Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

doi: 10.3791/57832 Published: August 2, 2018

Summary

Rensning af Ionkanaler er ofte udfordrende, men når opnået, kan det potentielt give in vitro- undersøgelser af funktioner og strukturer af kanaler. Her beskriver vi trinvis procedurerne for den proteinekspression og -oprensning af pattedyr bestrophin proteiner, en familie af Ca2 +-aktiveret Cl- kanaler.

Abstract

Det menneskelige genom koder fire bestrophin paralogs, nemlig BEST1, BEST2, BEST3 og BEST4. BEST1, kodet af genet BEST1 er en Ca2 +-aktiveret Cl- kanal (CaCC) overvejende udtrykt i retinale pigment epitel (ÅV). Den fysiologiske og patologiske betydning af BEST1 er fremhævet af den kendsgerning, at over 200 forskellige mutationer i BEST1 genet har været genetisk knyttet til et spektrum af mindst fem retinal degenerative lidelser, såsom bedste vitelliform makulaødem dystrofi (bedste sygdom). Derfor har forståelse Biofysik bestrophin kanaler på enkelt-molekyle niveau enorm betydning. At få renset pattedyr Ionkanaler er imidlertid ofte en udfordrende opgave. Her rapporterer vi en protokol for udtryk for pattedyr bestrophin proteiner med BacMam baculovirus gen transfersystemet og deres rensning af affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi. De rensede proteiner har potentiale til at blive udnyttet i efterfølgende funktionelle og strukturelle analyser, såsom elektrofysiologiske optagelse i lipid dobbeltlag og krystallografi. Vigtigst, kan denne rørledning tilpasses studere funktioner og strukturer i andre Ionkanaler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bestrophins er en familie af Ionkanaler bevaret gennem arter varierer fra bakterier til mennesker1. Hos mennesker koder BEST1 -genet, placeret på kromosom 11q12.3, membran protein Bestrophin-1 (BEST1), som er overvejende udtrykt i basolateral membranen af retinale pigment epitel (ÅV) celler i øjnene2,3 ,4. Består af 585 aminosyrer, de første ~ 350 som er meget bevaret blandt arter og indeholder den transmembrane region, fungerer BEST1 som en CaCC i mennesker1,5,6. Desuden BEST1 homologs i kyllinger og Klebsiella pneumoniae både fungere som homopentamers7,8, tyder på en høj grad af bevarelse i hele udviklingen.

I mennesker, har over 200 mutationer i BEST1 genet været klinisk knyttet til en gruppe af retinale degeneration sygdomme kaldet bestrophinopathies1,9. Fem specifikke bestrophinopathies er blevet rapporteret, herunder bedste sygdom, voksen-debut vitelliform dystrofi, autosomal dominerende vitreoretinochoroidopathy, autosomal recessiv bestrophinopathy og retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Disse sygdomme, som fører til nedsat syn og endda blindhed, er i øjeblikket uhelbredelige. For at udvikle terapeutiske behandlinger og potentielt personlig medicin, er det vigtigt at forstå, hvordan disse BEST1 sygdomsforårsagende mutationer påvirke funktion og struktur af BEST1 kanal15. Til disse formål, forskere har brug at få renset bestrophin (vildtype og/eller mutant) kanaler og gennemføre i vitro analyser5,8.

Det første vigtige skridt er udtryk for bestrophin kanaler fra højere arter i pattedyrsceller. Som baculovirus transduktion af HEK293-F celler (BacMam system) er en kraftfuld metode til at heterologously express membran proteiner16,17, denne protokol udnytter en optimeret BacMam vektor (pEG BacMam) for robust udtryk for den målrette protein18, som i dette tilfælde er et pattedyr bestrophin homolog. Denne vektor er blevet brugt til udtryk for forskellige Membranproteiner, herunder G-protein-koblede receptorer, nukleare receptorer og andre ion kanaler18. Der er også beviser for, at de fremstillede proteiner er egnet til krystallografi18. Med høje niveauer af udtryk i HEK293-F celler, kan proteiner derefter renses ved hjælp af kromatografi; specifikt for bestrophins, kan både affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi anvendes.

