Summary
Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.
Abstract
La regulación epigenética de la transcripción mediada por la 5-METILCITOSINA (5mC) ha desempeñado un papel crítico en el desarrollo de eucariota. Desmetilación de estas marcas epigenéticas se logra por oxidación secuencial de diez-once desplazamiento dioxygenases (TET1-3), seguido de la timina ADN glicosilasa dependiente supresión base reparación. Inactivación del gen TET2 debido a mutaciones genéticas o por otros mecanismos epigenéticos se asocia con un pronóstico pobre en pacientes con diversos tipos de cáncer, especialmente de malignidades hematopoyéticas. Aquí, describimos una purificación eficiente solo paso de enzimáticamente activa sin etiquetar dioxigenasa de TET2 humana usando la cromatografía de intercambio catiónico. Además ofrecemos un enfoque líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que se puede separar y cuantificar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, 5-formil y 5-carboxilo). Este ensayo puede utilizarse para evaluar la actividad de tipo salvaje y mutante TET2 dioxygenases.
Introduction
La posición C5 de bases de citosina en los dinucleótidos CpG es el sitio predominante de metilación (5mCpG) en genomas mamíferos1. Además, varios estudios recientes han descubierto extensa metilación de citosina de C5 (5mC) en sitios de CpG no (5mCpH, donde H = A, T, o C)2,3. modificación de la 5mC sirve como un silencioso transcripcional en retrotransposones endógeno y genes promotores3,4,5. La metilación del ADN en 5mC también juega un papel importante en la inactivación del cromosoma X, impresión de gene, reprogramación nuclear y expresión de genes específicos de tejido5,6,7. Metilación de la citosina en la posición C5 se lleva a cabo por las ADN metiltransferasas, y las mutaciones en estas enzimas causan defectos de desarrollo significativo8. La eliminación de las marcas de 5mC iniciada por TET1-3 5mC oxidasas9,10. Estos dioxygenases de TET-familia convertir 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidación secuencial pasos11,12,13. Finalmente, reemplaza a timina ADN glicosilasa fC 5 o 5caC de citosina no modificado usando la base de la supresión reparación vía11.
El gene humano de TET2 fue identificado como un gen mutado con frecuencia en diversas neoplasias hematopoyéticas incluyendo myelodysplastic (MDS) los síndromes14,15,16, (neoplasias mieloproliferativas MDS MDS-MPN) y la leucemia mieloide aguda (AML) originarios del MDS y MDS-MPN16. Los niveles de modificación de 5hmC en la médula ósea ADN son menores en pacientes con mutaciones TET2 comparadas con aquellos con el tipo salvaje (wt)-TET214. Varios grupos han desarrollado modelos de ratón knockout TET2 para aclarar su papel en la hematopoyesis normal y transformación mieloide17,18,19,20. Estos ratones con mutaciones en el gen TET2 fueron inicialmente normal y viable, pero se manifiesta diversas malignidades hematopoyéticas como ellos de años causando su temprana muerte. Estos estudios demostraron el importante papel desempeñado por la wt TET2 en diferenciación Hematopoyética normal. En estos modelos de ratón, las células madre hematopoyéticas heterozigóticas (TET2+- HSCs) y homocigótica TET2- / - HSCs tenían una ventaja competitiva sobre homocigotos wt-TET2 HSCs en repoblación linajes hematopoyéticos como ambos TET2+- y TET2- / - HSCs desarrolló diversas malignidades hematopoyéticas17,18. Estos estudios demuestran el haploinsufficiency de TET2 dioxygenase altera el desarrollo de HSCs y resultados de las malignidades hematopoyéticas.
Similar a los ratones con mutaciones en el gen TET2, la mayoría de pacientes con leucemia manifiestan haploinsufficiency de TET2 dioxygenase actividad. Estas mutaciones somáticas principalmente heterozigóticas incluyen mutaciones de cambio del marco y absurdo dispersadas por todo el cuerpo de gene TET2 mientras que las mutaciones sin sentido que están más agrupados en el dioxygenase dominio12. Hasta la fecha, poca caracterización de wt y mutante TET2 es divulgado en la literatura principalmente debido a las dificultades con la producción de TET2 dioxigenasa y su ensayo21. Aquí, Divulgamos una simple purificación solo paso de nativo dioxygenase TET2 mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, un ensayo LC-MS/MS fue optimizado y utilizado para medir la actividad enzimática del dioxygenase TET2 nativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. clonación y purificación del Dioxygenase TET2 humano sin etiquetar
- Clon humano TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) en el vector de destino de pDEST14 utilizando la técnica de recombinación específica del sitio como se describió anteriormente22.
