrelse af de ukodede TET2 dioxygenase er ∼54 kDa som angivet med pilen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Standard kurver var uafgjort for fire naturlige DNA Nukleosider og forskellige cytosin derivater, som blev derefter brugt for deres kvantificering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Væskekromatografi (nederst) og MS/MS (ovenfor), der bruges til at adskille og karakterisere fire naturlige DNA Nukleosider og forskellige cytosin derivater.
| Primer navn | Primer sekvens | |||
| TET2 fremad primer | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Omvendt Primer | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tabel 1: Sekvens af DNA oligonukleotid primere anvendes til PCR-amplifikation af det katalytiske domæne af ukodede menneskelige TET2 dioxygenase.
| Primer navn | Primer sekvens |
| Forstand Strand | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Antisense Strand | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tabel 2: Sekvens af den følelse og antisense 25-mer dsDNA oligonukleotid anvendes som TET2 substrat til in vitro- oxidation reaktioner.
| Nukleosider | Q1 | Q3 | tr (min) | DP (V) | EUROPA-PARLAMENTET (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252.2 | 136.1 | 12,07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10,95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228.1 | 112.1 | 6,29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0,1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-methyl-2'-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9,85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0,03 | 0,1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-carboxy-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tabel 3: Optimeret LC-MS/MS parametre af fire naturlige DNA Nukleosider og forskellige cytosin derivater under positiv ion mode. For hver overordnet ion nucleoside (Q1), blev den mest intense produkt ion (Q3) fundet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutationer i TET2 genet er nogle af de hyppigst fundne genetiske forandringer hos patienter med forskellige hæmatopoietisk maligniteter. Til dato hundredvis af forskellige TET2 mutationer, som omfatter nonsens, ramme-Skift og missense mutationer, er blevet identificeret i patienter12. Patienter med TET2 mutationer viser lave niveauer af genomisk 5hmC i knoglemarven sammenlignet med dem med wt-TET214. Mutant TET2 knock-i eksperimenter har sammenfattet virkningerne af disse mutationer på 5hmC niveauer i transfekteret celler14. Resultater fra TET2-knockout musemodeller viste, at niveauet for TET2 enzym omvendt korreleret med progression af hæmatopoietisk maligniteter17,18,19,20. Konsekvent, Zhang et al. for nylig vist, at ned-regulering af TET2 udtryk niveauer er en potentiel prognostiske og prædiktive biomarkør i cytogenetically normale akut myeloid leukæmi27.
Trods voksende beviser at TET2 spiller en grundlæggende rolle i normal bloddannelsen og myeloide transformation, biokemiske karakterisering af wt- og mutant TET2 forbliver på rudimentære stadier på grund af problemerne i forbindelse med fremstilling af aktive TET2 og dens assay. De fleste undersøgelser har produceret rekombinante TET2 enten ved hjælp af tidskrævende baculovirus system i insekt celler14, eller som en glutathion S-transferase affinitet tag i bakterieceller, der kræver fjernelse af affinitet tag21.
Vi beskrev i denne forsøgsmetoden kloning af ukodede menneskelige TET2 dioxygenase katalytiske domæne ved hjælp af en lokationsspecifik rekombination teknik og dens effektive udtryk ved hjælp af destination vektor (pDEST14) i E. coli. Fordi det isoelektriske punkt af ukodede TET2 er relativt høj (∼7.49) sammenlignet med de fleste indfødte E. coli proteiner, vi udviklet en effektiv rensningsproces udnytter en kationbytter kromatografi giver > 90% ren umærkede TET2 enzym i et enkelt trin.
Yderligere, ekstra udfordringer findes i kvantificering af wt- og mutant TET2 dioxygenase aktivitet. For disse forsøg, og de fleste undersøgelser har påberåbt sig antistof-baserede assays såsom dot-blotting14,28, enzym-forbundet immunosorbent undersøgelser (ELISA)29, osv. , fordi disse assays generelt bruger kun én antistof, f.eks. 5hmC eller 5fC or5caC, til påvisning af 5mC ændring i substrat DNA, de ikke giver et fuldstændigt billede af den katalytiske reaktion foretaget af TET isoformer. Af disse grunde fremstod LC-MS/MS-baseret analysen som den eneste assay til at kvantificere forskellige cytosin ændringer. I denne forbindelse har vi udviklet en roman væskekromatografi metode, der kan adskille de fire normale DNA-baser (A, T, G og C), samt de fire ændrede cytosin baser (5mC, 5hmC, 5 fC og 5caC).
For at kvantificere de otte Nukleosider fra TET2 katalyserede reaktioner, har vi koblet vores forbedrede væskekromatografi metode med tandem massespektrometri. Denne følsomme LC-MS/MS analyse var derefter udnyttet til at bestemme aktivitet af rekombinant ukodede menneskelige TET2 enzym. Metoden beskrevet her vil i høj grad forbedre evalueringen af wt- og mutant TET2 dioxygenase aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af det amerikanske forsvarsministerium i form af en idé Award (W81XWH-13-1-0174), Aplastisk anæmi & MDS Foundation Grant, og UMRB tilskud til M.M. Authors takker Mohit Jaiswal og Subhradeep Bhar for oprindelige kloning på TET2 pDEST14 vektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