Når denne protokol er finjusteret for en bestrophin kanal, kan den renset protein derefter analyseres for dets funktion og struktur gennem planar lipid tolagede og røntgenkrystallografi, henholdsvis5,8. Helt, disse teknikker give en stærk pipeline for funktionelle og strukturelle undersøgelser af bestrophins og andre Ionkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fremstilling af BacMam udtryk Baculoviruses

  1. Indsæt den kodende sekvens af en ønskede pattedyr bestrophin protein i pind BacMam vektor18 med en tobak Etch Virus (TEV) protease anerkendelse sekvens, efterfulgt af en normal god landbrugspraksis-10 x hans-tag på C-terminalen af proteinet.
  2. Forbigående transfect udtryk plasmid til selvklæbende HEK293 celler19,20,21,22,23. Kontrollere udtryk for normal god landbrugspraksis-fusion protein under en fluorescerende mikroskop med 10 X eller 20 X forstørrelse, en 488 nm magnetisering kilde og en 510 nm emission filter (figur 1A).
    Bemærk: Polymer-baserede Transfektion udføres rutinemæssigt med 1 μg af plasmid DNA til en 35 mm fad af HEK293 celler.
  3. Producere baculoviruses i Sf9 insekt celler som tidligere beskrevet16,17.
    Bemærk: Passage 3 (P3)-virus, der skal bruges til at inficere HEK293-F celler for protein produktion, kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
  4. Bestemme titer (smitsomme enheder) af virussen P3 af plaque dannelse assay16,17.
    Bemærk: Som protein af interesse er markeret med normal god landbrugspraksis, en hurtigere metode til kontrol af smitsomme enheder er at inficere Sf9 celler med serielle fortyndinger af virus og tælle antallet af fluorescerende celler efter 48 timer.

2. protein udtryk

  1. Opretholde HEK293-F celler i en suspension kultur med HEK293-F udtryk medium i et 37 ° C befugtet kuvøse med 8% CO2. Bruge engangs kultur kolber, der er 2 - 2,5 gange større end kultur volumen og rotere kultur på en orbital platform på 135 rpm.
    Bemærk: Det anbefales at inficere celler, når de er mellem passager 5 og 30 og til at udføre disse handlinger under en celle kultur hætte.
  2. 24 timer før virusinfektion, tilsættes 15 μl Trypan blå 15 μl alikvot af cellekultur, og Marker celle tæthed og levedygtighed ved hjælp af en hemocytometer under et mikroskop. Fortynd celler til 0,6 x 106 celler/mL i 2 x 2 L flasker hver, med 500 mL af medium pre varmes ved 37 ° C.
    Bemærk: Døde celler er farvet blå af Trypan blå. Den ønskede celle levedygtighed er > 95%.
  3. På dagen for infektion, kontrollere celle tæthed og levedygtighed (trin 2.2).
    Bemærk: En høj cellernes levedygtighed af > 95% er afgørende for effektiv infektion og protein udtryk. Den forventede celle tæthed er ~1.0 x 106 celler/mL (dyrkes natten fra 2 x 500 mL 0,6 x 106 celler/mL cellekultur). Det forventede samlede antal celler er ~1.0 x 109.
  4. Tilføje P3 baculoviruses til cellerne i en mangfoldighed af infektion (MOI) af 5. For at bestemme mængden af virus podes, skal du bruge følgende ligning:
    Equation
  5. Ryst celler på orbital platformen på 135 rpm i en fugtig 37 ° C kuvøse med 8% CO2 i 24 timer.
  6. Tilføje 10 mM af natrium butyrat til cellekultur og fortsætte inkubation i 48 timer.
    Bemærk: For nogle proteiner, reducere celle kultur temperaturen til 30 ° C efter natrium butyrat tilsætning kan forbedre udtryk og stabilitet.
  7. Under et fluorescens mikroskop med 10 X eller 20 X forstørrelse, en 488 nm magnetisering kilde og en 510 nm emission filter, tjek den procentdel og lysstyrke af grønne celler, som direkte repræsenterer protein (bestrophin-normal god landbrugspraksis-10xHis) udbytte (figur 1B).
    Note: Procentdel af grønne celler beregnes af: 100 x (grønne celler/Total celler). God protein udtryk niveau er indiceret ved stærk grøn fluorescens under mikroskop.
  8. Høste cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 4 ° C i 20 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes celle pellets med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en endelige mængden af ~ 80 mL. Split cellesuspension til 2 x 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 4 ° C i 20 min. gemme celle pellets ved-80 ° C.

