Summary
Aquí, presentamos un protocolo para diseñar y fabricar un embrión de pez cebra colocar plantilla, seguido de un procedimiento detallado sobre el uso de dicha plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra colocar en una placa de 96 pocillos.
Abstract
El pez cebra es que un organismo reconocido a nivel mundial de agua dulce utilizadas en Biología del desarrollo, toxicología ambiental y enfermedades humanas campos de investigación relacionados. Gracias a sus características únicas, incluyendo gran fecundidad, translucidez del embrión, desarrollo rápido y simultáneo, etc., embriones de pez cebra se suelen utilizar para la evaluación de la toxicidad de gran escala de sustancias químicas y drogas/compuesto proyección. Un procedimiento típico de proyección implica el desove del pez cebra adulto, la selección de embriones y colocar los embriones en placas de varios pocillos. A partir de ahí, los embriones son sometidos a la exposición y la toxicidad del producto químico, o puede evaluar la eficacia de los compuestos de drogas relativamente rápidamente en base a observaciones fenotípicas. Entre estos procesos, colocar los embriones es uno de los pasos más desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva que limita el nivel de rendimiento. En este protocolo, presentamos un enfoque innovador que hace uso de una plantilla de arraying impreso en 3D junto con vacío manipulación para acelerar este paso laborioso. El protocolo en el presente documento describe el diseño general de la plantilla arraying, una configuración experimental detallada y paso a paso, procedimiento por resultados representativos. Cuando se implementa, este enfoque resulta beneficioso en una variedad de aplicaciones de la investigación con embriones de pez cebra como sujetos de prueba.
Introduction
Como un organismo modelo popular, el pez cebra es ampliamente utilizado en los campos de la medicina y toxicología1,2,3,4. Comparado con plataformas en vitro , pez cebra ofrecen mucho mayor complejidad biológica que uno o dos tipos de la célula no podrían ofrecer. Además de ser un organismo modelo de pez cebra gran fecundidad, desarrollo embrionario rápido y simultáneo y órgano alta translucidez han dado este ventajas únicas del modelo a utilizar para toxicidad de gran escala o detección de5drogas/compuesto. Los cientos de embriones producidos por un par de pez cebra adulto cada semana superan otros modelos todo animales y han hecho conveniente para el cribado de alto rendimiento.
Un procedimiento típico de proyección utilizando el pez cebra implica una cantidad significativa de trabajo manual, como el pez cebra adulto desove, selección de embriones y colocar los embriones en recipientes adecuados donde son sometidos a la exposición a través de la inmersión en agua. Se monitorea el desarrollo de los embriones y extremos observables como anormalidad, incubabilidad y mortalidad a menudo son evaluados manualmente y utilizados como la identificación preliminar de la toxicidad de productos químicos o las indicaciones de la efectividad de drogas o compuestos. Para acelerar el procedimiento de investigación, enfoques como la proyección de imagen automatizada y análisis de imagen asistida por computador han sido explorados previamente. Por ejemplo, microscopios con alto contenido de capacidades de la proyección de imagen han sido adaptados para realizar automatizado campo brillante o proyección de imagen de fluorescencia en embriones de pez cebra en las distintas etapas del desarrollo de placas de 96/384 pozos6. Dispositivos microfluídicos juntados con microscopios fueron utilizados para colocar las larvas de pez cebra a través de la manipulación actual de proyección de imagen de cerebro neuronas7. Estos enfoques podrían mejorar significativamente la eficiencia de adquisición de imagen en comparación con la tradicional operación manual. Por otra parte, con gran cantidad de imágenes generadas, herramientas de análisis de imagen también se han desarrollado para acelerar el procesamiento de datos, según lo demostrado por Liu et al. y Tu et al. 8 , 9.
