Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at designe og fabrikere en zebrafisk embryo opstiller skabelon, efterfulgt af en detaljeret procedure på brugen af sådanne skabelon for høj overførselshastighed zebrafisk embryo opstilling i en 96-brønd plade.
Abstract
For zebrafisk er en globalt anerkendt ferskvand organisme hyppigst anvendte i udviklingsmæssige biologi, miljømæssige toksikologi og menneskelig sygdom relaterede forskningsområder. Takket være dens unikke funktioner, herunder store frugtbarhed, embryo gennemskinnelighed, hurtig og den samtidige udvikling, etc., zebrafisk embryoner bruges ofte til stor skala toksicitet vurdering af kemikalier og medicin/stof screening. En typisk screeningprocedure indebærer voksen zebrafisk gydning, embryoner udvælgelse og opstilling af embryoner i multi godt plader. Derfra, embryoner er udsat for eksponering og kemiske toksicitet eller effektiviteten af narkotika/forbindelser kan evalueres relativt hurtigt baseret på fænotypiske observationer. Blandt disse processer er embryoner opstilling et af de mest tidskrævende og arbejdskrævende skridt, der begrænser overførselsniveauet. I denne protokol præsenterer vi en innovativ tilgang, der gør brug af en 3D-trykt arraying skabelon kombineret med vakuum manipulation for at fremskynde denne besværlige trin. Protokollen heri beskriver den overordnede udformning af skabelonen arraying, en detaljeret eksperimentel opsætning og trinvis, efterfulgt af repræsentative resultater. Når det er gennemført, denne fremgangsmåde skulle vise sig gavnlige i en række forskning applikationer ved hjælp af zebrafisk embryoner som test emner.
Introduction
Som en populær model organisme, er zebrafisk meget udbredt inden for medicin og toksikologi1,2,3,4. I forhold til in vitro- platforme, zebrafisk tilbyde meget større biologisk kompleksitet at en eller to celletyper kunne ikke. Udover at være en hel organisme model, zebrafisk store frugtbarhed, hurtig og samtidige embryonale udvikling og høj orgel gennemskinnelighed har givet denne model enestående fordele anvendes til storstilet toksicitet eller narkotika/sammensatte screening5. Hundredvis af embryoner produceret af et par af voksen zebrafisk hver uge overgå enhver anden hele dyremodeller og har gjort det egnet til high throughput screening.
En typisk screeningprocedure med anvendelse af zebrafisk indebærer en betydelig mængde manuelt arbejde, såsom voksen zebrafisk gydning, embryo valg, og opstiller embryoner i egnede beholdere, hvor de er udsat for eksponering gennem vand fordybelse. Udviklingen af embryoner er overvåget og observerbare slutpunkter som dødelighed, hatchability og abnormitet ofte evalueres manuelt og anvendes som foreløbig identifikation af toksiciteten af kemikalier eller angivelser af effektiviteten af stoffer eller forbindelser. For at fremskynde Screeningproceduren for, har tilgange såsom automatiseret billedbehandling og computerstøttet billedanalyse været undersøgt tidligere. For eksempel, er mikroskoper med højt indhold af imaging funktioner blevet tilpasset til at udføre automatiseret lysfelt eller fluorescens imaging på zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier fra 96/384 godt plader6. Mikrofluid enheder kombineret med mikroskoper blev brugt til at placere zebrafisk larver gennem nuværende manipulation til billeddannelse af hjernen neuroner7. Disse tilgange kunne væsentligt forbedre effektiviteten af billede erhvervelser i forhold til traditionel manuel betjening. Desuden med stort antal billeder, der bliver genereret, er billede analyseværktøjer også blevet udviklet for at fremskynde databehandlingen, som det fremgår af Liu et al. og Tu et al. 8 , 9.
Overførselsniveauet for billedbehandling og image analysis stiger, blev det klart, at den hastighedsbegrænsende trin for screening ligger ved at forberede zebrafisk embryoner for eksponering, hvilket typisk betyder opstiller dem i 96 - eller 384-godt plader. For at løse dette flaskehals trin, vision-guidede robotter blev udviklet af Mandrell et al. 10 og os11 tidligere at erstatte manuel håndtering, men instrumenterne var temmelig sofistikeret og der er en dyb indlæringskurve til at gennemføre sådanne teknikker. Derfor, at give en nem-at-bruge tilgang bliver en vigtig faktor til yderligere at forbedre overførselsniveauet zebrafisk screening og er hovedformålet med dette arbejde.
I dette arbejde, vi designede og fremstillede embryonet opstiller skabelon af 3D-printning. Sådan en arraying skabelon blev designet til at lokke zebrafisk embryo i brønde, der passer med en standard 96-brønd plade. I stedet for at vælge embryoner og opstiller dem ind i individuelle godt én efter én, kunne man udføre embryo fastklemning og array alle 96 embryoner i en multiwall plade på én gang. Brug denne skabelon og følgende protokol, kunne en markant øge effektiviteten af opstilling embryoner i multiwall plader, som vil på sigt øge screening kapaciteten mindst tifold i forhold til manuel betjening. Protokollen beskrevet nedenfor indeholder en overordnet design for opstilling skabelon, zebrafisk gydning, indsamlingsstedet og opstilling. Figur 1 viser den overordnede udformning af skabelonen arraying. Figur 2 viser en oversigt over den trinvise protokol om brug af skabelonen beskrevet i dele 3 og 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design og fabrikation af en zebrafisk embryoner opstiller skabelon
-
Arraying designskabelon med en 12 af 8, 96-godt layout, der passer til en standard 96-brønd plade. Brug dimensionerne vises i figur 1A for øvre embryo entrapment kammer (Se også den supplerende fil).
- Brug dimensionerne vist i figur 1B og 1 D for entrapment godt.
- Brug dimensionerne i figur 1 c for bunden vakuum kammer.
- Brug dimensionerne i figur 1B for luften i / outlet.
- Bruge en 3D-printer (med 0,1 mm precision) til at udskrive skabelonen; Se Tabel af materialer til anbefalede harpiks bruges til udskrivning.
Bemærk: 3D printere med en 0,1 mm precision anbefales til fabrikation af skabelonen arraying (Se Tabel af materialer). Den foreslåede farve til overfladen af skabelonen er mørkegrå eller sort.
2. zebrafisk Embryo gydning
- Placer to par af mandlige og kvindelige fisk pr. parring boks én dag før æglægning. Separat hanner og hunner af en klar plast skillevæg.
- Tage ned af dividers om morgenen at blande mandlige og kvindelige fisk.
- Fjern de mandlige og kvindelige fisk og indsamle zebrafisk embryoner ved hjælp af en bøde-maske si. Vask af embryoner med 250 mL æg vand (Se Tabel af materialer).
- Overføre de indsamlede embryoner til petriskåle (90 mm i diameter) med Holtfreters løsning (Se Tabel af materialer) og fjerne døde og ugoedet embryoner ved hjælp af et stereomikroskop.
- Placer embryoner i en 28,5 ° C inkubator. 4 h bogføre befrugtning (hpf), observere embryoner og fjerne eventuelle døde og usunde embryoner. Embryonerne er nu klar til næste trin.
3. forberedelse af opstilling skabelon
- Vaske skabelonen 2 – 3 gange med 500 mL deioniseret vand og sætte det ind i varmeskab (45 ° C) i 5 min.
- Tape bunden kammer med et stykke af forsegling film (figur 2trin 1).
- Tilslut en vakuumpumpe gennem luft udtag i bunden af skabelonen.
Bemærk: Den anbefalede max vakuum for vakuumpumpe er 0,1 Mpa. Være opmærksom på styrken af vakuum bruges. Hvis undertryk er for stærk, skære et kors-formet hul på filmens forsegling til at sænke trykket.
4. opstilling zebrafisk embryoner i en 96-brønd plade
- Ved hjælp af en plastik overførsel pipette, placere ca 150 embryoner i skabelonen, som vist i figur 2, trin 2.
- Tilsluttes luft stikkontakt til at generere undertryk i kammeret forseglet af forsegling filmen taktfast 3.3 vakuumpumpe.
- Ryst hele skabelonen vandret, indtil hver godt har ét embryon lokket i en fælde (figur 2, skridt 3).
Bemærk: Hvis den Holtfreter løsning tørrer op før embryonerne er fanget i hver brønd, tilføje yderligere Holtfreter løsning i mødesalen fastklemning og Gentag dette trin. - Kassere ekstra Holtfreter løsning og embryoner, der ikke er fanget i wells (figur 2, trin 4).
- Slukke og afbryde forbindelsen til vakuumpumpen.
- Placere en standard 96-brønd plade hovedet mod skabelon (figur 2, trin 5) og rotere begge på samme tid (figur 2, trin 6).
- Tryk på bunden af skabelonen eller forbinde luften outlet til en komprimeret gas afstøvning kan for at overføre alle fangne embryoner fra skabelonen til 96-brønd plade (figur 2, trin 6).
- Gentag trin 4.1 til 4,8 at forberede yderligere multi godt plader.
- Fjerne forsegling film og vaske skabelon 3 gange fra top til bund med 500 mL deioniseret vand til fremtidig brug.
Bemærk: Brug ikke nogen organiske opløsningsmidler som ethanol, for at rengøre skabelonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser en typisk 3D-trykt arraying skabelon. Denne skabelon bruger lysfølsomme harpiks som råmateriale og blev lavet af en 3D printer; et lag af sort maling blev anvendt til at give en bedre kontrast til farven på embryoner. Placeringen af 96 brønde (12 af 8) var designet til at passe med en standard 96-brønd plade. Ligeledes en 384 (24 x 16) godt skabelon kunne også være designet og fremstillet ved hjælp af samme metode. Opadrettede kammer var lidt større end en standard 96-brønd plade til at give en bedre montering. Riller var også designet til at holde de ekstra embryoner under opstilling.
Med en beskeden sats, kunne 20 plader forberedes ved hjælp af 3D-trykt arraying skabelon inden for 30 min, mens kun to til tre plader kunne være forberedt manuelt. Tabel 1 viser en sammenligning mellem manuel, robot, og opstiller skabelon operationer. Figur 4 viser en sammenligning mellem to plader, en klædt af den 3D-trykt arraying skabelon, en forberedt manuelt. Brug skabelonen arraying, var der en ubetydelig mængde væske overført med embryoner, hvilket også gjorde det bekvemt for yderligere eksponering eksperimenter.
Figur 5 viser, at der var ingen væsentlig indvirkning på den samlede sundhedsstatus for embryoner efter bliver forgyldt af manuel og opstiller skabelon metoder. For at sikre, at embryoner ikke blev berørt af sådan en arraying proces, fulgte vi embryo udvikling efter opstiller dem i 96-brønd plader i 3 dage. Udrugning sats, overlevelsesraten og misdannelse sats af zebrafisk embryoner på 24, 48 og 72 hpf var sammenlignelige med embryoner klædt manuelt.
Figur 1: Design af en zebrafisk embryo opstiller skabelon. (A og C) 3-d Max tegning viser oversigten over skabelonen. (B) tværsnit Se af skabelonen. (D) A delvis udsigt over skabelonen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: typisk trin, når du bruger skabelonen arraying. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fotografier af en 3D-trykt arraying skabelon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mikroskopiske billeder af embryoner efter overført til 96-brønd plade. (A) delvis billede af en 96-brønd plade klædt af skabelonen. (B) delvis billede af en 96-brønd plade klædt manuelt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: den overordnede sundhedsstatus for embryoner efter bliver forgyldt af manuel og opstiller skabelon metoder. Baseret på udklækningen, unormale, og overlevelsesprocenten for embryoner efter at være belagt med enten manuel eller metoderne arraying skabelon, ingen væsentlig indvirkning på den generelle sundhed af embryoner blev observeret i begge tilfælde. Fejllinjer er standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Manual | Robot Platform | Opstiller skabelon | |
| Plating tid | 10 – 30 min/plade | 5 – 10 min/plade | 1-2 min/plade |
| Omkostninger | Lav | Høj | Lav |
| Kræves uddannelse | Minimum | Høj | Minumum |
| Arbejder område | Lille | Store | Lille |
| Effekt på embryoner | Lidt at ingen | Lidt at ingen | Lidt at ingen |
| Mængde væske tilsat pr. brønd | Tilfældige | 5 – 10 ΜL | Minimum |
Tabel 1: Sammenligning af manuel, robot, og opstiller skabelon operationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to kritiske trin i denne protokol, der kræver opmærksomhed for en vellykket gennemførelse af 3D-trykt skabelon til opstilling zebrafisk embryoner.
Den vigtigste faktor for udformningen af den arraying skabelon er entrapment. Til gør sikker på der er kun ét embryon fanget i hver brønd, man bør være meget opmærksom diameter og dybden af entrapment brønden og diameteren af gennem hullet. Den anbefalede diameter er inden for 1,5 til 2 gange diameteren af en typisk embryo (herunder chorion). Dybden af entrapment godt bør være inden for 2 gange af diameteren af en typisk embryo (herunder chorion) at undgå stabling af embryoer i den samme godt. Diameter gennem hullet skal være ca halvdelen af diameteren af en typisk embryo (herunder chorion) at undgå embryoner bliver presset gennem hullet ved undertryk. På grund af kompleksiteten af designet anbefales 3D trykning teknologi for fabrikation af skabelonen arraying.
Essensen af den arraying skabelon er at lokke individuelt embryoner på udpegede steder, dvs positioner, der passer med en 96 - eller 384-godt plade. Hvis du vil oprette en ordentlig negativt pres at holde de enkelte embryoner på plads uden at beskadige dem, må man justere den negative pres genereret af en vakuumanordning. For meget pres kan ødelægge embryoner, mens for lidt pres ikke kan fælde dem i brøndene. Derfor er det stærkt anbefales at observere embryoner indesluttet i skabelonen under et stereomikroskop før du overfører dem til de flerhulsplader. Desuden under fastklemning, kan embryonerne blive udsat for luft under denne proces. Skulle dette ske, tilføjer yderligere Holtfreter medium i entrapment salen ifølge trin 4.3. Også, på grund af muligheden for embryoner bliver udsat for luft, den nuværende protokol virker ikke på dechorionated zebrafisk embryoner.
Skabelonen arraying præsenteres i dette værk indeholder en innovativ tilgang til oprettelse af en simpel-omkostninger og høj overførselshastighed screening platform ved hjælp af zebrafisk embryoner. I forhold til den tidligere etablerede robot platforme eller kommercielt tilgængelige flow flowcytometri-baserede instrument, denne metode er nem at bruge og kræver ikke avancerede uddannelse. At tage fordele af den 3D udskrivning teknologi, en kunne nemt ændre formatet af den arraying skabelon, der passer til forskellige formål.
Skabelon og protokol i sin nuværende form stadig kræve nogle manuelle arbejde. Strømline proceduren kunne yderligere forbedre overførselsniveauet og øge mængden af flerhulsplader forberedt inden for en kort periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har fyldt et patent på skabelonen 3D-trykt beskrevet.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af EU-programmet "1000plan ungdom", start midler fra Tongji Universitet, og NSFC Grant # 21607115 og 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
