Summary
Nous présentons ici un protocole visant à concevoir et fabriquer un embryon de poisson zèbre parant modèle, suivie d’une procédure détaillée sur l’utilisation de ce modèle pour haut débit embryon de poisson zèbre parant dans une plaque de 96 puits.
Abstract
Le poisson-zèbre est qu'un organisme reconnu à l’échelle mondiale d’eau douce fréquemment utilisés en biologie du développement, l’écotoxicologie et la maladie humaine de domaines de recherche connexes. Grâce à ses caractéristiques uniques, y compris la grande fécondité, translucidité de l’embryon, développement rapide et simultané, etc., des embryons de poisson-zèbre sont souvent utilisés pour l’évaluation de la toxicité à grande échelle de produits chimiques et pharmaceutiques/composéent dépistage. Une procédure de dépistage typique implique frai du poisson-zèbre adulte, sélection d’embryons et parant les embryons en plaques multipuits. A partir de là, des embryons sont soumis à l’exposition et la toxicité du produit chimique, ou l’efficacité des médicaments/composés peut être évaluée relativement rapidement basé sur des observations phénotypiques. Parmi ces processus, embryons parant est une des étapes plus longues et fastidieuses qui limite le niveau de débit. Dans ce protocole, nous présentons une approche novatrice qui permet d’utiliser le gabarit arraying imprimés 3D couplé avec vide manipulation pour accélérer cette étape laborieuse. Le protocole ci-après décrit la conception d’ensemble du modèle arraying, un montage expérimental détaillé et procédure pas à pas, suivie des résultats représentatifs. En cas d’implémentation, cette approche devrait s’avérer bénéfique dans une variété d’applications de recherche utilisant des embryons de poisson-zèbre comme sujets de vérification.
Introduction
Comme un organisme modèle populaire, le poisson zèbre est largement utilisé dans les domaines de la toxicologie et médecine1,2,3,4. Par rapport aux plates-formes de in vitro , zebrafish offrent beaucoup plus grande complexité biologique qu’un ou deux types de cellules ne pouvaient pas offrir. En plus d’être un organisme entier, modèle, du poisson-zèbre grande fécondité, rapid et simultané du développement embryonnaire et orgue haute translucidité ont donné cette avantages uniques du modèle à utiliser pour la toxicité à grande échelle ou de médicaments/composé5de dépistage. Les centaines d’embryons produits par une paire de poissons zèbres adultes chaque semaine surpassent tous les autres modèles animaux et rendent convenant au criblage à haut débit.
Une procédure de dépistage typique à l’aide de poisson-zèbre implique une quantité importante de travail manuel, comme le poisson-zèbre adulte frai, la sélection d’embryons et parant les embryons dans des conteneurs où ils sont soumis à une exposition par immersion dans l’eau. Le développement des embryons est surveillé et effets observables tels que de la mortalité, taux d’éclosion et anomalie sont souvent évalués manuellement et utilisés comme l’identification préliminaire de la toxicité des produits chimiques ou des indications de l’efficacité des médicaments ou composés. Pour accélérer la procédure de présélection, approches telles que l’imagerie automatisée et analyse d’images assistée par ordinateur ont été explorées auparavant. Par exemple, microscopes à forte teneur en capacités d’imagerie ont été adaptés pour effectuer le champ lumineux automatisé ou imagerie de fluorescence sur des embryons de poisson-zèbre à divers stades de développement de 96/384 puits plaques6. Dispositifs microfluidiques couplés avec des microscopes ont été utilisés pour placer des larves de poisson zèbre par le biais de la manipulation actuelle pour l’imagerie du cerveau neurones7. Ces approches pourraient améliorer considérablement l’efficacité des acquisitions d’image par rapport au fonctionnement manuel traditionnel. En outre, avec le grand nombre d’images générées, outils d’analyse image ont également été développés pour accélérer le traitement des données, tel que démontré par Liu et al. et Tu et al. 8 , 9.