A medida que aumenta el nivel de rendimiento de análisis de imagen y proyección de imagen, se hizo evidente que el paso de limitación de velocidad para la investigación se encuentra en el proceso de preparación de embriones de pez cebra para la exposición, que por lo general significa colocar en placas de 96 o 384 pocillos. Para resolver este paso cuello de botella, guiada por la visión robótica fueron desarrollados por Mandrell et al. 10 y nos11 anteriormente para reemplazar la manipulación manual pero los instrumentos eran bastante sofisticados y hay una profunda curva de aprendizaje para implementar dichas técnicas. Por lo tanto, para proporcionar un enfoque de fácil uso se convierte en un factor importante para mejorar el nivel de rendimiento de la detección de pez cebra y es el principal objetivo de este trabajo.
En este trabajo, hemos diseñado y había fabricado un embrión colocar plantilla de impresión 3D. Una plantilla así de arraying fue diseñada para atrapar el embrión de pez cebra en pozos que se ajustan a una estándar placa de 96 pocillos. En lugar de embriones para seleccionar y colocar en cada pozo uno por uno, uno podría realizar matriz y atrapamiento de embrión 96 todos los embriones en una placa multicapa a la vez. Utilizando esta plantilla y el protocolo siguiente, uno podría aumentar significativamente la eficacia de colocar los embriones en placas multicapa, que en término de impulso por lo menos diez veces, la capacidad de detección en comparación con operación manual. El protocolo que se describe a continuación incluye un diseño global para colocar la plantilla, el desove del pez cebra, colección embrionaria y matriz. La figura 1 muestra el diseño general de la plantilla arraying. La figura 2 muestra un resumen del protocolo paso a paso sobre el uso de la plantilla descrita en las partes 3 y 4.
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Protocol
1. diseño y fabricación de un embriones de pez cebra colocar plantilla
-
Diseño de la plantilla de arraying con un 12 por 8, diseño de 96 pocillos que se ajusta a una estándar placa de 96 pocillos. Uso las dimensiones listadas en la figura 1A para la cámara de captura superior del embrión (véase también el archivo suplementario).
- Utilice las dimensiones que se muestra en la figura 1B y 1D para la captura del bien.
- Utilice las dimensiones en la figura 1 para la cámara de vacío de fondo.
- Utilizar las dimensiones en la figura 1B para el aire / salida.
- Utilice una impresora 3D (con precisión de 0,1 mm) para imprimir la plantilla; Véase Tabla de materiales para resina recomendada para ser utilizado para la impresión.
Nota: las impresoras 3D con una precisión de 0,1 mm se recomiendan para la fabricación de la plantilla arraying (véase Tabla de materiales). El color sugerido para la superficie de la plantilla es gris oscuro o negro.
2. pez cebra embrión de desove
- Colocar dos pares de peces machos y hembras por apareamiento caja un día antes del desove. Separados machos y hembras por un divisor de plástico transparente.
- Sacar los separadores en la mañana para mezclar peces macho y hembra.
- Quite los pescados masculinos y femeninos y recolectar embriones de pez cebra con un colador de malla fina. Lave los embriones con huevo 250 mL de agua (véase Tabla de materiales).
- Transferencia de los embriones colectados a cajas Petri (90 mm de diámetro) con solución de Holtfreter (véase Tabla de materiales) y eliminar embriones muertos y no fecundados con un estereomicroscopio.
- Coloque los embriones en una incubadora de 28,5 ° C. A las 4 h post fertilización (hpf), observar los embriones y eliminar cualquier embriones muertos e insalubres. Los embriones están listos para el siguiente paso.
3. preparación de colocar plantilla
- Lave la plantilla de 2 a 3 veces con 500 mL de agua desionizada y ponerlo en el horno de secado (45 ° C) durante 5 minutos.
- Cinta de la cámara inferior con un trozo de película (figura 2paso 1).
- Conecte una bomba de vacío a través de la salida de aire en la parte inferior de la plantilla.