Nota: Estudios previos han demostrado que el dominio C-terminal TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) es el dominio catalítico activo mínimo21,23. Para expresar el dominio sin etiquetar de dioxygenase TET2 utilizando el vector de pDONR221, secuencias Shine Dalgarno y Kozak se incorporaron en el primer avance durante PCR (tabla 1). - Para la transformación bacteriana, añadir 1 μl de vector de la expresión de pDEST14 recombinante que contiene humano dioxygenase TET2 sin etiquetar (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) a 100 μl de químicamente competentes de e. coli BL21 (DE3) las células en un tubo de 1,7 mL. Mantener la mezcla en hielo durante al menos 15 minutos seguido por choque térmico a 42 ° C para 30 s en un baño de agua.
- Inmediatamente después del choque del calor, mantener las células en hielo para mínimo de 2 minutos. A continuación, Añadir 250 μl de caldo super óptima con represión catabólica (S.O.C medios) a las células. Incube las células bacterianas por 1 h a 37 ° C en un agitador.
- Después de la incubación, desactivación de las células por centrifugación del tubo a 9.000 x g durante 1 min descartar sobrenadante de 70% mediante pipeteo y disolver el pellet en la izquierda sobre los medios de comunicación.
- Extender la suspensión de células en una placa de agar Luria caldo (LB) que contiene 100 ampicilina μg/mL. Incubar la placa de 16 h a 37 ° C.
- Seleccionar una colonia aislada e inocular en 10 mL de medio LB-ampicilina en un tubo de 50 mL. Incubar el tubo a 37 º C en un agitador para pasar la noche. A continuación, utilice 100 μl del cultivo desde el tubo de 50 mL para inocular 100 mL de medio LB-ampicilina. Incube el frasco a 37 ° C en un agitador a 180 rpm y usarlo como cultivo primario. Al día siguiente, usar 6 mL de cultivo primario para inocular frascos de 15, cada que contiene medios de 600 mL LB-ampicilina. Ahora, incubar 15 frascos a 37 º C en un agitador a 180 rpm.
Nota: Para verificación de clones transformados, realizar digestión de secuenciación o restricción de ADN con el ADN del plásmido aislado. - Para comprobar la densidad de cultivo bacteriano, medir su OD600 usando un espectrofotómetro. Después de que la cultura alcance una densidad de 0,8 en OD600, inducen la expresión de la proteína TET2 con 300 μL de 1 IPTG de M (concentración final de 0,5 mM en 600 mL) en cada frasco y crecer aún más la cultura de 16 h a 17 ° C.
- Después de 16 h, transferir el cultivo bacteriano a botellas de centrífuga. Centrifugar el cultivo bacteriano expresan la enzima TET2 a 5.250 x g durante 45 min uso el pellet bacteriano TET2 purificación.
Nota: Realice todos los pasos de purificación de proteínas restantes en el hielo o a 4 ° C. - Resuspender el precipitado bacteriano en 100 mL de MES de 50 mM (2-(N-morfolino) ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido) tampón, pH 6 y someter a ultrasonidos de 5 × 30 s a la potencia 20 con intervalos de enfriamiento de s 60.
- Los filtros de vuelta recoge el sobrenadante que contiene la enzima soluble TET2 lisado a 5.250 x g durante 45 minutos y pasa a través de 0,45 μm antes de la carga en un sistema FPLC.
Nota: En estos experimentos, la enzima TET2 era muy estable, pero si es necesario una proteasa inhibidor coctel que contiene 1 mM benzamidine-ácido clorhídrico, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina puede añadirse a la celda de lisado de evitar la degradación de la enzima TET2. Evitar el uso de EDTA o EGTA en el inhibidor de Cóctel como éstos pueden interferir con la siguiente cromatografía de intercambio catiónico. - Paquete de 30 mL de una resina de intercambio catiónico fuerte en una columna FPLC. Equilibrar la columna con 10 volúmenes de cama de tampón de lavado (buffer MES de 50 mM, pH 6) en el flujo constante de 0,3 mL/min utilizando un sistema FPLC.
- Cargar el clarificado lisado en la columna previamente equilibrado y el lavado con volúmenes de cama de ∼10 de tampón de lavado hasta que el flujo a través de llega a estar claro.
- Eluir TET2 utilizando un 0-100% gradiente desde el tampón de lavado para el tampón de elución (buffer MES de 50 mM, pH 6, 1 M NaCl) en 15 volúmenes de cama siguió manteniendo en el tampón de elución de 100% para volúmenes de dos camas.
