Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fertigen eine zebrafischembryo Vorlage, gefolgt von ein detailliertes Verfahren für die Verwendung dieser Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos Anordnung in einer 96-Well-Platte anordnen.
Abstract
Der Zebrabärbling ist ein weltweit anerkannter Süßwasser Organismus häufig in Entwicklungsbiologie, Umwelttoxikologie und Krankheit beim Menschen verwandten Forschungsgebieten. Dank seiner einzigartigen Eigenschaften, einschließlich große Fruchtbarkeit, Embryo Transluzenz, schnelle und gleichzeitige Entwicklung, etc.Zebrafisch-Embryonen werden häufig verwendet für groß angelegte Toxizität Bewertung von Chemikalien und Drogen/Compound Screening. Eine typische Screening-Verfahren beinhaltet Erwachsenen Zebrafisch laichen, Embryonen Auswahl und Anordnung der Embryonen in Multi-well-Platten. Von dort aus Embryonen sind Belichtung und die Toxizität von Chemikalien ausgesetzt, oder die Wirksamkeit der Medikamente/Verbindungen kann relativ schnell anhand der phänotypischen Beobachtungen ausgewertet werden. Zwischen diesen Prozessen ist Embryonen anordnen eine zeitraubende und arbeitsintensive Schritte, die den Durchsatz begrenzt. In diesem Protokoll präsentieren wir ein innovatives Konzept, das macht die Verwendung einer 3D-gedruckten arraying Vorlage in Verbindung mit-Manipulation Vakuum um diesen mühsamen Schritt zu beschleunigen. Das Protokoll hierin beschreibt das Gesamtdesign der arraying Vorlage, eine detaillierte Versuchsaufbau und Schritt für Schritt Verfahren, gefolgt von repräsentative Ergebnisse. Bei der Implementierung sollte dieser Ansatz in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung mit Zebrafisch-Embryonen als Tests Themen vorteilhaft.
Introduction
Als beliebter Modellorganismus ist in den Bereichen Medizin und Toxikologie1,2,3,4Zebrafisch verbreitet. Im Vergleich zu in-vitro- Plattformen, Zebrafisch bieten viel höherer biologischen Komplexität, dass ein oder zwei Zelltypen nicht bieten konnte. Abgesehen davon, dass ein Organismus, Modell, dem Zebrafisch-große Fruchtbarkeit, schnelle und gleichzeitige Embryonalentwicklung und hohen Orgel Transluzenz haben gegeben, dieses Modell einzigartige Vorteile für groß angelegte Toxizität oder Drogen/Verbund screening-5verwendet werden. Die Hunderte von Embryonen, die jede Woche von ein paar Erwachsene Zebrafisch produziert haben übertreffen alle anderen ganz Tiermodellen und es für Hochdurchsatz-Screening geeignet.
Eine typische Screening-Verfahren mit Zebrafisch beinhaltet eine erhebliche Menge an Handarbeit, wie Erwachsene Zebrafisch laichen, Embryo Auswahl und Anordnung von Embryonen in geeigneten Behältern, wo sie auf die Exposition durch Eintauchen in Wasser ausgesetzt sind. Die Entwicklung der Embryonen wird überwacht und beobachtbaren Endpunkte wie Sterblichkeit, Schlupfrate und Anomalie sind oft manuell ausgewertet und als vorläufige Identifikationen der Toxizität von Chemikalien oder Hinweise auf die Wirksamkeit der Drogen oder Verbindungen. Um die Screening-Verfahren zu beschleunigen, wurden zuvor Ansätze wie automatisierte Imaging- und computergestützte Bildanalyse untersucht. Beispielsweise wurden Mikroskope mit hohem Gehalt imaging-Funktionen führen Sie automatisierte Hellfeld oder Fluoreszenz-Bildgebung auf Zebrafish Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien von 96/384-well-Platten6angepasst. Mikrofluidische Geräte gepaart mit Mikroskopen dienten zebrafischlarven durch aktuellen Bearbeitung für die Bildgebung des Gehirns Neuronen7positionieren. Diese Ansätze könnten die Effizienz der Bild Akquisitionen im Vergleich zum traditionellen manuellen Betrieb erheblich verbessern. Darüber hinaus wurden mit großen Anzahl von Bildern erzeugt werden, Bild-Analyse-Tools auch entwickelt, um die Verarbeitung der Daten zu beschleunigen wie Liu Et Al. und Tu Et Al. zeigen 8 , 9.
Der Durchsatz der Bildverarbeitung und Bildanalyse erhöht, wurde es klar, dass die Bandbreitenbegrenzung Schritt für das Screening liegt in den Prozess der Exposition, die in der Regel bedeutet, wobei sie in 96 oder 384-Well-Platten Zebrafish Embryos vorbereiten. Um diesen Engpass Schritt zu lösen, Vision-geführte Robotik von Mandrell Et Al. entwickelt wurden 10 und uns11 zuvor, manuelle Handhabung aber die Instrumente zu ersetzen waren eher anspruchsvoll und es gibt eine Tiefe Lernkurve, solche Techniken umzusetzen. Daher bieten ein easy-to-Use-Ansatz ist ein wichtiger Faktor, der Durchsatz Zebrafisch-Screening weiter zu verbessern und das Hauptziel dieser Arbeit ist.
In dieser Arbeit wir konstruiert und gefertigt einen Embryo, die Vorlage von 3D-Druck anordnen. Eine arraying Vorlage wurde entwickelt, um Zebrafish Embryos in Vertiefungen, die mit einer standard 96-Well-Platte passen zu fangen. Anstelle von Embryonen auswählen und anordnen sie in einzelnen Brunnen eins nach dem anderen, könnte man Embryo Einschluss und Array alle 96 Embryonen in einem mehrlagigen Teller auf einmal durchführen. Mit dieser Vorlage und das folgende Protokoll, konnte man deutlich steigern die Effizienz der Embryonen in mehrlagigen Platten, die im Begriff Schub würde die Screening-Kapazität mindestens das Zehnfache, im Vergleich zu manuellen Betrieb anordnen. Die nachfolgend beschriebene Protokoll beinhaltet eine Gesamtkonzeption für die Anordnung der Vorlage, Zebrafisch laichen, Embryo-Sammlung und Anordnung. Abbildung 1 zeigt das gesamte Design der arraying Vorlage. Abbildung 2 zeigt eine Übersicht des Protokolls Schritt für Schritt über die Verwendung der Vorlage in den Teilen 3 und 4 beschrieben.
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Protocol
1. Design und Fertigung von einem Zebrafish Embryos anordnen Vorlage
-
Entwerfen Sie die arraying Vorlage mit einem 12 x 8, 96-Well-Layout, das eine standard 96-Well-Platte passt. Verwendung der Dimensionen in Figur 1A für die oberen Embryo Einklemmung Kammer aufgeführt (siehe auch die ergänzenden Datei).
- Verwenden Sie die Maße, die in Abbildung 1 b und 1D für die Verlockende Falle gut gezeigt.
- Verwenden Sie die Maße für die Vakuumkammer unten in Abbildung 1 .
- Verwenden Sie die Maße für die Luft im in Abbildung 1 b / Outlet.
- Verwenden Sie einen 3D-Drucker (mit 0,1 mm Genauigkeit) die Vorlage drucken; siehe Tabelle der Materialien für empfohlene Harz für den Druck verwendet werden.
Hinweis: 3D Drucker mit einer Genauigkeit von 0,1 mm werden für die Herstellung der arraying Vorlage empfohlen (siehe Tabelle der Materialien). Die empfohlene Farbe für die Fläche der Vorlage ist dunkelgrau oder schwarz.
(2) Zebrafischembryo Laichen
- Legen Sie zwei Paare von männlichen und weiblichen Fische pro Paarung Box einen Tag vor der Laichzeit. Getrennten Männchen und Weibchen durch einen durchsichtigen Kunststoff Teiler.
- Nehmen Sie den Teilern morgens, männliche und weibliche Fische zu mischen.
- Entfernen Sie die männlichen und weiblichen Fische und sammeln Sie Zebrafisch-Embryonen mit einem feinmaschigen Sieb zu. Waschen Sie die Embryonen mit Ei 250 mL Wasser (siehe Tabelle der Materialien).
- Übertragen Sie die gesammelten Embryonen auf Petrischalen (90 mm Durchmesser) mit Holtfreter Lösung (siehe Tabelle der Materialien) und Tote und unbefruchtete Embryonen mit einem Stereomikroskop zu entfernen.
- Legen Sie die Embryonen in einem Inkubator 28,5 ° C. Um 4 Uhr post Düngung (hpf), beobachten die Embryonen und entfernen Sie alle Toten und ungesunden Embryonen. Die Embryonen sind nun bereit für den nächsten Schritt.
3. Vorbereitung der Vorlage anordnen
- Waschen Sie die Vorlage 2 – 3 Mal mit 500 mL entionisiertem Wasser und steckte es in den Trockenofen (45 ° C) für 5 min.
- Kleben Sie die untere Kammer mit einem Stück des Versiegelns Film (Bild 2Schritt 1).
- Verbinden Sie eine Vakuum-Pumpe durch den Luftauslass an der Unterseite der Vorlage.
Hinweis: Die empfohlene max. Vakuum für die Vakuumpumpe ist 0,1 Mpa. Beachten Sie die Stärke des Vakuums verwendet. Wenn der Unterdruck zu stark ist, schneiden Sie eine kreuzförmige Loch auf der Siegelfolie, den Druck zu senken.
4. Anordnung Zebrafish Embryos in einer 96-Well-Platte
- Mit einer Kunststoff transferpipette, legen Sie ca. 150 Embryonen in die Vorlage, wie in Abbildung 2, Schritt2 gezeigt.
- Verbinden Sie die Vakuumpumpe bis zum ausblas Unterdruck in der Kammer von der Siegelfolie in Schritt 3.3 versiegelt zu generieren.
- Schütteln Sie die gesamte Vorlage horizontal, bis jeder auch ein Embryo gefangen (Abbildung 2, Schritt 3 hat).
Hinweis: Wenn die Holtfreter Lösung trocknet, bevor die Embryonen in jedem Bohrloch gefangen sind, fügen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung in der Einklemmung Kammer hinzu und wiederholen Sie diesen Schritt. - Entsorgen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung und Embryonen, die nicht in den Brunnen (Abbildung 2, Schritt 4) eingeschlossen sind.
- Schalten Sie aus und trennen Sie die Vakuumpumpe.
- Legen Sie eine standard 96-Well-Platte umgedreht gegen die Vorlage (Abbildung 2, Schritt 5) und drehen Sie beide zur gleichen Zeit (Abbildung 2, Schritt 6).
- Tippen Sie auf der Unterseite der Vorlage oder die Luft verbinden Steckdose, um ein komprimiertes Gas Abstauben kann um alle eingeschlossenen Embryonen aus der Vorlage auf die 96-Well-Platte (Abbildung 2, Schritt 6) übertragen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4,8, zusätzliche Multi-well-Platten vorzubereiten.
- Der Siegelfolie entfernen und Waschen der Vorlage 3 Mal von oben bis unten mit 500 mL entionisiertem Wasser für eine spätere Verwendung.
Hinweis: Verwenden Sie organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, nicht um die Vorlage zu reinigen.
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Representative Results
Abbildung 3 zeigt eine typische 3D-gedruckten arraying Vorlage. Diese Vorlage verwendet lichtempfindliche Harz als Rohstoff und wurde von einem 3D-Drucker gemacht; eine Schicht aus schwarzem Lack wurde angewandt, um einen besseren Kontrast zur Farbe der Embryonen zur Verfügung zu stellen. Die Position von 96 Wells (12 x 8) wurde entwickelt, um mit einer standard 96-Well-Platte passen. Ebenso eine 384 (24 x 16) gut Vorlage könnte auch so konzipiert und hergestellt unter Verwendung der gleichen Methode. Der Vorteil Kammer war etwas größer als ein standard 96-Well-Platte, bieten eine optimale Passform. Nuten wurden auch entwickelt, um die zusätzlichen Embryonen während der Anordnung zu halten.
Zu einem bescheidenen Preis konnte 20 Platten vorbereitet werden, der Bohrschablone 3D-gedruckten arraying innerhalb von 30 Minuten, während nur zwei bis drei Platten manuell vorbereitet werden konnte. Tabelle 1 zeigt einen Vergleich zwischen manuellen, Roboter und Anordnung Vorlage Operationen. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich zwischen zwei Platten, angeordnet von der 3D-gedruckten arraying Vorlage, manuell vorbereitet. Mit der arraying Vorlage gab es eine vernachlässigbare Menge Flüssigkeit übertragen mit den Embryonen, die auch es bequem für weitere Belichtung Experimente gemacht.
Abbildung 5 zeigt, dass gab es keine wesentlichen Auswirkungen auf den allgemeinen Gesundheitszustand der Embryonen nach wird durch manuelle und Anordnung Vorlage Verfahren überzogen. Um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht durch einen arraying Prozess betroffen waren, folgten wir Entwicklung des Embryos nach Anordnung sie in 96-Well-Platten für 3 Tage. Die Schlupfrate, Überlebensrate und Fehlbildung Rate von Zebrafisch-Embryonen am 24, 48 und 72 hpf waren vergleichbar mit den Embryonen manuell angeordnet.
Abbildung 1: Entwurf eines Zebrafish Embryos Vorlage anordnen. (A und C) 3-d Max Zeichnung zeigt die Übersicht der Vorlage. (B) Querschnitt der Vorlage anzeigen (D) eine eingeschränkte Sicht auf die Vorlage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: typische Schritte bei der Verwendung der Vorlage arraying. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Fotos einer 3D-gedruckten arraying Vorlage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: mikroskopische Aufnahmen von Embryonen nach 96-Well-Platte übertragen. (A) teilweise Bild einer 96-Well-Platte angeordnet von der Vorlage. (B) teilweise Bild einer 96-Well-Platte manuell angeordnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: der allgemeine Gesundheitszustand der Embryonen nach wird durch manuelle und Anordnung Vorlage Methoden vernickelt. Basierend auf den Schlupf, abnormal, und Überlebensraten der Embryonen nach dem verchromt mit Handbuch oder die arraying Vorlage-Methoden, keine wesentlichen Auswirkungen auf den Gesamtzustand der Embryonen wurden in beiden Fällen beobachtet. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Manuell | Roboterplattform | Anordnung der Vorlage | |
| Beschichtung-Zeit | 10-30 min/Platte | 5 – 10 min./Platte | 1 – 2 min./Platte |
| Kosten | Low | Hoch | Low |
| Erforderliche Ausbildung | Mindestens | Hoch | Minimum |
| Arbeiten Bereich | Kleine | Große | Kleine |
| Wirkung auf die Embryonen | Wenig bis keine | Wenig bis keine | Wenig bis keine |
| Flüssigkeitsmenge pro Bohrloch hinzugefügt | Zufällige | 5 – 10 ΜL | Mindestens |
Tabelle 1: Vergleich der manuellen, Roboter und Anordnung Vorlage Operationen.
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Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit für eine erfolgreiche Umsetzung der 3D-Druck Vorlage erfordern für Anordnung Zebrafisch-Embryonen.
Der wichtigste Faktor auf die Gestaltung der arraying Vorlage ist die Einklemmung. Macht sicher gibt es nur einen Embryo in jedes gut gefangen, man sollte achten Sie besonders auf den Durchmesser und die Tiefe des Brunnens Verlockende Falle, und der Durchmesser der Durchgangsöffnung. Der empfohlene Durchmesser ist innerhalb von 1,5 bis 2-fache des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion). Die Tiefe der Einklemmung gut sollte innerhalb 2 Mal des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion) zur Vermeidung von Embryonen in der gleichen gut stapeln. Der Durchmesser der Durchgangsöffnung sollte etwa die Hälfte des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion) Embryonen verdrängt durch das Loch durch den Unterdruck zu vermeiden. Aufgrund der Komplexität des Entwurfs wird für die Fertigung der arraying Vorlage 3D-Drucktechnologie empfohlen.
Das Wesen der arraying Vorlage soll einzelnen Embryonen an bestimmten Standorten, d.h. Positionen zu fangen, die mit einem 96 oder 384-Well-Platte passen. Erstellen Sie einen richtigen Unterdruck an die einzelnen Embryonen in Position zu halten, ohne sie zu beschädigen, muss man den Unterdruck erzeugt durch die Vakuum-Gerät einstellen. Zu viel Druck kann die Embryonen zerstören, während zu wenig Druck nicht sie in den Brunnen fangen kann. Daher ist es dringend empfohlen, zu beobachten, die Embryonen vor der Übertragung in die multiwell-Platten in der Vorlage unter einem Stereomikroskop gefangen. Darüber hinaus könnte die Embryonen während Einklemmung, an der Luft während dieses Prozesses ausgesetzt werden. Sollte dies geschehen, fügen Sie zusätzliche Holtfreter Mittel in der Einklemmung Kammer gemäß Schritt 4.3. Auch wegen der Möglichkeit von Embryonen, die an der Luft ausgesetzt wird, funktioniert das aktuelle Protokoll auf Dechorionated Zebrafish Embryos nicht.
Die arraying Vorlage in dieser Arbeit präsentierte bietet einen innovativen Ansatz für eine Low-Cost- und Hochdurchsatz-Screening-Plattform mit Zebrafisch-Embryonen zu etablieren. Im Vergleich zu vorher festgelegten Roboter-Plattformen oder im Handel erhältlichen Flow Cytometry-basierten Instrument, diese Methode ist einfach zu bedienen und erfordert keine anspruchsvolle Ausbildung. Nehmen Vorteile der 3D Druck Technologie, könnte man das Format der arraying Vorlage für verschiedene Zwecke passen problemlos ändern.
Die Vorlage und das Protokoll in seiner jetzigen Form benötigen noch einige manuelle Arbeit. Straffung des Verfahrens weiter den Durchsatz verbessern und erhöhen Sie die Menge der multiwell-Platten innerhalb kurzer Zeit vorbereitet.
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Disclosures
Die Autoren haben ein Patent auf die beschriebenen 3D-gedruckten Vorlage gefüllt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Jugendprogramm "1000plan", die Startup-Fonds von der Tongji-Universität und NSFC Grant # 21607115 und 21777116 (Lin) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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