Summary
Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления zebrafish эмбриона, одевающ шаблон, следуют подробные процедуры на использование такой шаблон для высокой пропускной способности zebrafish эмбриона одевающ в 96-луночных плиту.
Abstract
Данио рерио является глобально признанных пресной воды организм часто используются в биологии развития, экологической токсикологии и болезней человека соответствующих исследований. Благодаря его уникальными особенностями, включая большие плодовитость, прозрачность эмбрионов, быстрое и одновременное развитие, и т.д.данио рерио эмбрионы часто используются для больших масштабах оценки токсичности химических веществ и наркотиков/соединение скрининга. Типичная скрининг процедура включает нереста взрослых рыбок данио, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в несколько хорошо пластины. От там эмбрионы подвергаются воздействия и токсичности химических, или эффективность препаратов/соединений может оцениваться относительно быстро основаны на фенотипическую наблюдений. Среди этих процессов одевающ эмбрионов является одним из самых длительных и трудоемких шагов, которые ограничивает уровень пропускной способности. В этом протоколе мы представляем новаторский подход, который делает использование шаблона выстраивающихся 3D-печать Наряду с вакуумной манипуляции, чтобы ускорить этот трудоемкий этап. Протокол в настоящем документе описывается общий дизайн выстраивающихся шаблон, подробный экспериментальной установки и шаг за шагом процедуры, после чего представитель результаты. При реализации, этот подход должен оказаться полезным в различных исследовательских приложений с помощью zebrafish эмбриона как тестирование субъектов.
Introduction
Как организм популярная модель данио рерио широко используется в области медицины и токсикологии1,2,3,4. По сравнению с платформами в пробирке , данио рерио предлагают гораздо большей биологической сложности, что один или два типа клеток не может предложить. Помимо того, что весь организм, модель, данио рерио большая плодовитость, быстрых и одновременных эмбрионального развития и высокий орган полупрозрачность дали уникальные преимущества этой модели использоваться для больших масштабах токсичности или наркотиков/соединение скрининг5. Сотни зародышей одна пара взрослых рыбок данио каждую неделю превосходят любой другой весь Животные модели и сделали это подходит для высокой пропускной способности скрининга.
Типичная скрининг процедура, с помощью данио рерио включает в себя значительное количество ручной работы, такие как взрослых рыбок данио нереста, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в соответствующих емкостях, где они подвергаются воздействию путем погружения в воду. Мониторинг развития эмбрионов и наблюдаемых конечные точки как смертность, выводимости и аномалий часто оцениваются вручную и используется в качестве предварительных опознавательные токсичность химических веществ или признаки эффективности наркотиков или соединений. Чтобы ускорить процедуру проверки, были изучены ранее подходов, таких как автоматическое создание образов и анализа компьютерных изображений. К примеру Микроскопы с высоким содержанием изображений возможности были адаптированы для выполнения автоматизированных ярко поле или флуоресценции изображений на zebrafish эмбриона на различных этапах своего развития от 96/384 хорошо пластины6. Microfluidic приборы, в сочетании с Микроскопы были использованы для позиции данио рерио личинок через текущую манипуляцию нейронов мозга7для воображения. Эти подходы могли бы значительно повысить эффективность поглощения изображения по сравнению с традиционной ручной работы. Кроме того с большим количеством изображений создаются, инструменты анализа изображений также были разработаны для ускорения обработки данных, как это продемонстрировано Лю et al. и ту et al. 8 , 9.
Как уровень пропускной способности анализа изображений и изображения увеличивается, стало ясно, что тариф ограничивая шаг для отбора лежит в процессе подготовки zebrafish эмбриона для экспозиции, который обычно означает, одевающ их в 96 - или 384-ну пластины. Чтобы решить это узкое место, видение руководствуясь робототехника были разработаны Мандрелл et al. 10 и нас11 ранее, чтобы заменить ручной обработки, но инструменты были довольно сложные и есть глубокий кривой обучения для осуществления таких методов. Таким образом чтобы обеспечить легкий к употребление подход становится одним из важных факторов для дальнейшего улучшения уровень пропускной способности данио рерио скрининга и является главной целью этой работы.
В этой работе мы разработаны и изготовлены эмбриона, одевающ шаблон 3D печати. Такой шаблон выстраивающихся был разработан чтобы завлечь zebrafish эмбриона в скважины, которые подходят с стандартных 96-луночных пластины. Вместо выбора эмбрионов и одевающ их в отдельные хорошо один за другим, один может выполнить эмбриона изобличения и массив все 96 эмбрионов в многослойные пластины одновременно. Используя этот шаблон и следующий протокол, одно может значительно повысить эффективность одевающ эмбрионов в многослойные пластины, которые бы в срок увеличить потенциал скрининга по крайней мере в десять раз, по сравнению с ручной работы. Протокол, в описанный ниже включает в себя общий дизайн для одевающ шаблон, данио рерио нереста, коллекции эмбриона и одевающ. Рисунок 1 показывает общий дизайн выстраивающихся шаблона. Рисунок 2 показывает обзор протокола пошаговую инструкцию по использованию шаблона, описанные в частях 3 и 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование и изготовление Zebrafish эмбриона одевающ шаблон
-
Дизайн выстраивающихся шаблон с 12 на 8, 96-луночных макет, который подходит для стандартных 96-луночных пластины. Использование измерения, перечисленных на рисунке 1A для камеры захвата верхней эмбриона (см. также дополнительный файл).
- Используйте измерения, показано на рисунке 1B и 1 D для захвата хорошо.
- Использование измерения в Рисунок 1 c для нижней вакуумной камеры.
- Использовать измерения, на рисунке 1B для воздуха в / выход.
- Использовать 3D-принтер (с точностью до 0,1 мм) для печати шаблона; Смотрите Таблицу материалов для рекомендованных смолы использоваться для печати.
Примечание: 3D принтеры с точностью 0,1 мм, рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона (см. Таблицу материалы). Предлагаемые цвета для поверхности шаблона — темно-серый или черный.
2. Zebrafish эмбриона нереста
- Место две пары мужчин и женщин рыбы в спаривания поле за один день до нереста. Отдельные мужчины и женщины, ясно пластиковый делитель.
- Взлет разделители утром смесь рыбы мужского и женского пола.
- Удаление рыбы мужского и женского пола и собирать zebrafish эмбриона с помощью мелкоячеистое сито. Мыть эмбрионов с яйцо 250 мл воды (см. Таблицу материалы).
- Передавать собранные эмбрионов Петри (90 мм в диаметре) с Holtfreter на решение (см. Таблицу материалы) и удаление мертвых и неоплодотворенных эмбрионов, с помощью стереомикроскопом.
- Место эмбрионы в инкубаторе 28,5 ° C. В 4 ч оплодотворение (hpf), наблюдать эмбрионы и удалите любые мертвых и нездоровой эмбрионов. Эмбрионы теперь готовы к следующему шагу.
3. Подготовка одевающ шаблон
- Вымойте шаблон 2 – 3 раза с 500 мл деионизированной водой и положить его в сушильной печи (45 ° C) 5 мин.
- Лента в нижней камере с куском уплотняющей пленки (Рисунок 2Шаг 1).
- Подключение вакуумного насоса через выход воздуха в нижней части шаблона.
Примечание: Рекомендуемая макс вакуум для вакуумного насоса является 0,1 МПа. Следует помнить о силе вакуума используется. Если отрицательное давление будет слишком сильным, вырежьте крестообразное отверстие на уплотнение фильм для снижения давления.
4. одевающ Zebrafish эмбриона в плиту 96-луночных
- Использование пипетки пластиковые передачи, место приблизительно 150 эмбрионов в шаблон, как показано в рисунке 2, шаг 2.
- Подсоедините вакуумный насос для выпуска воздуха и используется для создания отрицательного давления в камере, герметичные уплотнения фильм на шаге 3.3.
- Встряхните весь шаблон по горизонтали до тех пор, пока каждый хорошо имеет одного эмбриона захваченного (рис. 2, шаг 3).
Примечание: Если Holtfreter раствор высыхает, прежде чем эмбрионы оказались в ловушке в каждой скважине, добавить дополнительные Holtfreter решение в камере изобличения и повторите этот шаг. - Отменить решение дополнительных Holtfreter и эмбрионов, которые не попадают в скважинах (рис. 2, шаг 4).
- Выключите и отсоедините вакуумного насоса.
- Переверните стандартных 96-луночных пластины против шаблон (рис. 2, шаг 5) и поверните оба в то же время (рис. 2, шаг 6).
- Нажмите в нижней части шаблона или подключить воздух розетки для сжатого газа пыли может передать всех захваченных эмбрионов из шаблона 96-луночных пластины (рис. 2, шаг 6).
- Повторите шаг 4.1 до 4,8 подготовить дополнительные несколькими хорошо пластины.
- Снимите уплотнение пленку и вымыть шаблон 3 раза сверху вниз с 500 мл деионизированной воды для использования в будущем.
Примечание: Не используйте любые органические растворители, как этанол, чтобы очистить шаблон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 3 показывает типичный шаблон выстраивающихся 3D-печати. Этот шаблон использует фоточувствительный смолы в качестве сырья и был сделан на 3D принтере; слой черной краской был применен для обеспечения лучшей контрастности цвета эмбрионов. Положение 96 скважин (12, 8) был разработан для стандартных 96-луночных плитой. Аналогичным образом шаблон хорошо 384 (24 х 16) также могут быть разработаны и изготовлены с использованием того же метода. Положительная сторона камеры был немного больше, чем стандартных 96-луночных пластины для предоставления более уместно. Канавки, также были разработаны одевающ провести дополнительные эмбрионы.
Умеренными темпами 20 пластин может быть подготовлен с использованием 3D-печати выстраивающихся шаблона в течение 30 мин, в то время как только два-три пластины могут быть подготовлены вручную. Таблица 1 показывает сравнение между шаблон вручную, роботов и выстраивающихся операций. Рисунок 4 показывает сравнение между двумя пластинами, одетые в шаблоне выстраивающихся 3D-печати, подготовлен вручную. Используя выстраивающихся шаблон, существует незначительное количество жидкости, переданных с эмбрионов, которые также сделал это удобно для дальнейшего воздействия экспериментов.
