Summary
כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.
Abstract
דג זברה הוא שאורגניזם גלובלית מוכרת מים טריים משמשים לעתים קרובות ב ביולוגיה התפתחותית, טוקסיקולוגיה סביבתית, מחלות אנושיות תחומי מחקר קרובים. בזכות תכונות ייחודיות שלה, כולל פוריות גדול העובר המוגבהת, פיתוח מהיר בו זמנית, וכדומה, דג זברה עוברי משמשים לעתים קרובות להערכת רעילות בקנה מידה גדול של כימיקלים, סמים/מתחם ההקרנה. תהליך ההקרנה טיפוסי כרוך דג זברה בוגרת ההשרצה, העוברים ובחירת, סידור במערך העוברים לוחות רב טוב. משם, העוברים הם נתון חשיפה הרעילות של כימיקלים, או היעילות של התרופות/תרכובות ניתן להעריך במהירות יחסית מבוסס על תצפיות פנוטיפי. בין תהליכים אלה, העוברים סידור במערך הוא אחד הצעדים מהגידולים ועתירת ביותר אשר מגביל את רמת התפוקה. פרוטוקול זה, אנו מציגים גישה חדשנית אשר גורם השימוש של תבנית arraying מודפס 3D בשילוב עם ואקום מניפולציה כדי להאיץ את שלב מפרך. פרוטוקול במסמך זה מתאר את התכנון הכולל של התבנית arraying, הגדרת הניסוי מפורט, הליך שלב אחר שלב, ולאחריו נציג תוצאות. כאשר מיושמת, גישה זו צריך להועיל במגוון רחב של יישומי מחקר שימוש דג זברה העוברים בדיקות נושאים.
Introduction
כאורגניזם מודל פופולרי, דג זברה נעשה שימוש נרחב בתחומים של רפואה ו הרעלים1,2,3,-4. לעומת במבחנה פלטפורמות, דג זברה מציעים המורכבות הביולוגית גדול הרבה שאחד או שני סוגי תאים לא יכול להציע. מלבד היותו יצור כל דגם, פוריות גדול של דג זברה, התפתחות מהירה, בו זמנית, איברים גבוהה המוגבהת העניקו זה מודל ייחודי יתרונות לשמש רעילות בקנה מידה גדול או סמים/מתחם הקרנת5. מאות עוברי המיוצר על ידי זוג אחד של דג זברה למבוגרים בכל שבוע לעלות על דוגמניות כל בעלי חיים אחרים, הפכו אותה מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה.
תהליך ההקרנה טיפוסי באמצעות דג זברה כרוך כמות משמעותית של עבודה ידנית, כגון דג זברה בוגרת ההשרצה, העובר בחירה, ואת סידור במערך עוברי לתוך מיכלים מתאים שבו הם נתונים לחשיפה באמצעות טבילה במי. התפתחות העוברים מנוטר, הנצפה נקודות קצה כגון תמותה, hatchability, חריגות לעיתים קרובות להעריך באופן ידני, משמש את ההזדהויות ראשוני של הרעילות של כימיקלים או סימנים של יעילות סמים או תרכובות. כדי לזרז את ההליך ההקרנה, גישות כגון הדמיה אוטומטית וניתוח תמונת המחשב בסיוע נחקרו בעבר. לדוגמה, מיקרוסקופים עם תכולה גבוהה ויכולות הדמיה הותאמו לביצוע אוטומטי בהיר-שדה או קרינה פלואורסצנטית הדמיה על דג זברה עוברי בשלבים התפתחותיים שונים 96/384 צלחות טוב6. התקנים Microfluidic בשילוב עם מיקרוסקופים שימשו כדי למקם דג זברה הזחלים באמצעות מניפולציה הנוכחי עבור הדמיה של נוירונים במוח7. גישות אלה יכול לשפר באופן משמעותי את היעילות של רכישות התמונה לעומת ידני מסורתיים. יתר על כן, עם מספר גדול של תמונות הנוצר, כלי ניתוח תמונה גם פותחו כדי להאיץ את העיבוד של הנתונים, כפי שמגלה ליו. et al. , טו. et al. 8 , 9.