Nota: El vacío máximo recomendado para la bomba de vacío es de 0,1 Mpa. Ser conscientes de la fuerza del vacío utilizado. Si la presión negativa es demasiado fuerte, cortar un agujero en forma de Cruz en la película para bajar la presión.
4. colocar embriones de pez cebra en una placa de 96 pocillos
- Usando una pipeta de transferencia plástica, coloque aproximadamente 150 embriones en la plantilla, como se muestra en la figura 2, paso 2.
- Conecte la bomba de vacío a la salida de aire para generar presión negativa en la cámara de sellado de la película en el paso 3.3.
- Agite horizontalmente toda la plantilla hasta que cada uno tiene bien atrapado de un embrión (figura 2, paso 3).
Nota: Si solución de Holtfreter se agota antes de que los embriones se encuentran atrapados en cada pocillo, añadir solución de Holtfreter adicional en la cámara de captura y repita este paso. - Deseche la solución extra Holtfreter y embriones que no son atrapados en los pozos (figura 2, paso 4).
- Apague y desconecte la bomba de vacío.
- Coloque una placa estándar de 96 pocillos boca abajo contra la plantilla (figura 2, paso 5) y gire a ambos al mismo tiempo (figura 2, paso 6).
- Toque en la parte inferior de la plantilla o conectar el aire toma a una cantidad de gas comprimido puede para transferir embriones todos atrapados de la plantilla a la placa de 96 pocillos (figura 2, paso 6).
- Repita los pasos 4.1 a 4.8 para preparar placas de múltiples pozos adicionales.
- Quitar la película y lavar la plantilla 3 veces de arriba a abajo con 500 mL de agua desionizada para uso futuro.
Nota: No utilice solventes orgánicos como etanol, para limpiar la plantilla.
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Representative Results
La figura 3 muestra una plantilla típica de arraying impreso en 3D. Esta plantilla utiliza resina fotosensible como materia prima y fue hecha por una impresora 3D; se aplicó una capa de pintura negra para proporcionar un mejor contraste con el color de los embriones. La posición de 96 pocillos (12 por 8) fue diseñada para encajar con una placa estándar de 96 pocillos. Del mismo modo, una plantilla bien de 384 (24 por 16) también podría ser diseñado y había fabricado utilizando el mismo método. La boca era ligeramente más grande que una placa de 96 pocillos estándar para proporcionar un mejor ajuste. Ranuras también fueron diseñadas para mantener los embriones extras durante la matriz.
A una tasa modesta, podrían prepararse 20 placas utilizando la plantilla arraying impreso en 3D dentro de 30 minutos, mientras que sólo dos o tres platos podrían prepararse manualmente. La tabla 1 muestra una comparación entre operaciones manual, robotizada y colocar la plantilla. La figura 4 muestra una comparación entre dos placas, vestida por la plantilla de arraying 3D-impreso, elaborado manualmente. Utilizando la plantilla arraying, había una cantidad insignificante de líquido transferido con los embriones, que también hacen conveniente para los experimentos de exposición adicionales.
La figura 5 muestra que no había ningún efecto significativo sobre el estado de salud general de los embriones después de ser plateado por los métodos manual y colocar la plantilla. Para asegurarse de que los embriones no fueron afectados por un proceso tan arraying, seguimos el desarrollo del embrión después de colocarlos en las placas de 96 pocillos para 3 días. La eclosión, sobrevivencia y tasa de malformación de embriones de pez cebra en 24, 48 y 72 hpf fueron todos comparables con los embriones vestidos manualmente.