Nota: Recoger muestras (100 μL) de lisado antes y después de cargar con todas las fracciones de elución de la columna de la celda y analizar 10% solución de SDS-PAGE. - Piscina las fracciones que contienen proteína TET2, congelar seco, disolver plataforma de enzimas en 10 mL de agua y conservar a-80 ° C.
2. 5mC oxidación por TET2 dioxigenasa
- Llevar a cabo todas las reacciones de desmetilación por triplicado con 3 μg de sustrato (25-mer doble trenzado DNA, tabla 2).
- Añadir 50 μl de tampón de reacción total que contiene 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 μm de FeSO4, 2 mM 2OG 100 μg de enzima purificada de TET2 (2-oxoglutarato/α-cetoglutarato) y 2 mM ascorbato e incubar a 37 ° C por 1 h21.
- Quench TET2 catalizado reacciones de oxidación con 5 μl de EDTA de 500 mM.
- Después de apagar las reacciones TET2, preparar muestras para el análisis por LC-MS/MS por separar el ADN de mezcla de reacción TET2 utilizando columnas de purificación de oligo.
- Añadir 100 μl de tampón de Unión oligo a 55 μl de reacción apagada.
- A continuación, añadir 400 μL de etanol al 100% a la mezcla. Pasar esta mezcla por una columna de enlace de oligo.
- Lavar el ADN enlazado con 750 μl de tampón de lavado y eluir en 20 μl de agua.
- Digerir el ADN aislado con 2 unidades de la ADNsa I y 60 unidades de Nucleasa S1 a 37 ° C por 12 h para producir la Unión de análogos de los nucleósidos individuales.
- Después de la digestión, agregar 2 unidades de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP) en las muestras e incubar además de 12 h a 37 ° C para eliminar los grupos fosfato terminales de nucleósido-Unión para la obtención de nucleósidos.
- Cuantificar los nucleósidos, especialmente modificados cytosines, utilizando el método LC-MS/MS que se describe a continuación.
3. cuantitativa análisis LC-MS/MS-based desarrollo
- Preparar solución stock de 100 μm de los nucleósidos modificados citosina [5-metil-2 '-desoxicitidina (5mdC), 5-hidroximetil-2 '-desoxicitidina (5hmdC), 5-formil-2 '-desoxicitidina (5fdC) y el 5-carboxi-2 '-desoxicitidina (5cadC)] y ADN normal bases (adenina, timina, citosina y guanina) en agua grado HPLC durante el desarrollo del método LC-MS/MS.
- Optimizar parámetros de MS/MS de nucleósido-dependiente por infusión de soluciones, uno a la vez, modo de exploración en el espectrómetro de masas a un flujo de 10 μl/min en EMS. Optimizar siguiendo parámetros: desclusterización potencial (DP), entrada potencial (EP), colisión celda entrada potencial (CEP), colisión de energía (CE) y colisión célula salida potencial (CXP) para cada uso de nucleósidos del ADN automatizado optimización cuantitativa característica del software.
- Optimizar parámetros de MS/MS Fuente dependiente inyectan 10 μl de la solución madre con una pendiente de 25% solvente B a una velocidad de flujo de 0,3 mL/min., donde A es acetato de amonio 10 mM (pH 4.0) y B es acetonitrilo 20% con acetato de amonio 10 mM (pH 4.0). Optimizar siguiendo parámetros: cortina de Gas (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, flujo de Gas 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, disociación Collisionally activado (CAD): baja-media-alta, Ion spray tensión (es): 4000-5500 para cada nucleósido de ADN utilizando el manual de función de optimización cuantitativos del software en modo de FIA (análisis por inyección en flujo).
- Para separar los ocho nucleósidos del ADN, realizar cromatografía líquida utilizando el siguiente gradiente: 0% de disolvente B (0-2 min), 0-20% disolvente B (2-5 min), 20-60% de disolvente B (5-9 min), disolvente de 60-0% B (9-10 min) y luego equilibrar con solvente A durante 5 minutos a un caudal de 0,3 mL/min en una columna C18 (tamaño de partícula: 5 μm, tamaño de poro: 120 Å).
- Utilizando los parámetros óptimos de MS/MS (paso 3.2 y 3.3) juntados con el gradiente de cromatografía líquido antes mencionado (paso 3.4), determinar la linealidad de la respuesta, límite de detección (LOD) y límite inferior de cuantificación (LLOQ) utilizando un doble dilución seriada de una mezcla estándar de 100 μm, que contiene todos los ocho nucleósidos. Dibujar curvas estándar para los ocho nucleósidos del ADN.
