Summary
Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.
Abstract
De zebravis is dat een wereldwijd erkende zoetwater organisme vaak gebruikt in Ontwikkelingsbiologie, milieutoxicologie en ziekten bij de mens verwante onderzoeksterreinen. Dankzij haar unieke eigenschappen, met inbegrip van grote vruchtbaarheid embryo doorschijnendheid, snelle en gelijktijdige ontwikkeling, enz., zebravis embryo's worden vaak gebruikt voor grootschalige toxiciteit beoordeling van chemische stoffen en drug/compound screening. Een typische screeningprocedure omvat volwassen zebrafish kuitschieten, selectie van embryo's en de embryo's in multi goed platen arraying. Vanaf daar embryo's worden onderworpen aan blootstelling en de giftigheid van chemische of de doeltreffendheid van de drugs/verbindingen kan relatief snel op basis van fenotypische opmerkingen worden geëvalueerd. Onder deze processen is embryo's arraying een van de meest tijdrovend en arbeidsintensief stappen waarmee de doorvoer niveau wordt beperkt. In dit protocol presenteren wij een innovatieve benadering die maakt gebruik van een 3D-gedrukte arraying sjabloon in combinatie met vacuüm manipulatie om te versnellen deze moeizame stap. Het protocol hierin beschrijft de algemene opzet van de arraying sjabloon en een stapsgewijze procedure, gevolgd door representatieve resultaten en gedetailleerde experimentele opzet. Bij de uitvoering van moet deze aanpak voordelig blijken te zijn in een verscheidenheid van toepassingen van onderzoek gebruik van zebravis embryo's als het testen van onderwerpen.
Introduction
Als een populaire modelorganisme, wordt zebravis veel gebruikt op het gebied van geneeskunde en toxicologie1,2,3,4. Vergeleken bij in vitro platformen, zebravis bieden veel meer biologische complexiteit dat een of twee celtypes kunnen niet bieden. Naast een hele organisme model, van de zebravis grote vruchtbaarheid, snelle en gelijktijdige embryonale ontwikkeling en hoge orgel translucentie hebben gegeven de unieke voordelen van dit model worden gebruikt voor grootschalige toxiciteit of drugs/samengestelde screening van5. De honderden embryo's geproduceerd door een paar volwassen zebrafish elke week overtreffen elke andere hele diermodellen en het geschikt voor hoge throughput screening hebben gemaakt.
Een typische screeningprocedure met behulp van de zebravis impliceert een aanzienlijke hoeveelheid handenarbeid, zoals volwassen zebrafish kuitschieten, embryo selectie, en arraying embryo's in geschikte containers waar zij zijn onderworpen aan een blootstelling via water onderdompeling. De ontwikkeling van de embryo's wordt gecontroleerd en waarneembare eindpunten zoals sterfte en uitkomstpercentage abnormaliteit zijn vaak handmatig geëvalueerd en gebruikt als de voorlopige identificaties van de giftigheid van chemische stoffen of aanwijzingen voor de effectiviteit van drugs of verbindingen. Om te versnellen naar de screeningprocedure, werden benaderingen zoals geautomatiseerde beeldvorming en beeldanalyse computerondersteunde eerder onderzocht. Bijvoorbeeld, zijn microscopen met een hoog gehalte imaging mogelijkheden aangepast om te voeren geautomatiseerde helder-veld of fluorescentie imaging op zebrafish embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia van 96/384 goed platen6. Microfluidic apparaten in combinatie met microscopen werden gebruikt om de positie van de zebravis larven door manipulatie van de huidige voor beeldvorming van de hersenen neuronen7. Deze benaderingen kon aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de overnames van de afbeelding ten opzichte van traditionele handmatige bediening. Bovendien, met een groot aantal afbeeldingen wordt gegenereerd, beeld analyse gereedschappen zijn ook ontwikkeld om te versnellen naar de verwerking van de gegevens, zoals aangetoond door Liu et al. en Tu et al. 8 , 9.