3. protein oprensning

  1. Inkuber de koniske rør indeholdende celle pellets i en omrøring vandbad ved stuetemperatur i 10-15 min, således at de tø. Genopslæmmes celler i 2 x (w/v) volumen af buffer (tabel 1) (fx 10 g af celle pellets i 20 mL buffer) suppleret med proteinase-hæmmere (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A og phenylmethylsulfonyl fluorid) på 0,1-1,0 mM. Med pipette overfoeres op og ned udstrakt grad at opnå en homogen cellesuspension.
  2. Lyse celler ved hjælp af en højtryks homogeniseringsapparat. Kør cellesuspension gennem homogeniseringsapparat på 7-10 MPa for i alt 3 - 4 gange at opnå fuldstændig homogenisering. Holde cellen lysate på is i 2-3 minutter mellem runder.
  3. Tilføje vaskemiddel [fx 2% w/v sol-grade n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (Bettinas)] til cellen lysate. Inkuber med agitation i 1 time ved 20 ° C til at udtrække Membranproteiner.
    Bemærk: Typen af rengøringsmiddel skal optimeres for hvert protein mål18,24.
  4. Der centrifugeres ved 150.000 x g i en ultracentrifuge ved 4 ° C i 1 time.
    Bemærk: Alle nedenstående trin er udført ved 4 ° C.
  5. Indsamle de klare celle lysate og flow igennem en 5 mL hans Trap Ni2 +- NTA affinitet kolonne pre ekvilibreres med buffer (tabel 1).
    Bemærk: Efter centrifugering, cellen klar lysate vil være klemt inde mellem en pellet i bunden og en overskyet lag på toppen. Bruge en 10 mL overførsel afpipetteres nøje indsamle den klare lysate og derefter skifte til en 1 mL pipette til sidst par milliliter af lysate. Undgå pellet, som kan tilstoppe Ni2 + kolonne; men en lille mængde af det øverste lag er fint eller kan være filtreret ud med en 1,5 μm filter.
  6. Kolonnen udvaskes med 25 mL buffer B og derefter 40 mL buffer C (tabel 2 og 3, henholdsvis).
    Bemærk: Dette er et godt sted at tage en pause, som samlede rensning kan tage op til 12 h og proteinet kan forblive stabile, mens knyttet til kolonnen natten over.
  7. Tillægger en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system kolonnen og elueres protein fra kolonnen med 13 mL buffer D (tabel 3) med fraktionering. Indsamle de protein-beriget fraktioner ifølge UV absorbans udlæsning.
    Note: The FPLC betingelser er som følger: en 1,0 mL brøkdel størrelse, en pre-tryk alarm for, indstilles til 0,3 MPa og en flow-hastighed på 0,5 mL/min.
  8. Måle elueret proteinkoncentration-produkt på Spektrofotometer microvolume. Læse absorbans ved 280 nm.
  9. (Valgfrit) Hvis du vil fjerne normal god landbrugspraksis-10xHis tag, tilføje TEV protease i forholdet 1:1 masse og inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
    Bemærk: Tag kan eller kan ikke påvirke funktion eller strukturen i den rensede kanal. Beregne den TEV volumen og koncentrationen af de indsamlede protein fra trin 3,7-3,8. For eksempel, hvis 10 mL af eluering produkt er indsamlet og målt på 0,1 mg/mL, den samlede protein massen er 10 x 0,1 = 1 mg, og 1 mg af TEV vil blive anvendt for fordøjelsen.
  10. Koncentrere protein med en 15 mL centrifugal (50 eller 100 kDa) filterenhed af spinning på 4.000 x g i 4 ° C til en endelige mængden af 400-500 μL (for en 2 mL prøve-loading løkke på FPLC).