- Detectar y cuantificar los nucleósidos, especialmente modificados cytosines, producidos en el paso 2.4 usando el método LC-MS/MS y curvas estándar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modificación dinámica de 5mC en ADN por TET-familia dioxygenases juega un papel importante en las regulaciones transcripcionales epigenéticas. Dioxygenase TET2 es transformado con frecuencia en diversas malignidades hematopoyéticas12. Para investigar el papel de la enzima TET2 en desarrollo normal y la enfermedad, hemos clonado su dominio catalítico activo mínimo sin ninguna etiqueta de afinidad en el vector de pDEST1422. El dioxygenase TET2 untagged produjo ∼5% de la proteína soluble total análisis de SDS-PAGE en bacterias e. coli BL21 (DE3) células. Puesto que el dominio catalítico de TET2 tiene un relativamente alto punto isoeléctrico (∼7.49), en comparación con más indígenas e. coli proteínas24,25,26, un proceso de purificación eficiente utilizando un catión se desarrolló la cromatografía de intercambio. Esta purificación rindió > 90% puro TET2 enzimática en un solo paso (figura 1).
Para separar y cuantificar diferentes deoxycytidines derivados y otras cuatro bases de ADN naturales después de la reacción enzimática TET2, se ha optimizado un ensayo sensible de LC-MS/MS-based. La cromatografía líquida utiliza una columnas de fase inversa C18. Curvas estándar se dibujan utilizando diluciones seriadas de una mezcla que contiene los nucleósidos (figura 2). El degradado que se utiliza para cromatografía de líquidos, que se describe en el procedimiento experimental, fue capaz de resolver los ocho nucleósidos (figura 3). La LC tiempos de retención (tr) para todos los ocho nucleósidos se describen en la tabla 3. Hemos optimizado más la detección de MS de cada padre iones análogos de los nucleósidos (Q1), el ion del producto más intenso (Q3) determinando su potencial desclusterización (DP), potencial de entrada (PE), entrada de celda de colisión potencial (CEP), energía de la colisión (CE), límite de detección (LOD) y límite inferior de cuantificación (LLOQ) (tabla 3). Finalmente, se desarrolló un método de LC-MS/MS que puede separar y cuantificar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, 5-formil y 5-carboxilo) (figura 3).
La actividad de untagged TET2 dioxygenase se determinó utilizando un dsDNA 25-mer que contiene un 5mC en una isla de CpG en cada hebra de ADN (cuadro 2). Después TET2 reacciones enzimáticas, oligonucleótidos de ADN purificados y convertidos en nucleósidos. Entonces estos nucleósidos fueron sometidos a análisis de LC-MS/MS. En las reacciones sin la enzima TET2 (control negativo), se observaron sólo picos dA, dT, dG, CC y 5mdC. Sin embargo, en la reacción de control positivo, que contuvo el dioxygenase TET2, se observaron dos picos nuevos correspondientes a d5hmC y d5fC. No fuimos capaces de detectar la formación de nucleósidos d5caC posiblemente debido a sus niveles de detección pobre (figura 2). Estos resultados demuestran que el dioxygenase TET2 untagged purificado en este procedimiento es catalíticamente activa y puede utilizarse para caracterizar la enzima TET2 wt y sus mutantes clínicas.
Figura 1. Análisis de SDS-PAGE de purificada TET2 dioxigenasa de e. coli BL21 (DE3) células. Carril de la A indica marcador mientras lane que b indica TET2 proteína purificada usando resina de intercambio iónico de sepharose SP. El tamaño total de la dioxigenasa TET2 sin etiquetar es kDa ∼54 según lo indicado por la flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Curvas estándar fue el sorteo de los cuatro nucleósidos de ADN naturales y citosina diferentes derivados, que luego fueron utilizados para su cuantificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Cromatografía líquida (parte inferior) y MS/MS (arriba) método utilizado para separar y caracterizar cuatro nucleósidos naturales de ADN y citosina diferentes derivados.
| Primer nombre | Primer secuencia | |||
| Primer avance TET2 | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Primer revés | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tabla 1: Secuencia de cartillas del oligonucleótido de ADN utilizado para la amplificación por PCR del dominio catalítico de dioxigenasa de TET2 humano sin etiquetar.
| Primer nombre | Primer secuencia |
| Cadena con sentido | 5'-AGCCCGCGCCG/iMe-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Hebra antisentido | 5'-CCGCTCGACCGGCG/iMe-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tabla 2: Secuencia de lo sentido y anti-sentido 25-mer dsDNA del oligonucleótido utilizado como sustrato TET2 para reacciones de oxidación en vitro .