Le niveau de débit de l’imagerie et analyse d’images augmente, il est devenu clair que l’étape cinétiquement limitante de dépistage réside dans le processus de préparation des embryons de poisson-zèbre pour l’exposition, ce qui signifie généralement les parant en plaques de 96 ou 384 puits. Pour résoudre cette étape de goulot d’étranglement, guidée par vision robotique ont été développés par Mandrell et al. 10 et nous11 précédemment en remplacement de manutention manuelle mais les instruments étaient plutôt sophistiqués et il y a une courbe d’apprentissage profonde pour mettre en œuvre ces techniques. Par conséquent, pour fournir une approche facile à utiliser devient un facteur important pour améliorer encore le niveau de débit du poisson-zèbre dépistage et est le principal objectif de ce travail.
Dans ce travail, nous avons conçu et fabriqué un embryon parant modèle par impression 3D. Un tel modèle arraying a été conçu pour piéger l’embryon de poisson zèbre dans les puits qui correspondent avec une plaque de 96 puits standard. Au lieu de la sélection d’embryons et leur parant dans les puits individuels un par un, on pourrait effectuer array et l’embryon des tous les embryons de 96 dans une plaque multiplie à la fois. À l’aide de ce modèle et le protocole suivant, un pouvant accroître considérablement l’efficacité des parant des embryons en plaques multiplis, ce qui seraient à terme stimuler la capacité de dépistage par rapport au moins dix fois, à commande manuelle. Le protocole décrit ci-dessous inclut un design d’ensemble pour le parant de modèle, le frai du poisson-zèbre, la collecte des embryons et parant. La figure 1 illustre la conception globale du modèle arraying. Figure 2 montre une vue d’ensemble du protocole étape par étape sur l’utilisation du modèle décrit dans les parties 3 et 4.
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Protocol
1. conception et Fabrication d’un embryons de poisson-zèbre parant modèle
-
Concevoir le modèle arraying avec un 12 par 8, mise en page 96 puits qui correspond à un standard des plaques 96 puits. Utilisez les dimensions indiquées dans la Figure 1 a pour la chambre de provocation policière supérieure embryon (voir aussi le fichier supplémentaire).
- Utilisez les dimensions indiquées à la Figure 1 b et 1 D de la provocation policière bien.
- Utilisez les dimensions dans la Figure 1 pour le bas du réservoir vide.
- Utilisez les dimensions dans la Figure 1 b pour l’air / prise de courant.
- Une imprimante 3D (avec une précision de 0,1 mm) permet d’imprimer le modèle ; Voir Table des matières pour la résine recommandée à utiliser pour l’impression.
Remarque : les imprimantes 3D avec une précision de 0,1 mm sont recommandés pour la fabrication du modèle arraying (voir la Table des matières). La couleur suggérée pour la surface du modèle est gris foncé ou noir.
2. embryon de poisson zèbre frai
- Placez deux paires des poissons mâles et femelles par accouplement boîte un jour avant la ponte. Séparés mâles et des femelles par un mélangeur-doseur en plastique transparent.
- Décoller les séparateurs dans la matinée à mélanger des poissons mâles et femelles.
- Retirer les poissons mâles et femelles et récupérer des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’une passoire à mailles fines. Lavez les embryons avec oeuf 250 mL d’eau (voir Table des matières).
- Transférez les embryons collectés pour boîtes de Pétri (90 mm de diamètre) avec la solution de Holtfreter (voir Table des matières) et retirer les embryons morts et non fertilisées à l’aide d’un stéréomicroscope.
- Placez les embryons dans un incubateur à 28,5 ° C. 4 h après la fécondation (hpf), observer les embryons et retirer les embryons morts et malsaines. Les embryons sont maintenant prêts pour l’étape suivante.
3. préparation du modèle de parant
- Laver le modèle 2 à 3 fois avec 500 mL d’eau désionisée et mettez-la dans l’étuve (45 ° C) pendant 5 min.
- Ruban adhésif de la chambre en bas avec un morceau de cachetage de film (Figure 2étape 1).
- Raccorder une pompe à vide par la sortie d’air au bas du modèle.