    Bemærk: Den centrifuging tid for koncentrationen varierer afhængigt af koncentrationen og størrelse af protein. For at undgå over at koncentrere sig, som kan forårsage protein nedbør, spin i 10 min først så observere den resterende mængde og skøn tid for en efterfølgende spin (f.eks. 2-5 min), og så videre, til at opnå det endelige rumfang. Med pipette overfoeres mellem spins til at sprede det protein, der er trukket til bunden af filteret.
  11. Overføre den koncentrerede protein for at en ny 1,5 mL tube og fjerne enhver bundfaldet eller bobler fra det koncentrerede produkt. Spin på > 12.000 x g for 5-10 min. ved 4 ° C og indsamle supernatanten i en ny 1,5 mL tube.
  12. Indlæse det endelige produkt med en 1 mL sprøjte og en runde-spids nål på et FPLC system for størrelse-udelukkelse kromatografi med en størrelse-udelukkelse kolonne pre ekvilibreres med buffer E (tabel 5).
    Note: The FPLC betingelser er som følger: en 0,5 mL brøkdel størrelse, en pre-tryk alarm for, indstilles til 2,50 MPa, en flow volumen indstillet til 30 mL buffer E (tabel 5), og en flow-hastighed sat til 0,5 mL/min.
  13. Kommentar at velopdragne proteiner kører som en enkelt peak (figur 2A) og indsamle protein fraction(s) svarende til at peak (figur 2A).
  14. Koncentrere proteinet med en 4 mL eller 0,5 mL centrifugal filterenhed (af samme molekylvægt cut-off som i trin 3.10) og spin på 4.000 x g ved 4 ° C til en endelig koncentration på 5-10 μg/μL. Bruge spektrofotometrets til at kontrollere den endelige produkt koncentration (trin 3.8).
    Bemærk: Centrifugeringstiden varierer, som den endelige produkt mængde kan variere mellem rensning forsøg. Normalt tager centrifugering 10-20 min. Det anbefales at afpipetteres mellem spins til at sprede det protein, der er trukket til bunden af filteret.
  15. Overføre den koncentrerede protein til en ny 1,5 mL tube. Fjern eventuelle bundfaldet ved centrifugering på > 12.000 x g for 5-10 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube. Gøre 10 μL delprøver til opbevaring på-80 ° C og gemme en 2-5 μl lille alikvot til at køre på en 4-15% gradient SDS-PAGE gel på 9 V/cm (figur 2B).
  16. Bekræfte identiteten af den renset protein massespektrometri8.
    Bemærk: In vitro analyse af funktionen og struktur af oprenset protein kan udføres gennem planar lipid tolagede og røntgenkrystallografi, henholdsvis5,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fluorescens-intensiteten i forbigående transfekteret selvklæbende HEK293 celler (figur 1A) er en god indikator for det forventede protein udtryk niveau i suspension HEK293-F celler (figur 1B). Hvis target proteinet ikke er godt udtrykt eller mis er lokaliseret i HEK293 celler efter forbigående Transfektion, det anbefales at overveje at ændre udtryk konstruktion (fx., ændre placeringen af normal god landbrugspraksis tag eller gøre mutationer/udeladelser på target proteinet). Lille HEK293-F suspension kulturer (f.eks. 25 mL kulturer) bruges til at optimere betingelserne for protein udtryk, blandt hvilke infektion MOI og dyrkning temperatur har været den vigtigste i tidligere erfaringer.

En vellykket rensning er angivet med et enkelt vigtigste højdepunkt med den forventede eluering lydstyrke i størrelse-udelukkelse kromatografi (figur 2A) og en enkelt dominerende bandet på en denatureret SDS-PAGE gel (figur 2B). Hvis flere toppe vises i størrelse-udelukkelse kromatografi, er det vigtigt at indsamle hver top og køre en native gel til at bestemme, hvilke peak indeholder funktionelle kanal pentamers. Det bemærkes, at mellem to protein konstruktioner, udtryk niveau, anført af fluorescens intensitet i forbindelse med høst, gør ikke nesessarily korrelerer med det endelige udbytte, som hvert protein konstruere opfører sig anderledes under rensningen. For en nå-artet bestrophin protein, kan 200-500 µg af renset slutproduktet typisk være fremstillet af 1 L HEK293-F suspension celler.

Figure 1
Figur 1: udtryk for et pattedyr bestrophin protein. Mikroskopiske billeder af en normal god landbrugspraksis-tagged pattedyr bestrophin udtrykt i a selvklæbende HEK293 celler af plasmid Transfektion, og i b suspension HEK293F celler af baculovirus infektion. Venstre = grøn fluorescens; højre = lyse-felt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: rensning af et pattedyr bestrophin protein. (A) affinitet-renset normal god landbrugspraksis-tagged proteiner løb på en størrelse udstødelse gel-filtrering kolonne som én vigtigste peak. Brøker mellem stiplede linjer blev indsamlet. (B) endelige protein produkt løb på en SDS-PAGE gel med stiger (venstre kolonne). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Reagens MW Beløb pr. 1 L Endelige
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Glycerol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazol 68,1 1.3616 g 20 mM
MgCl2 203 0.20331 g 1 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 2,5 mL 200 mM lager 0,5 mM

Tabel 1: Protein oprensning Buffer en (Resuspension Buffer)

Reagens MW Beløb pr. 1 L Endelige
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Glycerol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazol 68,1 2.7232 g 40 mM
MgCl2 203 1.01655 g 5 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
Bettinas (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabel 2: Protein oprensning Buffer B (første vask Buffer)

Reagens MW Beløb pr. 1 L Endelige
HEPES 238.3 5.95 g 25 mM
NaCl 58.44 29,2 g 500 mM
Glycerol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazol 68,1 5,1 g 75 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
Bettinas (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabel 3: Protein oprensning Buffer C (andet vaske Buffer)

Reagens MW Beløb pr. 1 L Endelige
HEPES 238.3 7.74 g 32,5 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
Glycerol 92.09 25 mL 2,5% (v/v)
Imidazol 68,1 17.02 g 250 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
Bettinas (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabel 4: Protein oprensning Buffer D (eluering Buffer)

Reagens MW Beløb pr. 1 L Endelige
HEPES 238.3 9.53 g 40 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
Bettinas (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabel 5: Protein oprensning Buffer E (Gel filtrering Buffer)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver en nyttig pipeline til proteinekspression og -oprensning af pattedyr bestrophin Ionkanaler skal anvendes til fremtidige i vitro analyser. Mens FPLC enheden er påkrævet til størrelse-udelukkelse kromatografi, er en sprøjten pumpe tilstrækkelig for alle skridt af affinitet kromatografi herunder bindende, vask og eluerer. Når du bruger en sprøjten pumpe til push løsninger (i en sprøjte) gennem en kolonne, er det vigtigt at underlag i foråret side for at undgå at skubbe luftbobler i kolonnen. Hvis renheden af protein efter affinitet kromatografi er allerede tilstrækkelig til de efterfølgende eksperimenter, kan størrelse-udelukkelse kromatografi udelades, så at en FPLC enhed ikke kan slet være nødvendig.

Da det tager ca 2 uger til at gøre baculoviruses fra pBacMam plasmider, for at øge effektiviteten, en indledende skærm for velopdragne protein homologs kan udføres af høst af forbigående transfected HEK293 celler (fx., fra en 60 mm parabol) og test hvor de udtrykte proteiner af interesse (normal god landbrugspraksis-markeret) opfører sig i vaske-og rengøringsmidler (fx Bettinas) med fluorescens-detektion størrelse-udelukkelse kromatografi (FSEC)18,24. Det er mest produktivt at fokusere på protein-konstruktioner, der viser stærk fluorescens i transfekteret HEK293 celler og god monodispersity og stabilitet i FSEC.

Der er flere henstillinger for at øge udbyttet af protein oprensning. Først, kan betingelserne for TEV fordøjelsen skal optimeres for hvert protein. Dette kan gøres ved at teste en række protein til TEV masse nøgletal (f.eks. 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 og 1:10) og inkubere gange (f.eks. 0.5 h, 1 h, 2 h, 5 h, og natten). Så, er det foreslået for at køre de behandlede prøver i en SDS-PAGE gel for at kontrollere kavalergang effektivitet. Derudover er det vigtigt ikke at lade alle centrifugal centrifugatet eller elueringsvæsken lække ud af forbindelser på FPLC eller sprøjter. Tilsvarende er det vigtigt at undgå boblerne når pipettering koncentreret protein.

Forskellige efterfølgende in vitro- analyse procedurer at anvende proteiner fra denne protokol omfatter lipid tolagede, røntgenkrystallografi, cryo-Elektron Mikroskopi, spektroskopi og high throughput screening8,25 , 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud EY025290, GM127652 og University of Rochester start-up finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88, (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7, (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19, (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278, (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516, (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346, (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104, (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82, (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85, (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8, (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23, (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9, (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111, (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7, (5), e37079 (2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3, (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588, (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173, (9), 2307-2322 (2017).
Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).More

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter