Summary
Burada, tasarım ve yüksek işlem hacmi zebra balığı embriyo bir 96-şey plaka diziliyor için böyle şablon kullanımı ayrıntılı yordam tarafından ardından arraying bir zebra balığı embriyo imal için bir protokol mevcut.
Abstract
Zebra balığı genel olarak tanınan tatlı su organizma gelişim biyolojisi, Çevresel Toksikoloji ve insan hastalığı sık kullanılan ilgili araştırma alanları var. Sayesinde benzersiz özellikleri büyük verimlilik, vb, embriyo kalınlığı, hızlı ve eş zamanlı geliştirme de dahil olmak üzere, zebra balığı embriyolar genellikle büyük ölçekli toksisite değerlendirilmesi kimyasal maddeler için kullanılır ve uyuşturucu/tarama bileşik. Tipik prosedürü yetişkin zebra balığı yumurtlama, embriyo seçimi ve embriyoların çok iyi kalıplara diziliyor içerir. Oradan, embriyo pozlama ve kimyasal toksisitesi tabi olan veya uyuşturucu/bileşikler etkinliği nispeten hızlı bir şekilde bağlı fenotipik gözlemler olarak değerlendirilebilir. Bu işlemler arasında diziliyor embriyo üretilen iş düzeyi sınırlar en zaman alıcı ve emek yoğun adımlardan biridir. Bu protokol için 3D baskılı arraying şablon kullanımı ile birleştiğinde yapar işleme kadar zahmetli Bu adım hızlandırmak için vakum yenilikçi bir yaklaşım sunuyoruz. İletişim kuralı burada genel tasarımı arraying şablon, detaylı deneysel kurulum ve temsilcisi sonuçlarına göre takip adım adım yordamı açıklar. Uygulandığında, bu yaklaşım zebra balığı embriyo konular test olarak kullanarak araştırma uygulamaları çeşitli yararlı ispatlamak zorundadır.
Introduction
Popüler bir model organizma olarak, zebra balığı1,2,3,4tıp ve toksikoloji alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Vitro platformları için karşılaştırıldığında, zebra balığı teklif daha fazla biyolojik karmaşıklığı bir ya da iki hücre tipleri değil sunabilir. Bütün bir organizma modeli, zebra balığı'nın büyük verimlilik, hızlı ve eşzamanlı embriyonik gelişim ve yüksek organ olmasının yanı sıra transparans büyük ölçekli toksisite veya uyuşturucu/bileşik5eleme için kullanılmak üzere bu modeli benzersiz avantajlar verdik. Her hafta yetişkin zebra balığı bir çift tarafından üretilen embriyolar yüzlerce diğer tüm hayvan modeller aşmak ve yüksek işlem hacmi tarama için uygun yaptık.
Zebra balığı kullanarak tipik prosedürü, embriyo seçimi, yumurtlama ve nereye onlar su daldırma yoluyla pozlama tabi uygun kaplar içine embriyo diziliyor yetişkin zebra balığı gibi manuel çalışma önemli miktarda içerir. Embriyo gelişimi izlenir ve ölüm, çıkım gücü ve anormallik gibi gözlemlenebilir bitiş noktaları kez el ile değerlendirilir ve kimyasal toksisitesi veya etkinliğinin belirtileri tanımlamaları ön kullanılan uyuşturucu ya da bileşikler. Kadar prosedürü hızlandırmak için otomatik görüntüleme ve bilgisayar destekli görüntü analizi gibi yaklaşımlar daha önce araştırılmalıdır. Örneğin, mikroskoplar yüksek içerik görüntüleme yetenekleri ile otomatik parlak alan veya floresan görüntüleme 96/384 iyi tabak6çeşitli gelişim aşamalarında, zebra balığı embriyo üzerinde gerçekleştirmek için adapte edilmiştir. Mikroskoplar ile birleştiğinde mikrosıvısal aygıtları zebra balığı larva beyin sinir hücreleri7görüntüleme için geçerli manipülasyonu yoluyla konumlandırmak için kullanılmıştır. Bu yaklaşımları önemli ölçüde görüntü satın almalar için geleneksel el ile işlem karşılaştırıldığında verimliliğini artırabilirsiniz. Ayrıca, çok sayıda ile oluşturulan resim, görüntü analiz araçları da veri işleme kadar hızlandırmak için Liu ve ark. ve Tu vd tarafından gösterildiği gibi geliştirilmiştir 8 , 9.