Remarque : Le vide max. recommandé pour la pompe à vide est de 0,1 Mpa. Soyez conscient de la force du vide utilisé. Si la dépression est trop forte, faites un trou en forme de croix sur le film d’étanchéité pour abaisser la pression.
4. parant des embryons de poisson-zèbre dans une plaque à 96 puits
- À l’aide d’une pipette en plastique, placer environ 150 embryons dans le modèle, comme illustré dans la Figure 2, étape 2.
- Branchez la pompe à vide à la sortie d’air pour générer une pression négative dans la chambre scellée par le film d’étanchéité à l’étape 3.3.
- Secouer le modèle entier horizontalement jusqu'à ce que chacun ait bien un embryon piégé (Figure 2, étape 3).
Remarque : Si la Solution de la Holtfreter sèche vers le haut avant les embryons sont pris au piège dans chaque puits, ajouter la Solution de Holtfreter supplémentaire dans la chambre de provocation policière et répétez cette étape. - Jeter la Solution de Holtfreter supplémentaire et les embryons qui ne sont pas piégés dans les puits (Figure 2, étape 4).
- Éteindre et débrancher la pompe à vide.
- Posez une plaque à 96 puits standard envers contre le gabarit (Figure 2, étape 5) et faites pivoter les deux à la fois (Figure 2, étape 6).
- Tapoter le fond du modèle ou de connecter l’air sortie d’un saupoudrage de gaz comprimé peut pour transférer les embryons tout pris au piège depuis le modèle à la plaque à 96 puits (Figure 2, étape 6).
- Répétez l’étape 4.1 à 4.8 pour préparer les plaques multipuits supplémentaires.
- Retirer le film de scellage et laver le modèle 3 fois de haut en bas avec 500 mL d’eau désionisée pour une utilisation future.
Remarque : N’utilisez pas de solvants organiques, comme l’éthanol, pour nettoyer le modèle.
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Representative Results
La figure 3 montre un modèle typique d’arraying 3D-imprimés. Ce modèle utilise une résine photosensible comme matière première et a été fait par une imprimante 3D ; une couche de peinture noire a été appliquée pour fournir un meilleur contraste avec la couleur des embryons. La position de 96 puits (12 par 8) a été conçue pour s’adapter avec une plaque de 96 puits standard. De même, un modèle bien de 384 (24 par 16) pourrait également être conçus et fabriqués en utilisant la même méthode. La tête en chambre était légèrement plus grosse qu’une plaque à 96 puits standard pour fournir un meilleur ajustement. Rainures ont également été conçus pour contenir les embryons supplémentaires pendant parant.
À un rythme modeste, 20 plaques pourraient être établis en utilisant le modèle d’arraying 3D-imprimés dans les 30 minutes, alors que seulement deux ou trois plaques peuvent être préparées manuellement. Le tableau 1 montre une comparaison entre les opérations manuelles, robotique et parant modèle. La figure 4 montre une comparaison entre deux plaques, rangés par le modèle d’arraying 3D-imprimé, celui établi manuellement. Utilisez le modèle d’arraying, il y avait une quantité négligeable de liquide transféré avec les embryons, qui la rendent aussi pratique pour plus amples expériences d’exposition.
La figure 5 montre qu’il n’y a aucun effet significatif sur l’état de santé général des embryons après être plaqué par des méthodes manuelles et parant modèle. Pour s’assurer que les embryons ne sont pas affectées par un tel processus arraying, nous avons suivi le développement de l’embryon après eux parant dans les plaques de 96 puits pendant 3 jours. Le taux d’éclosion, le taux de survie et taux de malformation des embryons de poisson-zèbre à 24, 48 et 72 hpf étaient tous comparables avec les embryons disposés manuellement.