Figura 1: diseño de un embrión de pez cebra colocar plantilla. (A y C) 3-d Max dibujo mostrando el Resumen de la plantilla. Corte transversal (B) vista de la plantilla. (D) una vista parcial de la plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pasos habituales al usar la plantilla arraying. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fotografías de una plantilla de arraying 3D impresa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: imágenes microscópicas de los embriones después transferido a la placa de 96 pozos. (A) Imagen parcial de una placa de 96 pocillos vestida por la plantilla. (B) Imagen parcial de una placa de 96 pozos dispuesta manualmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: el estado general de salud de los embriones después de ser plateado por los métodos manual y colocar plantilla. Basado en la eclosión, anormal y las tasas de supervivencia de los embriones después de ser no plateado con manual o los métodos arraying de la plantilla, efectos significativos sobre la salud general de los embriones se observaron en ambos casos. Barras de error son las desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Manual | Plataforma robótica | Colocar la plantilla | |
| Tiempo de la galjanoplastia | 10-30 min de la placa | 5 – 10 min de la placa | 1 a 2 min de la placa |
| Costo | Bajo | Alta | Bajo |
| Formación necesaria | Mínimo | Alta | Mínimo |
| Área de trabajo | Pequeño | Grandes | Pequeño |
| Efecto sobre los embriones | Poca o ninguna | Poca o ninguna | Poca o ninguna |
| Cantidad de líquido añadido por pozo | Al azar | 5-10 ΜL | Mínimo |
Tabla 1: Comparación de operaciones manuales, robotizadas y colocar plantilla.
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Discussion
Hay dos pasos críticos en este protocolo que requieren especial atención para una exitosa implementación de plantilla 3D impresa para colocar los embriones de pez cebra.
El factor más importante en el diseño de la plantilla arraying es la captura. A hace que hay solamente un embrión en cada pocillo, uno debe prestar mucha atención al diámetro y la profundidad del pozo de atrapamiento y el diámetro del agujero a través. El diámetro recomendado es de 1.5 a 2 veces del diámetro de un embrión típico (incluyendo el corion). La profundidad de la captura del bien debe ser dentro de 2 veces del diámetro de un embrión típico (incluyendo el corion) para evitar el amontonamiento de los embriones en el mismo pozo. El diámetro del agujero a través debe ser aproximadamente la mitad del diámetro de un embrión típico (incluyendo el corion) para evitar ser exprimidos a través del orificio por la presión negativa de embriones. Debido a la complejidad del diseño, tecnología de impresión 3D se recomienda para la fabricación de la plantilla arraying.
La esencia de la plantilla arraying es atrapar los embriones individuales a determinados lugares, es decir, posiciones que se ajustan a una placa de 96 o 384 pocillos. Para crear una presión negativa adecuada para mantener los embriones individuales en su lugar sin dañarlos, se debe ajustar la presión negativa generada por el dispositivo de vacío. Demasiada presión puede destruir los embriones, mientras que una presión demasiado pequeña no puede atraparlos en los pozos. Por lo tanto, se recomienda observar los embriones atrapados en la plantilla bajo un estereomicroscopio antes de transferirlas a las placas de pocillos. Además, durante la captura, los embriones podrían estar expuestos al aire durante este proceso. Si esto sucediera, añadir adicional Holtfreter medio en la cámara de captura según el paso 4.3. También, debido a la posibilidad de embriones están expuestos al aire, el protocolo actual no funciona en embriones de pez cebra dechorionated.
La plantilla arraying presentada en esta obra proporciona un enfoque innovador para el establecimiento de una plataforma de proyección de alto rendimiento y de bajo costo utilizando embriones de pez cebra. En comparación con las plataformas robóticas previamente establecidas o instrumento basados en citometría de flujo disponible comercialmente, este método es fácil de usar y no requiere entrenamiento sofisticado. Tomar ventajas de la tecnología de impresión 3D, uno puede cambiar fácilmente el formato de la plantilla arraying para adaptarse a diferentes propósitos.
La plantilla y el protocolo en su forma actual aún requieren un trabajo manual. Agilizar el procedimiento podría mejorar el nivel de rendimiento y aumentar la cantidad de pocillos platos preparados dentro de un período corto de tiempo.
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Disclosures
Los autores han llenado una patente sobre la plantilla impresa en 3D descrita.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el programa "1000plan", los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tongji y NSFC concesión # 21607115 y 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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