Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

doi: 10.3791/57892 Published: June 1, 2018

Summary

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

Abstract

제 브라는 세계적으로 인정된 민물 유기 체 자주 사용 개발 생물학, 환경 독성, 그리고 인간의 질병에 관련된 연구 분야 이다. 큰 통치, 배아 반투명, 빠르고 동시 개발, , 등의 독특한 기능 zebrafish 태아는 종종 대규모 화학 물질의 독성 평가 및 사용 약물/화합물 심사. 일반적인 심사 절차 포함 성인 zebrafish 산란, 배아 선택, 다 잘 판에 배아를 개. 거기에서 태아 노출 및 화학 물질, 독성을 복종 된다 또는 마약/화합물의 효과 phenotypic 관측에 따라 상대적으로 신속 하 게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로세스 중 개 배아 처리량 수준을 제한 하는 가장 시간이 많이 걸리는 하 고 노동 집약적인 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 선물이 3D 인쇄 arraying 서식 파일의 사용과 결합 하 게 진공 속도이 힘 드는 단계를 조작 하는 혁신적인 접근 방식. 본 프로토콜 arraying 템플릿, 상세한 실험 설정 및 대표 결과 다음 단계별 절차의 전반적인 디자인을 설명 합니다. 구현 될 때,이 방법은 테스트 과목으로 zebrafish 태아를 사용 하 여 연구 응용 프로그램의 다양 한에서 도움이 증명 해야 합니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

인기 모델 생물으로 zebrafish 의학 및 독극물1,2,,34의 분야에서 널리 사용 됩니다. 생체 외에서 플랫폼에 비해, zebrafish 제공 훨씬 더 큰 생물 복잡 하나 또는 2 개의 세포 유형 제공 하지 못했습니다. 모델, zebrafish의 큰 통치, 빠르고 동시 배아 개발 및 높은 기관 전체 유기 체 외 반투명 대규모 독성 또는 약/화합물5를 심사에 사용 될이 모델 독특한 이점을 주었다. 매주 성인 zebrafish의 한 쌍에 의해 생성 하는 배아의 수백 다른 모든 동물 모델을 능가 하 고 높은 처리량 검열을 위해 적당 한 만든.

제 브라를 사용 하 여 일반적인 심사 절차 많은 성인 zebrafish 산란, 태아 선택, 그리고 그들이 물 침수를 통해 노출 대상이 되 적당 한 용기에 배아를 개 같은 수동 작업이 포함 됩니다. 태아의 개발은 모니터링 및 사망률, hatchability 등 비정상적인 관찰 끝점 자주 수동으로 평가 화학 물질의 독성 또는의 효과의 표시의 예비 식별으로 사용 약 또는 화합물입니다. 속도 심사 절차를, 자동화 된 이미징 및 컴퓨터 기반 이미지 분석 등 접근은 이전 탐험 되었습니다 있다. 예를 들어 현미경 이미징 기능 높은 콘텐츠로 384 분의 96 잘 접시6에서 다양 한 발달 단계에서 자동화 된 밝은 필드 또는 형광 이미징 zebrafish 태아에 수행 적응 되었습니다. 현미경과 함께 미세 장치는 뇌 뉴런7의 이미징에 대 한 현재 조작을 통해 zebrafish 애벌레를 사용 되었다. 이러한 접근 수 크게 전통적인 수동 작업에 비해 이미지 취득의 효율성을 향상 시킵니다. 또한, 생성 되는 이미지의 큰 숫자, 이미지 분석 도구 또한 개발 되었습니다 속도 데이터 처리를 같이 리 와 화 외. 8 , 9.

이미징 및 이미지 분석의 처리량 수준을 증가, 심사에 대 한 속도 제한 단계 96-또는 384-잘 접시에 배열 하는 일반적으로 의미 노출 zebrafish 태아를 준비 하는 과정은 취소 되었습니다. 이 병목 단계를 해결 하기 위해 비전 가이드 로봇 Mandrell 외. 에 의해 개발 되었다 10 와 미국 수동 처리 하지만 악기를 대체 하는 이전11 꽤 되었고 이러한 기술을 구현 하는 깊은 학습 곡선입니다. 따라서, 사용 하기 쉬운 접근 된다 더 zebrafish 심사 처리량 수준을 개선 하는 하나의 중요 한 요소 이며이 작품의 주요 목적은 제공 하기.

이 작품에서는, 우리는 설계 및 3D 인쇄 하 여 서식 파일을 배열 하는 배아를 조작. 이러한 arraying 서식 파일 표준 96 잘 접시와 맞는 우물으로 zebrafish 태아를 모 함 하도록 설계 되었습니다. 배아를 선택 하 고 개별 음 하나 하나에 그들을 배열, 대신 하나를 수행할 수 배아 함정 및 배열 모든 96 배아 multiwall 격판덮개로 한 번에. 이 서식 파일 및 다음 프로토콜을 사용 하 여, 하나 크게 어느 것이 기간 부스트 심사 용량 적어도 열 배, 수동 조작에 비해 multiwall 접시에 배아를 배열의 효율성을 증가할 수 있었다. 프로토콜 아래에 설명 된 템플릿, zebrafish 산란, 배아 수집, 배열 및 배열에 대 한 전반적인 디자인을 포함 한다. 그림 1 에서는 arraying 서식 파일의 전반적인 디자인. 그림 2 는 부품 3 및 4에 설명 된 서식 파일을 사용 하 여 단계별 프로토콜에 대 한 개요를 보여 줍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 디자인 및 템플릿 개 Zebrafish 태아의 제조

  1. 8에서 12, 96-잘 레이아웃을 표준 96 잘 접시를 맞는 arraying 서식 파일을 디자인 합니다. 크기는 위 태아 함정 챔버에 대 한 그림 1A 에 나열 된 사용 (보조 파일 참조).
    1. 함정에 대 한 잘 그림 1B1 D 에 표시 된 크기를 사용 합니다.
    2. 그림 1C 의 크기를 사용 하 여 바닥 진공 챔버에 대 한.
    3. 그림 1B 에서 치수를 사용 하 여에 어에 대 한 / 콘센트.
  2. (0.1 m m 정밀도)로 3D 프린터를 사용 하 여 인쇄 서식 파일; 인쇄에 사용할 권장된 수 지에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    참고: 0.1 m m 정밀 3D 프린터 arraying 서식 파일의 제작에 대 한 권장 ( 재료의 표참조). 서식 파일의 표면에 대 한 제안 된 색상은 어두운 회색 또는 검은색.

2. Zebrafish 태아 산란

  1. 두 켤레 상자 1 일 산란 전에 짝짓기 당 남성과 여성의 물고기를 놓습니다. 별도 남성 그리고 투명 한 플라스틱 분배기에 의해 여성.
  2. 벗을 디바이 더 아침에 남성과 여성의 생선을 혼합.
  3. 남성과 여성의 물고기를 제거 하 고 zebrafish 태아 파인 메쉬 스 트레이너를 사용 하 여 수집 합니다. 세척 배아를 250 mL 계란 물 ( 재료의 표참조).
  4. 접시 (직경 90 mm) Holtfreter의 솔루션에 수집 된 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 죽음과 unfertilized 배아는 stereomicroscope를 사용 하 여 제거.
  5. 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 놓습니다. 게시물 수정 (hpf)에서 4 h, 배아 관찰 하 고 모든 죽은 건강에 해로운 배아를 제거. 배아는 다음 단계에 대 한 준비가 지금입니다.

3입니다. 개 서식 파일의 준비

  1. 템플릿 2-3 시간 500 mL 이온을 제거 된 물으로 세척 하 고 5 분 동안 건조 오븐 (45 ℃)에 넣어.
  2. 테이프 씰링 필름 (그림 21 단계)의 조각으로 하단 챔버.
  3. 서식 파일의 아래쪽에 공기 출구를 통해 진공 펌프를 연결 합니다.
    참고: 권장된 최대 진공 진공 펌프에 대 한 0.1 Mpa 이다. 사용 하는 진공의 강도 알고 있어야 합니다. 부정적인 압력 너무 강한 경우에, 압력을 낮은 씰링 필름에 있는 십자가 모양의 구멍을 잘라.

4. 96 잘 접시에 Zebrafish 태아 개

  1. 그림 2, 2 단계에서에서와 같이 약 150 배아는 서식 파일에 장소 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여.
  2. 3.3 단계에서 씰링 필름에 의해 봉인 챔버에 부정적인 압력 생성 하 공기 출구에 진공 펌프를 연결 합니다.
  3. 각 잘 한 배아 속은 (그림 2, 3 단계) 때까지 가로 전체 템플릿 흔들.
    참고: 경우에 Holtfreter의 솔루션은 배아 각 우물에 갇혀 있다 전에 마르면, 함정 챔버에 추가 Holtfreter의 솔루션을 추가 하 고이 단계를 반복.
  4. 여분의 Holtfreter 솔루션 및 웰 스 (그림 2, 4 단계)에 침투 하지 배아 폐기.
  5. 해제을 진공 펌프를 분리 합니다.
  6. (그림 2, 5 단계) 서식 파일에 대 한 표준 96 잘 접시를 거꾸로 배치 하 고 (그림 2, 6 단계) 동시에 회전.
  7. 서식 파일의 아래쪽을 누르거나 공기 연결 콘센트 압축된 가스 뿌리에 96 잘 접시 (그림 2, 6 단계)에 서식 파일에서 모든 갇힌된 배아를 전송 할 수 있는.
  8. 4.1 4.8 추가 멀티 잘 접시 준비 단계를 반복 합니다.
  9. 씰링 필름을 제거 하 고 차후 사용을 위해 500 mL 이온된 물으로 아래로 위에서 3 번 템플릿 세척.
    참고: 서식 파일 청소 같은 에탄올, 어떤 유기 용 매를 사용 하지 마십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

그림 3 은 전형적인 3D 인쇄 arraying 템플릿을 보여준다. 이 감광 성 수 지 원료로 사용 하 여 템플릿과 3D 프린터;에 의해 만들어진 블랙 페인트의 레이어 배아의 색상에 더 나은 대조를 제공 하기 위해 적용 되었습니다. 96 웰 스 (8으로 12)의 위치는 표준 96 잘 접시와 맞게 설계 되었다. 마찬가지로, 384 (16 24) 잘 서식 파일 또한 디자인 될 수 하 고 동일한 방법을 사용 하 여 조작 합니다. 거꾸로 챔버는 더 나은 적합을 제공 하기 위해 표준 96 잘 접시 보다 약간 더 큰. 홈 또한 배열 하는 동안 여분의 배아를 개최 하도록 설계 되었습니다.

겸손 한 속도로 20 접시만 2 ~ 3 접시 수동으로 준비 될 수 있는 하는 동안 30 분 이내 3D 인쇄 arraying 서식 파일을 사용 하 여 준비 수 있습니다. 표 1 은 수동, 로봇, 및 arraying 템플릿 작업을 비교를 보여준다. 그림 4 는 두 접시, 3D 인쇄 arraying 템플릿에 의해 짓고, 수동으로 준비 하는 것을 비교. Arraying 템플릿을 사용 하 여, 또한 추가 노출 실험에 대 한 편리 하 게 만든 배아 전송 액체의 금액을 무시할 수 있었다.

그림 5 에서는 수동 및 arraying 템플릿 방법으로 도금 되 고 후 태아의 전반적인 건강 상태에 중요 한 효과 없이 했다. 배아 같은 arraying 프로세스에 의해 영향을 받지 했다 다는 것을 확인 하십시오, 우리는 3 일 동안 96 잘 접시에 그들을 개 후 배아 개발 따라. 부 화 율, 생존 율, 및 24, 48, 및 72에서 zebrafish 태아의 기형 율 hpf 모두 수동으로 짓고 배아와 비교 했다.

Figure 1
그림 1: 디자인 서식 파일을 배열 zebrafish 태아의. (AC) 3 차원 최대 도면 템플릿의 개요를 보여주는. (B) 횡단면 서식 파일의 보기. (D) A는 서식 파일의 부분 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 일반적인 단계 arraying 서식 파일을 사용 하는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 3D 인쇄 arraying 템플릿의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 96 잘 접시에 후 배아의 현미경 이미지. 서식 파일에 짓고 96 잘 접시의 (A) 부분 이미지. (B) 수동으로 짓고 96 잘 접시의 부분 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 수동 및 arraying 템플릿 방법으로 도금 되 고 후 태아의 전반적인 건강 상태. 후 비정상적인, 해칭 및 배아의 생존 율에 따라 수동 또는 arraying 템플릿 메서드를 사용 하 여 도금, 태아의 전반적인 건강에 중요 한 효과 없이 두 경우에서 관찰 되었다. 오차 막대는 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

수동 로봇 플랫폼 배열 템플릿
도금 시간 10-30 분/접시 5-10 분/접시 1-2 분/접시
비용 낮은 높은 낮은
필요한 교육 최소 높은 Minumum
작업 영역 작은 작은
태아에 영향 거의 없음 거의 없음 거의 없음
잘 당 추가 하는 액체의 양 무작위 5-10 Μ L 최소

표 1: 수동, 로봇, 및 arraying 템플릿 작업의 비교.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

3D 인쇄 템플릿 개 zebrafish 태아의 성공적인 구현에 대 한 세심 한 관심을 필요로 하는이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다.

Arraying 서식 파일의 디자인에서 가장 중요 한 요소는 함정을 잘 이다. 확실 하 게 하는 단 하나의 배아 각 우물에 갇혀, 하나 지름과 함정 우물의 깊이 통해 구멍의 지름에 세심 한 관심을 기울여야 한다. 권장된 직경 내에서 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 1.5 ~ 2 배입니다. 잘 함정의 깊이 이어야 한다 내 2 시간 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 같은 우물에서 배아의 스태킹 피하기 위해. 통해 구멍의 지름을 이어야 한다 약 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 절반을 배아는 구멍을 통해 부정적인 압력에 의해 압력을 받고 피하기 위해. 디자인의 복잡성 때문에 3D 인쇄 기술은 arraying 서식 파일의 제작에 대 한는 것이 좋습니다.

Arraying 서식 파일의 지정 된 위치, 96-또는 384-잘 접시와 맞는 위치에 개별 배아를 모 함 것입니다. 장소에서 그들을 손상 없이 개별 배아를 적절 한 부정적인 압력을 만들려면 하나 진공 장치에 의해 생성 된 부정적인 압력을 조정 해야 합니다. 너무 작은 압력 우물에 그들을 트래핑 되지 수 하는 동안 너무 많은 압력, 배아를 파괴 수 있습니다. 따라서, 그것은 좋습니다 multiwell 격판덮개에 그들을 전송 하기 전에 stereomicroscope 아래 서식에 속은 태아를 관찰 하는 것. 또한, 함정, 동안 배아 수에 노출 될 공기가 과정. 이 생긴다면, 추가 Holtfreter 추가 단계 4.3에 따라 함정 챔버에 매체. 또한, 공기에 노출 되는 배아의 가능성 때문에 현재 프로토콜 dechorionated zebrafish 태아에 작동 하지 않습니다.

이 작품에서 제시 arraying 템플릿은 zebrafish 태아를 사용 하 여 낮은 비용과 높은 처리량 검열 플랫폼 구축을 위한 혁신적인 접근을 제공 합니다. 이전 설립된 로봇 플랫폼 또는 상용 교류 cytometry 기반 악기에 비해,이 메서드는 사용 하기 쉬운 고 정교한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 3D 인쇄 기술의 복용 장점, 하나 쉽게 다른 목적에 맞게 arraying 서식 파일의 포맷을 바꿀 수 있었다.

서식 파일 및 그것의 현재 모양에 프로토콜 여전히 일부 수동 작업이 필요합니다. 절차를 간소화 수 또한 처리량 수준을 향상 고 시간의 짧은 기간 내 준비 multiwell 격판덮개의 양을 증가 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 설명된 3D 인쇄 서식 파일에 대 한 특허를 가득 있다.

Acknowledgments

이 작품은 "1000plan" 프로그램, Tongji 대학, 그리고 NSFC 부여 # 21607115에서 시작 자금 및 21777116 (린)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish Facility Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. Z-A-S5
Mating box Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml Sangon Biotech F505001-0001
Sodium chloride Vetec V900058-500G
Potassium Chloride Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10016318
Calcium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 20011160
Sodium bicarbonate  Vetec v900182-500G
Methylene Blue Hydrate TCI M0501
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011008
Sea Salts Instant Ocean SS15-10
Pipetter Fisherbrand 13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet Fisherbrand 13-678-30
Microscope OLYMPUS SZ61
Biochemical incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. LRH-250
3D printer UnionTech Lite600
Photosensitive resin UnionTech UTR9000
Vacuum pump Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals Solarbio YA0245
96 well plate Costar 3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl Eppendorf 3122000.051
Compressed Gas Duster Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. ST1005
DI Water Thermo GenPure Pro UV/UF
Drying oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. BPG-9106A
System water Water out of the facility’s water system
Egg water Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357, (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9, (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8, (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5, (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7, (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17, (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, (9-10), 1608-1618 (2013).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, T., Jiang, Y., Lin, S. A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying. J. Vis. Exp. (136), e57892, doi:10.3791/57892 (2018).More

Yu, T., Jiang, Y., Lin, S. A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying. J. Vis. Exp. (136), e57892, doi:10.3791/57892 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter