Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler
Summary
Rensning af Ionkanaler er ofte udfordrende, men når opnået, kan det potentielt give in vitro- undersøgelser af funktioner og strukturer af kanaler. Her beskriver vi trinvis procedurerne for den proteinekspression og -oprensning af pattedyr bestrophin proteiner, en familie af Ca2 +-aktiveret Cl– kanaler.
Abstract
Det menneskelige genom koder fire bestrophin paralogs, nemlig BEST1, BEST2, BEST3 og BEST4. BEST1, kodet af genet BEST1 er en Ca2 +-aktiveret Cl– kanal (CaCC) overvejende udtrykt i retinale pigment epitel (ÅV). Den fysiologiske og patologiske betydning af BEST1 er fremhævet af den kendsgerning, at over 200 forskellige mutationer i BEST1 genet har været genetisk knyttet til et spektrum af mindst fem retinal degenerative lidelser, såsom bedste vitelliform makulaødem dystrofi (bedste sygdom). Derfor har forståelse Biofysik bestrophin kanaler på enkelt-molekyle niveau enorm betydning. At få renset pattedyr Ionkanaler er imidlertid ofte en udfordrende opgave. Her rapporterer vi en protokol for udtryk for pattedyr bestrophin proteiner med BacMam baculovirus gen transfersystemet og deres rensning af affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi. De rensede proteiner har potentiale til at blive udnyttet i efterfølgende funktionelle og strukturelle analyser, såsom elektrofysiologiske optagelse i lipid dobbeltlag og krystallografi. Vigtigst, kan denne rørledning tilpasses studere funktioner og strukturer i andre Ionkanaler.
Introduction
Bestrophins er en familie af Ionkanaler bevaret gennem arter varierer fra bakterier til mennesker1. Hos mennesker koder BEST1 -genet, placeret på kromosom 11q12.3, membran protein Bestrophin-1 (BEST1), som er overvejende udtrykt i basolateral membranen af retinale pigment epitel (ÅV) celler i øjnene2,3 ,4. Består af 585 aminosyrer, de første ~ 350 som er meget bevaret blandt arter og indeholder den transmembrane region, fungerer BEST1 som en CaCC i mennesker1,5,6. Desuden BEST1 homologs i kyllinger og Klebsiella pneumoniae både fungere som homopentamers7,8, tyder på en høj grad af bevarelse i hele udviklingen.
I mennesker, har over 200 mutationer i BEST1 genet været klinisk knyttet til en gruppe af retinale degeneration sygdomme kaldet bestrophinopathies1,9. Fem specifikke bestrophinopathies er blevet rapporteret, herunder bedste sygdom, voksen-debut vitelliform dystrofi, autosomal dominerende vitreoretinochoroidopathy, autosomal recessiv bestrophinopathy og retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Disse sygdomme, som fører til nedsat syn og endda blindhed, er i øjeblikket uhelbredelige. For at udvikle terapeutiske behandlinger og potentielt personlig medicin, er det vigtigt at forstå, hvordan disse BEST1 sygdomsforårsagende mutationer påvirke funktion og struktur af BEST1 kanal15. Til disse formål, forskere har brug at få renset bestrophin (vildtype og/eller mutant) kanaler og gennemføre i vitro analyser5,8.
Det første vigtige skridt er udtryk for bestrophin kanaler fra højere arter i pattedyrsceller. Som baculovirus transduktion af HEK293-F celler (BacMam system) er en kraftfuld metode til at heterologously express membran proteiner16,17, denne protokol udnytter en optimeret BacMam vektor (pEG BacMam) for robust udtryk for den målrette protein18, som i dette tilfælde er et pattedyr bestrophin homolog. Denne vektor er blevet brugt til udtryk for forskellige Membranproteiner, herunder G-protein-koblede receptorer, nukleare receptorer og andre ion kanaler18. Der er også beviser for, at de fremstillede proteiner er egnet til krystallografi18. Med høje niveauer af udtryk i HEK293-F celler, kan proteiner derefter renses ved hjælp af kromatografi; specifikt for bestrophins, kan både affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi anvendes.
Når denne protokol er finjusteret for en bestrophin kanal, kan den renset protein derefter analyseres for dets funktion og struktur gennem planar lipid tolagede og røntgenkrystallografi, henholdsvis5,8. Helt, disse teknikker give en stærk pipeline for funktionelle og strukturelle undersøgelser af bestrophins og andre Ionkanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en nyttig pipeline til proteinekspression og -oprensning af pattedyr bestrophin Ionkanaler skal anvendes til fremtidige i vitro analyser. Mens FPLC enheden er påkrævet til størrelse-udelukkelse kromatografi, er en sprøjten pumpe tilstrækkelig for alle skridt af affinitet kromatografi herunder bindende, vask og eluerer. Når du bruger en sprøjten pumpe til push løsninger (i en sprøjte) gennem en kolonne, er det vigtigt at underlag i foråret side for at undgå at skubbe luftbobler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud EY025290, GM127652 og University of Rochester start-up finansiering.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