Рисунок 5 показывает, что существует не существенное воздействие на общее состояние здоровья эмбрионов после будучи гальваническим методом ручной и выстраивающихся шаблон. Чтобы убедиться, что эмбрионы не были затронуты такой процесс выстраивающихся, мы следовали развития эмбриона после их одевающ в 96-луночных пластины для 3 дней. Ставка штриховкой, выживаемости и уродство ставка zebrafish эмбриона на 24, 48 и 72 hpf были все сопоставимые с эмбрионами, выстроил вручную.
Рисунок 1: дизайн zebrafish эмбриона, одевающ шаблон. (A и C) 3-d Max рисунок показаны обзор шаблон. (B) сечение вид шаблона. (D) A частичный вид шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: типичные шаги при использовании шаблона выстраивающихся. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: фотографии 3D-печати выстраивающихся шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: микроскопические изображения эмбрионов после 96-луночных пластина. (A) частичное изображение 96-луночных пластины, одетые в шаблоне. (B) частичное изображение 96-луночных пластины, выстроил вручную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: общее состояние здоровья эмбрионов после будучи гальваническим методом ручной и выстраивающихся шаблон. На основе штриховкой, ненормальное и выживаемости эмбрионов после того, как покрытие с помощью ручной или выстраивающихся шаблон методов, не существенное воздействие на общее состояние здоровья эмбрионы были замечены в любом случае. Планки погрешностей, стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Вручную | Роботизированная платформа | Одевающ шаблон | |
| Покрытие время | 10 – 30 мин/плиты | 5 – 10 мин/плиты | 1 – 2 мин/плиты |
| Стоимость | Низкая | Высокая | Низкая |
| Обучение | Минимум | Высокая | Минимальное значение |
| Рабочая зона | Маленький | Большие | Маленький |
| Влияние на эмбрионов | Практически никто не | Практически никто не | Практически никто не |
| Количество жидкости, добавил на колодец | Случайный | 5 – 10 МКЛ | Минимум |
Таблица 1: Сравнение операций вручную, роботов и выстраивающихся шаблон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть два критических шагов в настоящем Протоколе, которые требуют пристального внимания для успешной реализации 3D-печати шаблон для одевающ zebrafish эмбриона.
Наиболее важным фактором в разработке выстраивающихся шаблон является хорошо захвата. Делает уверен Есть только один эмбрион, захваченных в каждой скважине, следует обратить пристальное внимание на диаметр и глубина скважины захвата и диаметр через отверстия. Рекомендуемый диаметр находится в 1,5-2 раза диаметра типичной эмбриона (включая хориона). Глубина захвата хорошо должна быть в 2 раза диаметра типичной эмбриона (включая Хорион) чтобы избежать укладки эмбрионов в том же хорошо. Диаметр отверстия через должно быть примерно половину диаметра типичной эмбриона (включая Хорион) чтобы избежать эмбрионов, вытесняют через отверстие отрицательное давление. Из-за сложности конструкции технологии 3D печати рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона.
Суть выстраивающихся шаблон состоит в том, чтобы завлечь отдельных эмбрионов в установленных местах, т.е. позиции, которые подходят с 96 - или 384-ну плиты. Для создания надлежащего отрицательное давление для хранения отдельных эмбрионов на месте без их повреждения, один необходимо скорректировать отрицательное давление, создаваемое вакуумного устройства. Слишком большое давление может уничтожить эмбрионов, в то время как слишком мало давление не может поймать их в скважинах. Поэтому настоятельно рекомендуется соблюдать эмбрионов, захваченного в шаблоне под стереомикроскопом перед передачей их в multiwell пластины. Кроме того во время захвата, эмбрионы могут подвергаться воздействию воздуха во время этого процесса. Если это произойдет, добавить дополнительные Holtfreter средних в зале захвата согласно шаг 4.3. Кроме того из-за возможности эмбрионов, подвергаются воздействию воздуха, текущий протокол не работает на dechorionated zebrafish эмбриона.
Выстраивающихся шаблон, представленные в этой работе обеспечивает новаторский подход для создания платформы лоу кост и высокопроизводительного скрининга с помощью zebrafish эмбриона. По сравнению с ранее установленным роботизированной платформы или инструмента на основе цитометрии коммерчески доступных потока, этот метод является простым в использовании и не требует сложной подготовки. Принимая преимущества технологии 3D печати, одно может легко изменить формат выстраивающихся шаблон для различных целей.
Шаблон и протокол в его нынешнем виде все еще требуют некоторые ручной работы. Упорядочение процедуры могли бы далее улучшить уровень пропускной способности и увеличить количество multiwell пластин, подготовленные в течение короткого периода времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы были заполнены патент на шаблоне описано 3D-печати.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана программа «1000plan молодежи», запуска средства от Университета Тунцзи и NSFC Грант # 21607115 и 21777116 (Лин).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