רמת התפוקה הדמיה וניתוח התמונה גודלת, התברר כי הצעד הגבלת קצב להקרנה טמון בתהליך הכנת דג זברה עוברי חשיפה, אשר בדרך כלל אומר סידור במערך אותם לתוך צלחות 96 - או 384-ובכן. כדי לפתור את שלב זה צוואר בקבוק, רובוטיקה מונחה חזון פותחו על-ידי מנדרל. et al. 10 . ואנחנו11 בעבר כדי להחליף טיפול ידני אבל הכלים היו מתוחכמים למדי, יש עקומת למידה עמוקה ליישם טכניקות אלה. לכן, כדי לספק גישה נוחה לשימוש הופך להיות גורם חשוב אחד לשפר עוד יותר את רמת התפוקה של דג זברה ההקרנה היא המטרה העיקרית של עבודה זו.
בעבודה זו, אנו תוכנן, מפוברק העובר סידור במערך תבנית על-ידי הדפסת תלת-ממד. תבנית כזו arraying נועד אומללותו דג זברה העובר לתוך בארות שמתאימים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. במקום בחירה העוברים ולאחר סידור במערך אותם לבאר בודדת אחת, אחד יכול לבצע העובר מלכוד ית כל העוברים 96 לתוך צלחת multiwall בבת אחת. באמצעות תבנית זו, הפרוטוקול הבא, אחד יכול להגדיל באופן משמעותי את היעילות של סידור במערך עוברי לוחות multiwall, אשר בהמונח להגביר יכולת הקרנת לפחות פי עשרה, בהשוואה באופן ידני. הפרוטוקול המתואר להלן כוללת של עיצוב כללי עבור סידור במערך תבנית, דג זברה ההשרצה, אוסף העובר וכן סידור במערך. איור 1 מציג את התכנון הכולל של התבנית arraying. איור 2 מציג מבט כולל על פרוטוקול שלב אחר שלב באמצעות התבנית שמתואר חלקים 3 ו- 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב, ייצור של העוברים דג זברה סידור במערך תבנית
-
לעצב את תבנית arraying עם 12 על ידי 8, פריסת 96-ובכן שמתאים צלחת 96-ובכן סטנדרטי. שימוש המימדים המופיעים איור 1A עבור תא מלכוד העובר העליון (ראה גם את קובץ משלים).
- השתמש מידות איור 1B ו- 1 D על מלכוד היטב.
- להשתמש את המידות ב- 1C דמות בתחתית המצודה ואקום.
- להשתמש את הממדים איור 1B באוויר ב / עודפים.
- להשתמש במדפסת תלת-ממד (עם דיוק של 0.1 מ"מ) כדי להדפיס את התבנית; ראה טבלה של חומרי שרף מומלץ שישמש לשם הדפסה.
הערה: מדפסות תלת-ממד עם דיוק 0.1 מ מ מומלץ עבור ייצור התבנית arraying (ראה טבלה של חומרים). הצבע המוצע על פני השטח של התבנית הוא אפור כהה או שחור.
2. דג זברה העובר ההשרצה
- מקום שני זוגות של זכר ונקבה דגים למטר ההזדווגות תיבת יום אחד לפני ההשרצה. נפרד זכרים ונקבות על ידי מחיצה פלסטיק שקוף.
- תוריד את המחיצות בבוקר לערבב דג זכר ונקבה.
- הסר את הדגים זכר ונקבה ולאסוף עוברי דג זברה באמצעות מסננת פיין-רשת. לשטוף העוברים עם ביצה 250 מ ל מים (ראה טבלה של חומרים).
- להעביר את העוברים שנאספו פטרי (90 מ מ קוטר) עם הפתרון של Holtfreter (ראה טבלה של חומרים) ולהסיר את העוברים מופרית ומתה תוך שימוש stereomicroscope של.
- מקם את העוברים חממה 28.5 ° C. ב- 4 h פוסט הפריה (hpf), לבחון את העוברים ולהסיר כל העוברים מת, לא בריא. העוברים מוכנים עכשיו השלב הבא.
3. הכנת סידור במערך תבנית
- לשטוף את תבנית 2-3 פעמים עם יונים 500 מ"ל מים והכניס אותו לתוך תנור ייבוש (45 ° C) במשך 5 דקות.
- קלטת בתחתית המצודה עם חתיכה של איטום הסרט (איור 2שלב 1).
- חבר של משאבת ואקום דרך שקע אוויר בתחתית התבנית.
הערה: הואקום מקסימום המומלצת עבור משאבת ואקום הוא 0.1 Mpa. להיות מודע עוצמת הוואקום בשימוש. אם הלחץ השלילי חזק מדי, לחתוך חור בצורת צלב על הסרט איטום כדי להוריד את הלחץ.