Görüntüleme ve görüntü analizi üretilen iş düzeyi arttıkça, tarama hızı sınırlaması adım genellikle onları 96 - veya 384-da kalıplara diziliyor anlamına gelir pozlama, zebra balığı embriyo hazırlama sürecinde yatıyor netleşti. Bu performans sorunu adım çözmek için robotik vizyon güdümlü geliştirilmiş olup, tüm tarafından Mandrell vd. 10 ve bizden daha önce el ile işleme ama aletleri yerine11 oldukça sofistike ve bu tür teknikler uygulamak için derin bir öğrenme eğrisi olduğunu. Bu nedenle, bir kolay kullanımlı yaklaşım zebra balığı tarama üretilen iş düzeyini daha da geliştirmek için önemli bir faktör haline gelir ve bu çalışmanın temel amacı sağlamak için.
Bu çalışmada, tasarlanmış ve şablon tarafından 3D baskı arraying bir embriyo fabrikasyon. Arraying bir şablon ile standart bir 96-şey plaka uygun kuyu içine zebra balığı embriyo tuzağa düşürmeye tasarlanmıştır. Embriyo seçerek ve onları tek tek bireysel kuyuya diziliyor yerine, bir embriyo tuzak ve dizi tüm 96 embriyo multiwall bir tabak hemen gerçekleştirebilir. Bu şablonu ve aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak, bir önemli ölçüde tarama kapasitesi en az on kat, el ile çalışmasına göre dönem alttan yukarıya ittirmek içinde istiyorsunuz multiwall tabak içine embriyo diziliyor verimliliğini artırmak olabilir. Aşağıda açıklanan protokol diziliyor şablon, zebra balığı yumurtlama, embriyo toplama ve diziliyor için genel bir tasarım içerir. Şekil 1 arraying şablonu genel tasarım gösterir. Şekil 2 parça 3 ve 4'de anlatıldığı şablonu kullanarak adım adım Protokolü özetini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tasarım ve üretim şablon diziliyor zebra balığı embriyolar
-
Bir 12 tarafından 8 ile standart bir 96-şey plaka 96-şey düzen arraying şablonu tasarlayın. Boyutları listelenen Şekil 1A ' üst embriyo tuzak odası için kullanım (Ayrıca bkz: ek dosyası).
- Şekil 1B ve 1 D tuzak için de gösterilen boyutları kullanın.
- Boyutlar Şekil 1 c içinde alt vakum odası için kullanın.
- Şekil 1B adımında havada için boyutları kullanın / çıkış.
- 3D yazıcı (0,1 mm hassasiyetle) şablonu yazdırmak için kullanın; yazdırma işlemi için kullanılacak Malzemeler tablo önerilen reçine için bkz.
Not: 0,1 mm hassasiyetle 3D yazıcılar arraying şablon imalatı için tavsiye edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Önerilen şablon yüzeyi için koyu gri veya siyah renktir.
2. zebra balığı embriyo yumurtlama
- İki çift erkek ve dişi balık yumurtlama önce bir gün kutusu çiftleşme başına yerleştirin. Ayrı erkek ve kadın tarafından şeffaf plastik bir bölücü.
- Bölücüler sabah erkek ve dişi balık karıştırmak için götürür.
- Erkek ve dişi balık çıkartın ve ince gözenekli süzgeç kullanarak zebra balığı embriyo toplamak. (Bkz. Tablo reçetesi) 250 mL yumurta ile embriyo su yıkama.
- Petri yemekler (90 mm çapında) Holtfreter'ın çözüm ile toplanan embriyo transfer ( Tablo malzemelerigörmek) ve ölü ve döllenmemiş embriyo bir stereomicroscope kullanarak kaldırın.
- Embriyo 28.5 ° C kuluçka makinesine koyun. 4 h fertilizasyon (hpf) sonrası, embriyo gözlemlemek ve herhangi bir ölü ve sağlıksız embriyo kaldırın. Embriyo bir sonraki adım için hazırsınız.
3. hazırlık şablonu diziliyor
- Şablon 2-3 kez 500 mL deiyonize su ile yıkama ve kurutma fırın (45 ° C) 5 min için içine koy.
- Alt kamara film (Şekil 2Adım 1) sızdırmazlık bir parça ile teyp.