| Nucleósidos | Q1 | Q3 | tr (minutos) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-desoxiadenosina | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0.06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-desoxiguanosina | 268.2 | 152.1 | 10.6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7.8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-desoxicitidina | 228.1 | 112.1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0.1 | 0.33 | 0.998 | |
| 5-metil-2'-desoxicitidina | 242.2 | 126,1 | 9.85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0.1 | 0.998 | |
| 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0.6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-formil-2'-desoxicitidina | 256.2 | 140.1 | 10,92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0.2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-carboxi-2'-desoxicitidina | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tabla 3: Parámetros optimizados de LC-MS/MS de cuatro nucleósidos naturales de ADN y citosina diferentes derivados bajo modo de ion positivo. Para cada padre iones análogos de los nucleósidos (Q1), se detectó el ión de producto más intenso (Q3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las mutaciones en el gen TET2 son algunos de los cambios genéticos más frecuentemente detectados en pacientes con malignidades hematopoyéticas diversos. Hasta la fecha cientos de mutaciones diferentes de TET2, que incluyen el cambio del marco y absurdo y mutaciones sin sentido, se han identificado en pacientes12. Pacientes con mutaciones TET2 muestran niveles bajos de 5hmC genómica en la médula ósea en comparación con aquellos con TET2 wt14. TET2 mutantes knock-in experimentos han recapitulado los efectos de estas mutaciones en los niveles de 5hmC en las células transfected14. Resultados de los modelos de ratón knockout TET2 demostró que el nivel de enzima TET2 inversamente correlacionado con la progresión de neoplasias hematopoyéticas17,18,19,20. Constantemente, Zhang et al. demostrado recientemente eso abajo-regulación de TET2 niveles de expresión es un potencial biomarcador pronóstico y predictivo en leucemia mieloide aguda citogenético normal27.
A pesar de la creciente evidencia de que TET2 juega un papel fundamental en la hematopoyesis normal y la transformación mieloide, caracterización bioquímica de wt y mutante TET2 permanecen en etapas rudimentarias debido a las dificultades asociadas con la producción de activos TET2 y su análisis. Mayoría de los estudios ha producido sistema de baculovirus recombinante TET2 utilizando mucho tiempo en células de los insectos14, o como una glutatión S-transferasa afinidad etiqueta las células bacterianas que requiere el retiro de etiqueta de afinidad21.
En este procedimiento experimental, describe la clonación de untagged humano TET2 dioxygenase dominio catalítico utilizando una técnica de recombinación específica del sitio y su expresión eficiente usando vectores de destino (pDEST14) en e. coli. Porque el punto isoeléctrico de TET2 sin etiquetar es relativamente alto (∼7.49) en comparación con las proteínas de e. coli más indígenas, desarrollamos un proceso de purificación eficiente utilizando una cromatografía de intercambio catiónico rendimiento > 90% puro untagged TET2 enzima en un solo paso.
Existen desafíos Adicionalmente, en la cuantificación de la wt y mutante TET2 dioxygenase actividad. Para estos experimentos, la mayoría de los estudios se ha basado en ensayos basados en anticuerpos como el dot-Blot14,28, análisis de la enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA)29, etc. ya que estos ensayos utilizan generalmente solamente un anticuerpo, por ejemplo, 5hmC o or5caC fC 5, para la detección de 5mC modificación en sustrato de ADN, no proporcionan una imagen completa de la reacción catalítica por isoformas del TTE. Por estas razones, el análisis de LC-MS/MS-based ha emergido como el ensayo sólo cuantificar modificaciones diferentes citosina. En este sentido, hemos desarrollado un método de cromatografía líquida novela que puede separar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5mC, 5hmC, fC 5 y 5caC).
Para cuantificar los ocho nucleósidos de TET2 catalizado reacciones, hemos juntado nuestro método de cromatografía líquida mejora con espectrometría total en tándem. Este ensayo de LC-MS/MS sensible entonces fue utilizado para determinar la actividad de la enzima sin etiquetar a TET2 recombinante de humano. El enfoque descrito aquí realzará grandemente la evaluación de las actividades de la dioxigenasa TET2 wt y mutante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen intereses financieros para declarar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Departamento de defensa en la forma de un premio de Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplásica y subvención de la Fundación de MDS, y concesión UMRB a Authors M.M. gracias Mohit Jaiswal y Subhradeep Bhar para clonación inicial de TET2 en vector de pDEST14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
