Summary

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018
doi:

Summary

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Abstract

Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.

Introduction

Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteração do metabolismo secundário é um fenômeno interessante na qual glicólise é usado predominantemente para produção de energia e aeróbia respiração mitocondrial, que envolve o ciclo TCA e cadeia de transporte de elétrons, é ativador em mamíferos câncer células1,2. Nós mostramos recentemente que os níveis de lactato e a relação lactato/piruvato consequente (L/P) diminuiu durante o envelhecimento no organismo modelo Caenorhabditis elegans (c. elegans). Da mesma forma, achamos que os mamíferos tumor supressor p53 ortholog CEP-1 em c. elegans tem um papel importante nas alterações relacionadas com a idade do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais3.

Em ensaios biológicos, tais como a medição das concentrações de lactato e piruvato em células, a sensibilidade, precisão, tamanho da amostra e tempo de incubação de kits de ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram dramaticamente. Devido às inovações tecnológicas, agora somos capazes de analisar vários metabólitos e metabólitos intermediários sem a cultura em grande escala de c. elegans, que é difícil, dado o seu pequeno tamanho. Em geral, a sensibilidade de um ensaio colorimétrico é uma ordem de magnitude menor do que um ensaio fluorimétrica; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais adequada na configuração dos laboratórios comuns. Além disso, uma técnica de extração contendo precipitação de homogeneização e proteína é crucial para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato de células de c. elegans , porque este nematódeo é encerrado em um exoesqueleto chamado a cutícula, ao contrário de células de mamíferos cultivadas linhas4,5. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar as concentrações de lactato e piruvato usando kits de ensaio colorimetric comercial, incluindo dicas para extração de amostra de c. elegans.

Protocol

1. sincronizada cultura de c. elegans Antes da semeadura, cultura de Escherichia coli (e. coli) estirpe OP50 durante a noite a 37 ° C em 300 mL de meio líquido de caldo de Luria-Bertani (LB). Armazenar o OP50 cultivadas a-4 ° C. Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave.Nota: OP50 e c. elegans cepas estão disponíveis a parti…

Representative Results

Usando os ensaios colorimétricos para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato, mostramos a precisão destes ensaios em comparação com os relatórios anteriores em c. elegans7,8. Aqui, o processo de precipitação de proteínas durante a extração da amostra foi a etapa mais crucial para gerar valores precisos. Para a precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., TCA, PC…

Discussion

Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.

Materials

Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit
BioAssay
Systems
#EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

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Cite This Article
Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

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