- Bir vakum pompası şablonun altındaki hava çıkışı üzerinden bağlayın.
Not: 0.1 Mpa vakum pompası için önerilen maksimum vakum var. Kullanılan vakum gücünü unutmayın. Negatif basınç çok güçlü ise, bir haç şeklindeki basıncı düşürmek için mühürleme film üzerinde delik açın.
4. bir 96-şey plaka zebra balığı embriyo diziliyor
- Plastik transfer pipet kullanarak, yaklaşık 150 embriyo şablonu, Şekil 2' de, 2. adımda gösterildiği gibi yerleştirin.
- Vakum Pompası adım 3.3 mühürleme filmde tarafından mühürlü odası negatif basınç oluşturmak için hava çıkışına bağlayın.
- Her şey bir embriyo (Şekil 2, adım 3) entrapped kadar tüm şablon yatay sallamak.
Not: Holtfreter'ın çözüm embriyoların her kuyuda sıkışıp kalırlar önce kurur, tuzak odasında ek Holtfreter'ın çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin. - İlave Holtfreter'ın çözüm ve wells (Şekil 2, adım 4) entrapped değil embriyo atmak.
- Devre dışı bırakmak ve vakum pompası bağlantısını kesin.
- Standart bir 96-şey plaka baş aşağı şablonu (Şekil 2, adım 5) karşı yerleştirin ve her ikisini de aynı anda (Şekil 2, adım 6) döndürün.
- Şablon alt dokunun veya hava bağlanmak bir sıkıştırılmış gaz toz prizine olabilir tüm kapana kısılmış embriyo şablondan 96-şey plaka (Şekil 2, adım 6) aktarmak için.
- 4.1-4,8 ek çok iyi tabak hazırlamak için adımları yineleyin.
- Mühürleme film kaldırın ve üstten 3 kez şablonu yukarıdan aşağıya doğru ileride kullanmak üzere 500 mL deiyonize su ile yıkayın.
Not: şablon temizlemek için etanol gibi herhangi bir organik solventler kullanmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3 tipik bir 3D baskılı arraying şablonunu gösterir. Bu şablon ışığa duyarlı reçine hammadde olarak kullanır ve bir 3D printerlere harcama maddeler tarafından yapıldı; siyah boya tabakası embriyo rengini daha iyi bir kontrast sağlamak için uygulandı. 96 wells (12 tarafından 8) konumunu ile standart bir 96-şey plaka uyacak şekilde tasarlanmıştır. Benzer şekilde, 384 (24 den 16) iyi şablon da tasarlanabilir ve aynı yöntemi kullanarak fabrikasyon. Ters odası biraz daha iyi uyum sağlamak için standart bir 96-şey plaka büyük. Oluklar Ayrıca ekstra embriyolar diziliyor sırasında tutmak için tasarlanmıştır.
Mütevazı bir oranda 20 plakaları yalnızca iki ya da üç tabak el ile hazırlanmış süre 30 dk içinde 3D baskılı arraying şablon kullanılarak hazırlanmış. Tablo 1 manuel, Robotik ve arraying şablon işlemleri arasında bir karşılaştırma gösterir. Şekil 4 iki tabak, 3D baskılı arraying şablon tarafından serilir, el ile hazırlanan arasında bir karşılaştırma gösterir. Arraying şablonu kullanarak, ihmal edilebilir bir miktar sıvı ile de daha fazla maruz kalma deneyleri için uygun yapılan embriyo transfer oldu.
Şekil 5 manuel ve arraying şablon yöntemlerle kaplama sonra embriyo genel sağlık durumunu önemli hiçbir etkisi olduğunu gösterir. Embriyo arraying bir işlem tarafından etkilenen değil emin olmak için onları 3 gün boyunca 96-şey kalıplara diziliyor sonra embriyo gelişimi takip ettik. Tarama hızı, hayatta kalma oranı ve zebra balığı embriyo 24, 48 ve 72 malformasyon oranı hpf tüm el ile dizilmiş embriyo ile karşılaştırılabilir.