Als het niveau van de doorvoer van beeldvorming en foto analyse toeneemt, werd het duidelijk dat de snelheidslimieten stap voor screening ligt bij de voorbereiding van de zebravis embryo's voor blootstelling, wat meestal betekent arraying hen in 96 - of 384-Wells-platen. Om op te lossen dit knelpunt stap, visie-geleide robotica werden ontwikkeld door Mandrell et al. 10 en ons11 eerder te vervangen manueel hanteren, maar de instrumenten waren nogal verfijnde en er is een diepe leercurve om dergelijke technieken. Daarom, om te zorgen voor een easy-to-use aanpak wordt een belangrijke factor om het niveau van de doorvoer van zebravis screening verder te verbeteren en is de belangrijkste doelstelling van dit werk.
In dit werk, we ontworpen en gefabriceerd van een embryo arraying sjabloon door 3D printen. Dergelijke een arraying sjabloon is ontworpen om het vangen van zebravis embryo in putten die bij een standaard 96-wells-plaat passen. In plaats van de selectie van embryo's en arraying hen in individuele put één voor één, kon één embryo entrapment en matrix alle 96 embryo's in een multiwall plaat tegelijk uitvoeren. Met behulp van deze sjabloon en het volgende protocol, kan een aanzienlijk verhoging van de efficiëntie van het arraying embryo's in multiwall platen, die zou in termijn boost de screening capaciteit ten minste vertienvoudigd, ten opzichte van handmatige bediening. De hieronder beschreven protocol bevat een totaalconcept voor de arraying sjabloon, zebravis kuitschieten, embryo's worden verzameld en arraying. Figuur 1 toont de algemene opzet van de arraying sjabloon. Figuur 2 geeft een overzicht van de stapsgewijze protocol over het gebruik van de sjabloon in delen 3 en 4 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp en fabricage van een zebravis embryo's Arraying sjabloon
-
Het arraying ontwerpsjabloon met een 12 door 8, 96-Wells lay-out die past bij een standaard 96-wells-plaat. Gebruik de afmetingen in figuur 1A voor de bovenste embryo entrapment kamer weergegeven (Zie ook het aanvullende bestand).
- De dimensies weergegeven in figuur 1B en 1 D voor de entrapment goed gebruiken.
- De dimensies in Figuur 1 c gebruiken voor het onder vacuüm kamer.
- De dimensies gebruiken in figuur 1B voor de lucht in / uitlaat.
- Gebruik van een 3D-printer (met de precisie van 0.1 mm) de sjabloon; Zie Tabel van materialen voor aanbevolen hars worden gebruikt voor het afdrukken.
Opmerking: 3D printers met een precisie van 0.1 mm worden aanbevolen voor de fabricage van de arraying sjabloon (Zie Tabel van materialen). De voorgestelde kleur voor het oppervlak van de sjabloon is donkergrijs of zwart.
2. de zebravis Embryo kuitschieten
- Plaats twee paren van mannelijke en vrouwelijke vissen per paring vak één dag voordat het kuitschieten. Aparte mannetjes en vrouwtjes door een doorzichtige plastic verdeler.
- Opstijgen de scheidingslijnen in de ochtend te mengen van mannelijke en vrouwelijke vissen.
- Verwijder de mannelijke en vrouwelijke vissen en verzamelen zebrafish embryo's met behulp van een zeef fijn gaas. Wash de embryo's met ei van 250 mL water (Zie Tabel van materialen).
- De verzamelde embryo's overbrengen in petrischalen (diameter 90 mm) met Holtfreter de oplossing (Zie Tabel van materialen) en verwijderen van dode en onbevruchte embryo's met behulp van een stereomicroscoop.
- Plaats de embryo's in een 28,5 ° C incubator. 4 uur post bevruchting (hpf), observeren van de embryo's en verwijder eventuele dode en ongezonde embryo's. De embryo's zijn nu gereed voor de volgende stap.
3. voorbereiding van de sjabloon Arraying
- Wassen van de sjabloon 2 tot 3 keer met 500 mL gedeïoniseerd water en zet het in de droogstoof (45 ° C) gedurende 5 minuten.
- Tape de zaal van de bodem met een stuk van de sluiting van de film (Figuur 2stap 1).
- Sluit een vacuümpomp via de luchtuitlaat aan de onderkant van de sjabloon.
Opmerking: De aanbevolen max vacuüm voor de vacuümpomp is 0,1 Mpa. Wees bewust van de kracht van het vacuüm gebruikt. Als de onderdruk te sterk is, een gat kruisvormig op de verzegeling film te verlagen van de druk.
4. arraying Zebrafish embryo's in een 96-wells-plaat
- Plaats met een kunststof transfer pipette, ongeveer 150 embryo's in de sjabloon, zoals aangetoond in Figuur 2,, stap 2.
- Sluit de vacuümpomp aan de luchtuitlaat voor het genereren van de negatieve druk in de zaal verzegeld door de verzegeling film in stap 3.3.
- Schud de hele sjabloon horizontaal totdat elk goed één embryo in de val gelokt (Figuur 2, stap 3 heeft).
Opmerking: Als de Holtfreter van oplossing opdroogt voordat de embryo's in elk putje zitten, toevoegen van extra Holtfreter de oplossing in de entrapment zaal en herhaal deze stap. - Extra Holtfreter de oplossing en embryo's die in de putjes (Figuur 2, stap 4) niet in de val zijn gelokt negeren.
- Uitschakelen en koppel de vacuümpomp.
- Plaats van een standaard 96-wells-plaat ondersteboven tegen de sjabloon (Figuur 2, stap 5) en draaien beide op hetzelfde moment (Figuur 2, stap 6).
- Tik op de bodem van de sjabloon of het verbinden van de lucht afzetmogelijkheid een samengeperst gas afstoffen kan voor het overzetten van alle gevangen embryo's van de sjabloon naar de 96-wells-plaat (Figuur 2, stap 6).
- Herhaal stap 4.1 tot 4.8 te bereiden extra multi goed platen.
- Verwijder de verzegeling film en wassen van de sjabloon 3 keer van boven naar beneden met 500 mL gedeïoniseerd water voor toekomstig gebruik.
Opmerking: Gebruik geen organische oplosmiddelen, zoals ethanol, schoon van de sjabloon te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont een typische 3D-gedrukte arraying sjabloon. Deze sjabloon lichtgevoelige hars gebruikt als grondstof en werd gemaakt door een 3D-printer; een laag van zwarte verf was aangebracht om te zorgen voor een beter contrast met de kleur van embryo's. De positie van 96-wells (12 door 8) werd ontworpen om te passen met een standaard 96-wells-plaat. Ook een 384 (24 door 16) goed sjabloon konden ook worden ontworpen en vervaardigd gebruikend de zelfde methode. De opwaartse kamer was iets groter dan een standaard 96-wells-plaat om te zorgen voor een beter passend. Groeven werden ook ontworpen om te houden van de extra embryo's tijdens het arraying.
Tegen een bescheiden tarief kon 20 platen worden voorbereid met de 3D-gedrukte arraying sjabloon binnen 30 min, terwijl slechts twee tot drie platen kunnen handmatig worden voorbereid. Tabel 1 toont een vergelijking tussen de handmatige, robotic en arraying sjabloon operaties. Figuur 4 geeft een vergelijking tussen de twee platen, een gekleed in de 3D-gedrukte arraying sjabloon, handmatig wordt bereid. Met de arraying sjabloon, was er een te verwaarlozen hoeveelheid vloeistof overgebracht met de embryo's, waardoor het ook geschikt voor verdere blootstelling experimenten.
Figuur 5 toont aan dat er geen significante effecten op de algemene gezondheidstoestand van de embryo's na wordt verguld door handmatige en arraying sjabloon methoden. We hebben gevolgd om ervoor te zorgen dat de embryo's niet beïnvloed door dergelijk arraying proces, embryo-ontwikkeling na arraying hen in de 96-wells-platen gedurende 3 dagen. De broedeieren, overlevingskans, en misvorming zebrafish embryo's bij 24, 48 en 72 hpf waren allemaal vergelijkbaar met de embryo's handmatig gekleed.
Figuur 1: ontwerp van een embryo van de zebravis arraying sjabloon. (A en C) 3-d Max tekening toont het overzicht van de sjabloon. (B) dwarsdoorsnede bekijken van de sjabloon. (D) een gedeeltelijke weergave van de sjabloon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: typische stappen bij het gebruik van de arraying sjabloon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: foto's van een 3D-gedrukte arraying sjabloon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: microscopische beelden van embryo's nadat overgebracht naar 96-wells-plaat. (A) gedeeltelijke beeld van een 96-wells-plaat gekleed in de sjabloon. (B) gedeeltelijk beeld van een 96-wells-plaat handmatig gekleed. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: de algemene gezondheidstoestand van de embryo's na wordt verguld door handmatige en arraying sjabloon methoden. Gebaseerd op de broedeieren, abnormale, en de overlevingskansen van de embryo's nadat ze verguld met behulp van de handleiding of de arraying sjabloon methoden, geen significante effecten op de algehele gezondheid van de embryo's in beide gevallen werden waargenomen. Foutbalken zijn standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Handmatig | Robotic Platform | Arraying sjabloon | |
| Beplating tijd | 10-30 min/plaat | 5 – 10 min/plaat | 1-2 min/plaat |
| Kosten | Lage | Hoge | Lage |
| Vereiste opleiding | Minimum | Hoge | Minimum |
| Werkende gebied | Kleine | Grote | Kleine |
| Effect op de embryo 's | Weinig tot geen | Weinig tot geen | Weinig tot geen |
| Hoeveelheid vloeistof toegevoegd per putje | Willekeurige | 5-10 ΜL | Minimum |
Tabel 1: Vergelijking van handmatig, robotic en arraying sjabloon operaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee essentiële stappen in dit protocol die nauwlettend in de gaten voor een succesvolle implementatie van 3D-gedrukte sjabloon voor arraying zebrafish embryo's vereisen.
De meest belangrijke factor op het ontwerp van de arraying sjabloon is de entrapment goed. Maakt zeker er is slechts één embryo gevangen in elk putje, een moet aandacht besteden aan de diameter en de diepte van de put entrapment, en de diameter van het door gat. De aanbevolen diameter is binnen 1,5 tot 2 keer van de diameter van een typische embryo (met inbegrip van de chorion). De diepte van de entrapment goed mag niet 2 keer van de diameter van een typische embryo (met inbegrip van de chorion) om te voorkomen dat de stapeling van embryo's in de zelfde put. De diameter van het door gat moet ongeveer de helft van de diameter van een typische embryo (met inbegrip van de chorion) om te voorkomen dat embryo's door het gat door de negatieve druk wordt geperst. Als gevolg van de complexiteit van het ontwerp, wordt 3D printing technologie aanbevolen voor de fabricage van de arraying sjabloon.
De essentie van de arraying sjabloon is het vangen van individuele embryo's op aangewezen locaties, dat wil zeggen de posities die bij een 96 - of 384-Wells-plaat passen. Als u wilt maken een behoorlijke negatieve druk aan de individuele embryo's op zijn plaats te houden zonder te beschadigen ze, moet een de onderdruk gegenereerd door het vacuüm apparaat aanpassen. Teveel druk kan vernietigen, de embryo's, terwijl te weinig druk hen niet in de putjes overlappen kan. Daarom is het sterk aanbevolen om het observeren van de embryo's in de sjabloon onder een stereomicroscoop in de val gelokt voordat u ze overbrengt naar de multiwell platen. Bovendien, tijdens entrapment, de embryo's kunnen worden blootgesteld aan lucht tijdens dit proces. Mocht dit gebeuren, het toevoegen van extra Holtfreter van middelgrote in de zaal van de entrapment volgens stap 4.3. Ook vanwege de mogelijkheid van embryo's worden blootgesteld aan de lucht, werkt het huidige protocol niet op dechorionated zebrafish embryo's.
De arraying sjabloon gepresenteerd in dit werk biedt een innovatieve benadering voor de oprichting van een platform van de lage kosten en high-throughput screening met behulp van de zebravis embryo's. Vergeleken met de eerder vastgestelde robotic platforms of verkrijgbare stroom cytometry gebaseerde instrument, deze methode is eenvoudig te gebruiken en vereist geen verfijnde opleiding. De voordelen van het nemen van het 3D printing technologie, een kon gemakkelijk veranderen de indeling van de arraying sjabloon aan verschillende doeleinden.
De sjabloon en het protocol in zijn huidige vorm nog steeds vereist wat handmatige werk. Stroomlijning van de procedure kan verder verbeteren van het niveau van de doorvoer en verhoging van het bedrag van multiwell platen bereid binnen een korte periode van tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben een patent op de beschreven 3D-gedrukte sjabloon ingevuld.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het "1000plan Youth"-programma, het opstarten middelen uit Tongji Universiteit en NSFC Grant # 21607115 en 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