4. סידור דג זברה עוברי במערך לתוך צלחת 96-ובכן
- באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק, למקם כ 150 עוברי לתוך התבנית, כפי שמתואר באיור 2, שלב 2.
- לחבר את משאבת ואקום שקע אוויר כדי ליצור לחץ שלילי בתא אטום על ידי הסרט איטום בשלב 3.3.
- מנערים את התבנית כולה אופקית עד בכל טוב יש אחד העובר לכודים (איור 2, שלב 3).
הערה: אם הפתרון של Holtfreter מתייבש לפני העוברים לכוד בתוך כל טוב, להוסיף הפתרון של Holtfreter נוספים בבית הבליעה מלכוד, חזור על שלב זה. - להיפטר פתרון של Holtfreter נוספת של עוברי כי הם לא לכודים בתוך הבארות (איור 2, בשלב 4).
- לכבות ולנתק את משאבת ואקום.
- מניחים צלחת 96-ובכן תקן הפוך נגד התבנית (איור 2, בשלב 5) ולסובב את שניהם באותו זמן (איור 2, לשלב 6).
- הקש על תחתית התבנית או לחבר את האוויר לשקע אבקת גז דחוס יכול העברת העוברים כל לכוד מהתבנית לצלחת 96-ובכן (איור 2, לשלב 6).
- חזור על שלב 4.1 עד 4.8 להכין צלחות רב טוב נוספים.
- להסיר את הסרט איטום ולשטוף את התבנית 3 פעמים מלמעלה עד למטה עם יונים 500 מ"ל מים לשימוש עתידי.
הערה: אין להשתמש כל ממסים אורגניים, כמו אתנול, לנקות את התבנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מראה תבנית אופיינית arraying מודפס 3D. תבנית זו משתמשת שרף פוטוסנסיטיבית כחומר גלם, נעשתה על ידי מדפסת תלת-ממד; שכבה של צבע שחור הוחל לספק ניגוד יותר לצבע של העוברים. המיקום של 96 וולס (12 על ידי 8) תוכנן כדי להתאים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. באופן דומה, תבנית טוב 384 (24 מאת 16) אפשר גם לעצב, מפוברק באמצעות אותה שיטה. היתרון קאמרית היה מעט יותר גדול מאשר צלחת 96-ובכן תקן כדי לספק התאמה טוב יותר. חריצים עוצבו גם להחזיק את העוברים נוספת במהלך סידור במערך.
בשיעור צנוע, צלחות 20 יכול להיות מוכן באמצעות התבנית arraying מודפס 3D בתוך 30 דקות, בעוד רק 2-3 צלחות יכול להיות מוכן באופן ידני. טבלה 1 מציגה השוואה בין תבנית ידנית רובוטית, סידור במערך המבצעים. איור 4 מציג השוואה בין שתי צלחות, שנערכה על-ידי התבנית arraying מודפס 3D, שהוכנו באופן ידני. באמצעות התבנית arraying, הייתה כמות זניחה של נוזל הועבר עם העוברים, אשר הפך אותה גם נוח לניסויים חשיפה נוספת.
איור 5 מראה שלא היו שום אפקטים משמעותיים על מצב בריאותו הכללית של העוברים לאחר להיות מצופה על ידי שיטות תבנית ידנית, סידור במערך. כדי לוודא שהעוברים לא הושפעו על ידי תהליך כזה arraying, עקבנו אחר התפתחות העובר לאחר סידור במערך אותם לתוך הצלחות 96-ובכן במשך 3 ימים. שיעור הבקיעה, שיעור ההישרדות שיעור מום עוברי דג זברה-24, 48, 72 hpf היו הכל דומה עם העוברים מופנים באופן ידני.
איור 1: העיצוב של העובר דג זברה סידור במערך תבנית. (A ו- C) 3-d Max הציור מציג סקירה של התבנית. (B) חתך רוחב הצג של התבנית. (ד) A מבט חלקי התבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שלבים אופייניים בעת שימוש בתבנית arraying. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: צילומים של תבנית מודפס 3D arraying. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תמונות מיקרוסקופיות של העוברים לאחר להעביר לצלחת 96-ובכן. תמונה חלקית (A) של צלחת 96-ובכן מופנים על ידי התבנית. תמונה חלקית (B) של צלחת 96-ובכן מופנים באופן ידני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מצב בריאותו הכללית של העוברים לאחר להיות מצופה על ידי שיטות ידנית, סידור במערך תבנית. בהתבסס על הבקיעה, חריג, שיעורי ההישרדות של העוברים לאחר מצופה באמצעות השיטות תבנית arraying או ידני, אין אפקטים משמעותיים על הבריאות הכללית של העוברים נצפו בכל מקרה. קווי שגיאה הן סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ידני | פלטפורמה רובוטית | סידור במערך תבנית | |
| זמן יופיצ | 10 – 30 min/צלחת | 5 – 10 דקות/צלחת | 1 – 2 min/צלחת |
| עלות | נמוך | גבוהה | נמוך |
| ההכשרה הנדרשת | מינימום | גבוהה | המינימום |
| אזור עבודה | קטן | גדול | קטן |
| השפעה על העוברים | קצת, או כלום | קצת, או כלום | קצת, או כלום |
| כמות נוזלים להוסיף לכל טוב | אקראי | 5-10 ΜL | מינימום |
טבלה 1: השוואה של תפעול ידני רובוטית, סידור במערך תבנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם שני שלבים קריטיים של פרוטוקול זה מחייבות תשומת לב לביצוע הטמעה מוצלחת של הדפסת תלת-ממד תבנית עבור סידור במערך דג זברה עוברי.
הגורם החשוב ביותר על העיצוב של התבנית arraying הוא מלכוד היטב. ודואג אין היחיד העובר לכוד בתוך כל טוב, אחד צריך לשלם קרוב לב הקוטר ואת העומק של הבאר מלכוד, קוטר החור דרך. הקוטר המומלץ נמצא במרחק 1.5 או פי 2 של הקוטר של העובר טיפוסי (כולל את chorion). עומק מלכוד היטב צריך להיות בתוך פי 2 של הקוטר של העובר טיפוסי (כולל את chorion) להמנע. הערמה של העוברים בתוך הבאר אותו. קוטר החור דרך צריכה להיות בערך כמחצית מקוטר העובר טיפוסי (כולל את chorion) להימנע העוברים על ידי דרך החור על ידי הלחץ השלילי. בשל המורכבות של העיצוב, טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד מומלצת עבור ייצור התבנית arraying.
המהות של התבנית arraying היא אומללותו עוברי בודדות במקומות המיועדים לכך, דהיינו תפקידים מתאימים עם צלחת 96 - או 384-ובכן. כדי ליצור לחץ שלילי ראוי להחזיק את העוברים בודדים במקום מבלי לפגוע בהם, אחד חייב להתאים את הלחץ השלילי שנוצר על ידי המכשיר ואקום. מדי לחץ עשוי להרוס את העוברים, בעוד מעט מדי לחץ עשוי מלכודת לא אותם בתוך הבארות. לכן, מומלץ מאוד לצפות את העוברים לכודים בתוך התבנית תחת stereomicroscope לפני העברת אותם לתוך הצלחות multiwell. יתר על כן, במהלך מלכוד, העוברים עלולה להיחשף לאוויר במהלך תהליך זה. זה יקרה, להוסיף של Holtfreter נוספים בינוני בבית הבליעה מלכוד לפי שלב 4.3. כמו כן, בשל האפשרות של עוברי נחשפים לאוויר, בפרוטוקול הנוכחי אינה פועלת על dechorionated דג זברה עוברי.
התבנית arraying הציג בעבודה זו מספקת גישה חדשנית להקמת פלטפורמה ההקרנה נמוכים, תפוקה גבוהה באמצעות דג זברה עוברי. בהשוואה של פלטפורמות רובוטיות שנקבעו קודם או מכשיר מבוסס cytometry זרימה זמינים מסחרית, בשיטה זו הוא קל לשימוש, לא דורשת אימון מתוחכמות. יתרונות רישום של טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד, אחד יכול לשנות בקלות את התבנית של תבנית arraying כדי להתאים למטרות שונות.
התבנית ואת פרוטוקול במתכונתה הנוכחית עדיין דורשים עבודה ידנית. ייעול ההליך יכול עוד לשפר את רמת התפוקה, להגדיל את כמות multiwell לוחות שהוכנו תוך תקופה קצרה של זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מילאו פטנט על התבנית מודפס 3D המתואר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית "1000plan הנוער", את הכספים הפעלה מאוניברסיטת טונגג'י, ו NSFC גרנט # 21607115 21777116 (לין).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