Şekil 1: tasarım şablonu arraying bir zebra balığı embriyo. Genel şablon olarak gösterilen (A ve C) 3-d Max çizim. (B) kesit şablon / görüntüleyin. (D) A kısmi şablonun görünümünü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: arraying şablonu kullanırken tipik adımları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir 3D baskılı arraying şablonu fotoğraflarını. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 96-şey plakasına transfer sonra embriyo mikroskobik görüntülerini. (A)şablon tarafından önünüze bir 96-şey plaka kısmi görüntüsü. (B) kısmi görüntü el ile dizilmiş bir 96-şey plaka. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: manuel ve arraying şablon yöntemlerle kaplama sonra embriyo genel sağlık durumunu. Sonra tarama, anormal ve sağkalım oranları embriyoların göre manuel veya arraying şablonu kullanarak kaplama, embriyoların genel sağlığı üzerinde önemli hiçbir etkisi her iki durumda da gözlendi. Hata çubukları standart sapmalar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| El ile | Robot platformu | Şablon diziliyor | |
| Kaplama saat | 10 – 30 dk/plaka | 5-10 dk/plaka | 1-2 dk/plaka |
| Maliyet | Düşük | Yüksek | Düşük |
| Gerekli eğitim | En az | Yüksek | Minumum |
| Çalışma alanı | Küçük | Büyük | Küçük |
| Embriyo üzerinde etkisi | Hiçbiri çok az | Hiçbiri çok az | Hiçbiri çok az |
| İyi eklendi sıvı miktarı | Rasgele | 5 – 10 ΜL | En az |
Tablo 1: Manuel, Robotik ve arraying şablon işlemleri karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı embriyo diziliyor 3D baskılı şablonu başarılı uygulanması için yakın ilgi gerektiren iki kritik adımlarda bu protokolü vardır.
Tasarımı arraying şablonu, en önemli faktör de tuzaktır. Yapar emin tek embriyo her kuyuda sıkışmış, bir tane çapı ve tuzak kuyunun derinliği ve ile delik çapi yakın dikkat etmelidir. Önerilen çapı içinde (koryon dahil) tipik bir embriyo çapının 1,5-2 katı olduğunu. İyi tuzak derinliği içinde 2 kez (koryon dahil) tipik bir embriyo çapını embriyo aynı iyi istifleme önlemek için olmalıdır. İle delik çapi yaklaşık yarısı (koryon dahil) tipik bir embriyo çapını embriyo delikten negatif basınç tarafından sıkılmış önlemek için olmalıdır. Tasarım karmaşıklığı nedeniyle, 3D baskı teknolojisi arraying şablon imalatı için önerilir.
Belirlenen yerlerde, yani bir 96 - veya 384-da plaka ile uygun pozisyonlar bireysel embriyo tuzağa düşürmeye arraying şablon özüdür. Tek tek embriyo onlara zarar vermeden tutmak için uygun bir negatif basınç oluşturmak için bir vakum cihazı tarafından oluşturulan negatif basınç ayarlamanız gerekir. Çok az basınç onları wells tuzak değil iken çok fazla baskı embriyolar yok edebilir. Bu nedenle, bir stereomicroscope altında şablonundaki multiwell kalıplara aktarmadan önce entrapped embriyo gözlemlemek için önerilir. Ayrıca, tuzak sırasında embriyolar hava için bu işlem sırasında maruz. Bu ek Holtfreter'ın eklemek gerçekleşmesi gerekir orta adım 4.3 göre tuzak odasında. Ayrıca, embriyo havaya maruz olasılığı nedeniyle, geçerli protokol dechorionated zebra balığı embriyo üzerinde çalışmaz.
Bu çalışmada sunulan arraying şablonu zebra balığı embriyo kullanarak bir düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi tarama platformu oluşturmak için yenilikçi bir yaklaşım sağlar. Daha önce kurulan robot platformlar veya piyasada bulunan akış sitometresi tabanlı aracı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanımı kolaydır ve gelişmiş eğitim gerektirmez. 3D baskı teknolojisi alma avantajları, biri farklı amaçlar uyacak arraying şablon biçimini kolayca değiştirebilirsiniz.
Şablon ve Şu anki haliyle iletişim kuralı hala bazı manuel çalışma gerektirir. Yordamı daha fazla üretilen iş düzeyini yükseltmek ve düzene multiwell plakaları kısa bir süre içinde hazırlanan miktarını artırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bir patent açıklanan 3D baskılı şablonundaki doldurdu.
Acknowledgments
Bu eser "1000plan Gençlik" programı, başlangıç fonlar Kent Üniversitesi ve NSFC Grant # 21607115 ve 21777116 (LIN) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
