Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.
Abstract
الزرد كائن معترف به عالمياً من مياه العذبة استخداماً في علم الأحياء التنموي، وعلم السموم البيئية والأمراض البشرية المجالات البحثية ذات الصلة. بفضل ميزات فريدة من نوعها، بما في ذلك خصوبة كبيرة، الشفافية الجنين، والتنمية السريعة والفورية، إلخ، الزرد الأجنة غالباً ما تستخدم لتقييم السمية واسعة النطاق للمواد الكيميائية والمخدرات/مجمع الفرز. إجراء فحص نموذجي ينطوي على التفريخ الزرد الكبار، واختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في لوحات متعددة جيدا. من هناك، تتعرض الأجنة للتعرض ومدى سمية المادة الكيميائية، أو يمكن تقييم فعالية العقاقير/المركبات بسرعة نسبيا استناداً إلى الملاحظات المظهرية. ومن بين هذه العمليات، الأجنة أرايينج هو إحدى الخطوات الأكثر استهلاكاً للوقت وكثيفة العمالة التي تحد من مستوى الإنتاجية. في هذا البروتوكول، نقدم نهجاً مبتكراً أن يجعل استخدام قالب أرايينج طباعة 3D مقترنة بفراغ التلاعب الإسراع بهذه الخطوة شاقة. ويصف البروتوكول هنا التصميم العام للقالب أرايينج، الإعداد التجريبية التفصيلية والإجراءات خطوة بخطوة، تليها النتائج الممثل. عند تنفيذها، ينبغي أن يثبت هذا النهج مفيداً في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية باستخدام أجنة الزرد كاختبار المواضيع.
Introduction
ككائن نموذج الشعبي، الزرد يستخدم على نطاق واسع في مجالات الطب وعلم السموم1،2،،من34. مقارنة بمنصات في المختبر ، الزرد توفر الكثير من التعقيدات البيولوجي أكبر أن أحد أو لا يمكن أن تقدم نوعين من الخلايا. إضافة إلى كونه كائناً كامل النموذجي وخصوبتها كبيرة الزرد والسريع والمتزامن من التنمية الجنينية والجهاز عالية أعطت الشفافية هذا النموذج مزايا فريدة من نوعها لاستخدامها لسمية واسعة النطاق أو المخدرات/مجمع الفرز5. مئات الأجنة التي تنتجها زوج واحد من الزرد الكبار كل أسبوع تفوق أي نماذج حيوانية أسرة أخرى وجعلت مناسبة لفحص إنتاجية عالية.
إجراء فحص نموذجي باستخدام الزرد ينطوي على قدر كبير من العمل اليدوي، مثل الكبار الزرد التفريخ، اختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في حاويات مناسبة حيث أنهم يتعرضون للتعرض عن طريق غمر المياه. ويرصد وضع الأجنة ونهايات يمكن ملاحظتها مثل معدلات الوفيات، وإمكانية فقس البيض، والشذوذ غالباً ما قيمت يدوياً ويستخدم كتعريفات أولية لسمية المواد الكيميائية أو مؤشرات لمدى فعالية العقاقير أو المركبات. لتسريع إجراءات الفرز، تم استكشاف النهج مثل التصوير الآلي وتحليل الصور الحاسوب مسبقاً. على سبيل المثال، مجاهر مع المحتوى العالي من قدرات التصوير وقد تم تكييف أداء الآلي مشرق الحقل أو تصوير الأسفار على الأجنة الزرد في مختلف مراحل النمو من لوحات جيدا 96/3846. أجهزة موائع جزيئية مقترنة بالمجاهر استخدمت لوضع اليرقات الزرد من خلال التلاعب الحالي لتصوير الدماغ الخلايا العصبية7. هذه النهج يمكن تحسين كبير في كفاءة عمليات اقتناء الصورة مقارنة بالتشغيل اليدوي التقليدي. وعلاوة على ذلك، مع عدد كبير من الصور التي يتم إنشاؤها، أدوات تحليل الصورة كما وضعت لتسريع عملية معالجة البيانات، كما يتبين من ليو وآخرون وتو et al. 8 , 9.
كما يزيد مستوى الإنتاجية لتحليل التصوير والصورة، أصبح من الواضح أن هذه الخطوة الحد من معدل للفحص يكمن في عملية إعداد أجنة الزرد للتعرض، والذي يعني عادة أرايينج منهم إلى 96-384 جيدا أو لوحات. لحل هذه الخطوة عنق الزجاجة، وضعت موجهة برؤية الروبوتات ماندريل et al. 10 ولنا11 سابقا ليحل محل المناولة اليدوية ولكن الأدوات متطورة بل وهناك منحنى التعلم عميق لتنفيذ مثل هذه التقنيات. ولذلك، لتوفير نهج سهلة الاستخدام يصبح أحد العوامل الهامة لزيادة تحسين مستوى الإنتاجية لفحص الزرد، وهو الهدف الرئيسي لهذا العمل.
في هذا العمل، ونحن تصميم وملفقة جنين أرايينج قالب عليها 3D الطباعة. صمم قالب أرايينج لإيقاع الجنين الزرد إلى الآبار التي تناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. بدلاً من اختيار الأجنة وأرايينج لهم في بئر فرادى واحداً تلو الآخر، أحد يمكن تنفيذ فخ الجنين ومجموعة جميع أجنة 96 في صفيحة الجدر مرة واحدة. باستخدام هذا القالب والبروتوكول التالي، واحد يمكن زيادة كبيرة في الكفاءة من أرايينج الأجنة في لوحات الجدر، والتي ستكون في الأجل زيادة قدرة الفرز على الأقل عشرة إضعاف، مقارنة بالتشغيل اليدوي. ويشمل البروتوكول هو موضح أدناه تصميم العام أرايينج القالب، تفريخ الزرد، جمع الجنين، وأرايينج. ويبين الشكل 1 التصميم العام للقالب أرايينج. ويبين الشكل 2 لمحة عامة عن البروتوكول خطوة بخطوة حول استخدام قالب الموصوفة في الأجزاء 3 و 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-التصميم والتصنيع الأجنة الزرد أرايينج قالب
-
تصميم قالب أرايينج مع 12 من 8، 96-جيدا التخطيط الذي يناسب لوحة 96-جيدا قياسية. استخدام الأبعاد المذكورة في الشكل 1A للدائرة الفخ الجنين العلوي (انظر أيضا الملف التكميلي).
- استخدام الأبعاد المبينة في الشكل 1 باء و دال 1 للفخ جيدا.
- استخدام الأبعاد في الشكل 1 للدائرة فراغ أسفل.
- استخدام الأبعاد في الشكل 1B للهواء في/منفذ.
- استخدام طابعة 3D (بدقة 0.1 ملم) لطباعة القالب؛ انظر الجدول للمواد الراتنج الموصى بها لاستخدامها للطباعة.
ملاحظة: يوصي بالطابعات ثلاثية الأبعاد بدقة 0.1 مم لتصنيع قالب أرايينج (انظر الجدول للمواد). اللون المقترح لسطح القالب هو رمادي داكن أو أسود.
2-الزرد الجنين التفريخ
- مكان اثنين من أزواج من سمك الذكور والإناث للتزاوج مربع قبل التبويض بيوم واحد. منفصلة من الذكور والإناث بمقسم بلاستيك الشفاف.
- الإقلاع الفواصل في الصباح لخلط الأسماك الذكور والإناث.
- إزالة الأسماك الذكور والإناث وجمع الزرد الأجنة باستخدام مصفاة مش غرامة. أغسل الماء الأجنة مع البيض 250 مل (انظر الجدول للمواد).
- نقل الأجنة التي تم جمعها إلى أطباق بتري (90 ملم في القطر) مع الحل في هولتفريتير (انظر الجدول للمواد) وإزالة أجنة ميتة والمخصبة باستخدام ستيريوميكروسكوبي.
- وضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية. في ح 4 وظيفة التسميد (hpf) ومراقبة الأجنة وإزالة أي أجنة ميتة وغير صحية. الأجنة الآن جاهزة للخطوة التالية.
3-إعداد أرايينج القالب
- أغسل القالب 2 – 3 مرات بواسطة 500 مل من الماء ووضعه في فرن التجفيف (45 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- الشريط الدائرة السفلي مع قطعة من ختم الفيلم (الشكل 2، الخطوة 1).
- قم بتوصيل مضخة الفراغ من خلال منفذ الهواء في الجزء السفلي من القالب.
ملاحظة: الفراغ الحد الأقصى الموصى به لمضخة فراغ هو 0.1 الآلام والكروب الذهنية. كن على علم من قوة الفراغ المستخدمة. إذا كان الضغط السلبي قوية جداً، قطع حفرة على شكل الصليب على الفيلم الختم إلى انخفاض الضغط.
4-أرايينج "الأجنة الزرد" إلى لوحة 96-جيدا
- استخدام ماصة نقل بلاستيك، مكان حوالي 150 الأجنة في القالب، كما هو موضح في الشكل 2، الخطوة 2.
- قم بتوصيل مضخة فراغ مخرج الهواء لتوليد ضغط سالب في قاعة مختومة بختم الفيلم في الخطوة 3، 3.
- هز القالب كامل أفقياً حتى كل جيدا على الجنين واحد أكمنة (الشكل 2، الخطوة 3).
ملاحظة: إذا كان حل هولتفريتير يجف قبل الأجنة محاصرون في كل بئر، إضافة الحل إضافية هولتفريتير في غرفة الفخ وكرر هذه الخطوة. - تجاهل حل إضافي هولتفريتير والأجنة التي هي شرك لا في الآبار (الشكل 2، الخطوة 4).
- قم بإيقاف تشغيل وقطع مضخة فراغ.
- ضع لوحة 96-جيدا قياسية رأسا على عقب ضد القالب (الشكل 2، الخطوة 5) وتدوير كليهما في نفس الوقت (الشكل 2، الخطوة 6).
- اضغط على الجزء السفلي من القالب أو توصيل الهواء منفذ للغبار غاز مضغوط يمكن نقل الأجنة جميع المحاصرين من القالب إلى لوحة 96-جيدا (الشكل 2، الخطوة 6).
- كرر الخطوة 4.1 إلى 4.8 لإعداد إضافية من لوحات متعددة جيدا.
- إزالة الفيلم الختم وغسل القالب 3 مرات من أعلى إلى أسفل مع منزوع 500 مل من الماء للاستخدام في المستقبل.
ملاحظة: لا تستخدم أي من المذيبات العضوية، مثل الإيثانول، لتنظيف القالب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 3 قالب أرايينج نموذجية طباعة 3D. هذا القالب يستخدم الراتنج حساس كمواد خام وأدلى طابعة ثلاثية الأبعاد؛ تم تطبيق طبقة من الطلاء الأسود لتوفير أفضل على النقيض من لون الأجنة. موقف الآبار 96 (12 من 8) صممت لتناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. وبالمثل، يمكن أيضا تصميم قالب جيدا (24 من 16) 384 وملفقة باستخدام نفس الأسلوب. رأسا على عقب الدائرة كانت أكبر قليلاً من صفيحة 96-جيدا قياسية لتوفير المناسب أفضل. وصممت الأخاديد أيضا عقد أجنة إضافية أثناء أرايينج.
بمعدل متواضع، يمكن إعداد لوحات 20 استخدام قالب أرايينج طباعة 3D خلال 30 دقيقة، بينما ألواح اثنين أو ثلاثة فقط يمكن إعدادها يدوياً. ويبين الجدول 1 مقارنة بين عمليات القالب اليدوي والروبوتية وأرايينج. ويبين الشكل 4 مقارنة بين لوحات اثنين، واحد صفت في قالب أرايينج طباعة 3D، أعد يدوياً. استخدام قالب أرايينج، كان هناك كمية ضئيلة من سائل نقل الأجنة، مما جعلها ملائمة لزيادة التعرض للتجارب.
ويبين الشكل 5 أن كانت هناك لا آثار كبيرة على الحالة الصحية العامة للأجنة بعد يجري مطلي بأساليب قالب اليدوي وأرايينج. للتأكد من الأجنة لم تتأثر بهذه عملية أرايينج، تابعنا تطور الجنين بعد أرايينج لهم في لوحات 96-جيدا لمدة 3 أيام. معدل الفقس، ومعدل البقاء على قيد الحياة، ومعدل تشوه الأجنة الزرد في 24 و 48 و 72 هبف كانت كلها قابلة للمقارنة مع الأجنة صفت يدوياً.
رقم 1: تصميم جنينا الزرد أرايينج القالب. (ألف و جيم) 3 د ماكس الرسم عرض نظرة عامة على القالب. شريحة (ب) عرض القالب. (د) عرض جزئية من القالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الخطوات النموذجية عند استخدام قالب أرايينج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صور فوتوغرافية لقالب أرايينج طباعة 3D- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الصور المجهرية للأجنة بعد نقلها إلى لوحة 96-جيدا- (أ) صورة جزئية صفيحة 96، حسنا صفت بالقالب. (ب) صورة جزئية من صفيحة 96، حسنا صفت يدوياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الوضع الصحي العام للأجنة بعد يجري مطلي بأساليب قالب اليدوي وأرايينج- استناداً إلى الفقس، غير طبيعية، ومعدلات البقاء على قيد الحياة للأجنة بعد مطلي باستخدام أما يدوياً أو بأساليب قالب أرايينج، لوحظت لا آثار كبيرة على الصحة العامة للأجنة في كلتا الحالتين. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| دليل | منصة الروبوتية | قالب أرايينج | |
| تصفيح الوقت | 10 – 30 دقيقة/لوحة | 5 – 10 دقيقة/لوحة | 1 – 2 دقيقة/لوحة |
| التكلفة | منخفض | عالية | منخفض |
| التدريب المطلوب | الحد الأدنى | عالية | Minumum |
| مجال العمل | الصغيرة | كبيرة | الصغيرة |
| تأثير على الأجنة | يذكر أن لا شيء | يذكر أن لا شيء | يذكر أن لا شيء |
| كمية السائل المضافة كل بئر | عشوائية | 5 – 10 ميليلتر | الحد الأدنى |
الجدول 1: مقارنة بين عمليات القالب اليدوي والروبوتية وأرايينج-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك اثنين من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما وثيقا لتنفيذ ناجح لقالب طباعة 3D أرايينج الأجنة الزرد.
هو العامل الأكثر أهمية في تصميم القالب أرايينج الفخ أيضا. يجعل بالتأكيد هناك جنين واحد فقط محاصرين في كل بئر، واحدة ينبغي إيلاء اهتمام وثيق للقطر وعمق البئر الفخ، والقطر من خلال ثقب. القطر الموصى بها ضمن 1.5 إلى 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة). ينبغي أن يكون عمق الفخ جيدا داخل 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة) لتجنب التراص الأجنة في البئر نفسها. القطر من خلال ثقب ينبغي أن يكون قرابة نصف قطرها جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة) تفادي الأجنة التي تقلص من خلال الثقب بالضغط السلبي. نظراً لتعقيد التصميم، ينصح بتقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد لتصنيع قالب أرايينج.
هو جوهر القالب أرايينج إيقاع الأجنة الفردية في مواقع محددة، أي الوظائف التي تناسب مع صفيحة 96-أو 384 جيدا. لخلق ضغط سلبي مناسبة لعقد الأجنة الفردية في المكان دون الأضرار بها، واحدة يجب ضبط الضغط السلبي التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز الشفط. قد تدمر الكثير من الضغوط الأجنة، بينما الضغط قليلاً جداً قد لا اعتراض عليها في الآبار. ولذلك، ينصح بشدة لمراقبة الأجنة أكمنة في القالب تحت ستيريوميكروسكوبي قبل تحويلها إلى لوحات مولتيويل. وعلاوة على ذلك، خلال الفخ، الأجنة قد يتعرض للهواء أثناء هذه العملية. وإذا حدث ذلك، أضف إضافية هولتفريتير المتوسطة في قاعة الفخ وفقا للخطوة 4، 3. أيضا، بسبب احتمال الأجنة التعرض إلى الهواء، البروتوكول الحالي لا يعمل على ديتشوريوناتيد الزرد الأجنة.
يوفر هذا القالب أرايينج قدم في هذا العمل نهجاً مبتكراً لإنشاء منصة فحص منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية باستخدام أجنة الزرد. مقارنة بالمنصات الآلية المحددة سابقا أو الصك على أساس قياس تدفق المتاحة تجارياً، هذا الأسلوب هو سهل الاستخدام ولا يتطلب التدريب المتطور. أخذ مزايا تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد، واحد يمكن بسهولة تغيير تنسيق القالب أرايينج لتناسب أغراض مختلفة.
القالب والبروتوكول في شكله الحالي لا يزال يتطلب بعض العمل اليدوي. تبسيط الإجراء يمكن زيادة تحسين مستوى الإنتاجية وزيادة كمية ألواح مولتيويل التي أعدت خلال فترة قصيرة من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد شغل المؤلفين براءة في وصف قالب طباعة 3D.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها البرنامج "1000plan الشباب" و "أموال بدء التشغيل" من جامعة تونغجى، وتشرف منحة # 21607115 21777116 (لين).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