Figure 1 : conception d’un embryon de poisson zèbre parant modèle. (A et C) 3-d Max dessin montrant la vue d’ensemble du modèle. (B) section Découvre du modèle. (D) une vue partielle sur le modèle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : les étapes typiques lorsque vous utilisez le modèle arraying. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : photographies d’un modèle 3D-imprimés d’arraying. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : les images microscopiques des embryons après transféré à plaque à 96 puits. (A) partie de l’image d’une plaque de 96 puits disposée par le modèle. (B) partie de l’image d’une plaque de 96 puits disposée manuellement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : l’état de santé général des embryons après être plaqué par des méthodes manuelles et parant modèle. Basé sur l’éclosion, anormale et le taux de survie des embryons après avoir été ne plaqué à l’aide soit manuel, soit les méthodes de modèle arraying, aucun effet significatif sur la santé globale des embryons ont été observées dans les deux cas. Barres d’erreur sont les écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Manuelle | Plate-forme robotique | Modèle parant | |
| Temps de placage | 10 – 30 min/plaque | 5 – 10 min/plaque | 1 – 2 min/plaque |
| Coût | Faible | Haute | Faible |
| Formation requise | Minimum | Haute | Minumum |
| Zone de travail | Petit | Grande | Petit |
| Effet sur les embryons | Peu ou aucun | Peu ou aucun | Peu ou aucun |
| Quantité de liquide ajouté par puits | Au hasard | 5 À 10 ΜL | Minimum |
Tableau 1 : Comparaison des opérations modèle manuel, robotique et parant.
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Discussion
Il y a deux étapes cruciales dans le présent protocole qui nécessitent une attention particulière pour une mise en œuvre du modèle 3D-imprimés pour parant des embryons de poisson-zèbre.
Le facteur le plus important sur la conception du modèle arraying est la provocation policière. À fait sûr, il n’y a qu’un seul embryon pris au piège dans chaque puits, un devrait porter une attention particulière pour le diamètre et la profondeur du puits provocation policière et le diamètre du trou à travers. Le diamètre recommandé est de 1,5 à 2 fois du diamètre d’un embryon typique (y compris le chorion). La profondeur de la provocation policière bien ferait partie de 2 fois le diamètre d’un embryon typique (y compris le chorion) afin d’éviter l’empilement des embryons dans le même puits. Le diamètre du trou à doit être environ à la moitié du diamètre d’un embryon typique (y compris le chorion) pour éviter les embryons étant coincés dans le trou par la pression négative. En raison de la complexité de la conception, la technologie d’impression 3D est recommandée pour la fabrication du modèle arraying.
L’essence du modèle arraying est de piéger des embryons individuels à des endroits désignés, c'est-à-dire les postes qui correspondent à une plaque de 96 ou 384 puits. Pour créer une pression négative appropriée pour tenir les embryons individuels en place sans les endommager, on doit ajuster la pression négative générée par le dispositif d’aspiration. Trop de pression peut détruire les embryons, alors qu’une pression insuffisante ne peut pas piéger dans les puits. Par conséquent, il est fortement recommandé d’observer les embryons pris au piège dans le modèle sous un stéréomicroscope avant de les transférer dans les plaques multipuits. En outre, au cours de la provocation policière, les embryons peuvent être exposés à l’air au cours de ce processus. Si cela se produit, ajouter de Holtfreter supplémentaire moyen dans la chambre de la provocation policière selon étape 4.3. En outre, en raison de la possibilité d’embryons étant exposé à l’air, le protocole actuel ne fonctionne pas sur des embryons de poisson-zèbre déchorionés.
Le modèle arraying présenté dans ce travail offre une approche innovante pour créer une plateforme de criblage à faible coût et haut débit utilisant des embryons de poisson-zèbre. Par rapport aux plates-formes robotiques préétablies ou instrument axée sur la cytométrie de flux commercialement disponible, cette méthode est facile à utiliser et ne nécessite pas une formation avancée. Profitant de la technologie d’impression 3D, on pourrait facilement changer le format du modèle arraying pour s’adapter à différentes fins.
Le modèle et le protocole sous sa forme actuelle nécessitent encore un travail manuel. Rationalisation de la procédure pourrait encore améliorer le niveau de débit et augmenter la quantité de plaques multipuits préparé dans un court laps de temps.
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Disclosures
Les auteurs ont rempli un brevet sur le modèle 3D imprimés décrit.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme « jeunesse de 1000plan », les fonds de démarrage de l’Université de Tongji et NSFC Grant # 21607115 et 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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