Summary
Her presenterer vi en protokoll å design og dikte en sebrafisk embryoet stiller opp mal, etterfulgt av en detaljert prosedyre på bruken av slike mal for høy gjennomstrømning sebrafisk embryoet stiller opp i en 96-brønns plate.
Abstract
Sebrafisk er en globalt anerkjent ferskvann organisme brukes ofte i utviklingsbiologi, miljømessige toksikologi og menneskelig sykdom relatert forskningsfelt. Takket være sin unike funksjoner, inkludert store fruktbarhet, fosteret gjennomskinnelighet, rask og samtidig utvikling, etc., sebrafisk embryo brukes ofte til storskala toksisitet vurdering av kjemikalier og narkotika/sammensatte screening. En typisk screening prosedyre innebærer voksen sebrafisk gyting embryo utvalg og stiller opp embryoene til flere bra plater. Derfra embryoer er utsatt for eksponering og toksisitet av kjemiske eller effektiviteten av narkotika/forbindelser kan evalueres relativt raskt basert på fenotypiske observasjoner. Blant disse prosessene er embryo stiller opp en av de mest tidkrevende og arbeidskrevende trinnene som begrenser gjennomstrømmingsnivået. I denne protokollen presenterer vi en innovativ tilnærming som gjør bruk av en 3D-trykt arraying mal kombinert med vakuum manipulasjon å fremskynde dette arbeidskrevende trinnet. Protokollen her beskriver utformingen av malen arraying, detaljert eksperimentelle oppsett og fremgangsmåte, etterfulgt av representant resultater. Når implementert, bør dette være nyttig i en rekke forskning programmer bruker sebrafisk embryo som tester fag.
Introduction
Som en populær modell organisme, er sebrafisk mye brukt innen medisin og toksikologi1,2,3,4. Sammenlignet med i vitro plattformer, sebrafisk tilbyr mye større biologiske kompleksiteten som en eller to celletyper kan ikke tilby. Foruten å være en hele organismen modell, sebrafisks store fruktbarhet, rask og samtidig embryonale utvikling og høye orgel gjennomskinnelighet har gitt denne modellen unike fordeler som skal brukes for storskala toksisitet eller narkotika/sammensatte screening5. Hundrevis av embryo produsert av et par voksen sebrafisk hver uke overgå alle andre helt dyr modeller og har gjort det passer for høy gjennomstrømning screening.
En typisk screening prosedyre bruker sebrafisk innebærer mye manuelt arbeid, som voksen sebrafisk gyting, embryoet valg, og stiller opp embryo i passende beholdere der de er utsatt for eksponering gjennom vann nedsenking. Utviklingen av embryoene overvåkes og observerbare endepunkter som dødelighet, hatchability og abnormitet ofte evalueres manuelt og som foreløpig identifikasjonene toksisitet av kjemikalier eller indikasjoner på effektiviteten av narkotika eller forbindelser. For å fremskynde screening prosedyre, har tilnærminger som automatisk bildebehandling og computer-assistert bildeanalyser blitt utforsket tidligere. For eksempel er mikroskop med høyt innhold imaging evner tilpasset utføre automatiserte lyse-feltet eller fluorescens bildebehandling på sebrafisk embryoer på ulike utviklingsstadier 96/384 bra plater6. Microfluidic enheter kombinert med mikroskop ble brukt til å plassere sebrafisk Larvene gjennom gjeldende manipulasjon for imaging hjernen nevroner7. Disse metodene kan forbedre effektiviteten av bildet oppkjøp sammenlignet med tradisjonell manuell drift. Videre med mange bilder som genereres, er analyseverktøy også utviklet for å fremskynde databehandlingen, som demonstrert av Liu et al. og Tu et al. 8 , 9.
Som gjennomstrømmingsnivå for bildebehandling og bilde øker, ble det klart at det hastighetsbegrensning steget for screening ligger under forbereder sebrafisk embryo eksponering, som vanligvis betyr stiller opp dem i 96 - eller 384-godt platene. For å løse dette flaskehalsen trinnet, visjon-guidede robotikk ble utviklet av Mandrell et al. 10 og oss11 tidligere å erstatte Manuell håndtering men instrumentene var nokså sofistikert og det er en dyp læringskurve å gjennomføre slike teknikker. Derfor å gi en lett-å-bruke tilnærming blir en viktig faktor å forbedre gjennomstrømmingsnivå for sebrafisk screening og er det viktigste formålet med dette arbeidet.
I dette arbeidet vi designet og fabrikkert et embryo stiller opp mal av 3D-utskrift. Slike en arraying mal designet for å lure sebrafisk embryoet i brønner som passer med en standard 96-brønns plate. I stedet for å velge embryoer og stiller opp dem inn personlige brønnen enkeltvis, kan en utføre embryoet entrapment og matrise alle 96 embryo i en multiwall plate samtidig. Bruke denne malen og følgende protokollen, kan en betydelig økning effektiviteten av stiller opp embryo i multiwall platene, som ville i begrepet boost screening kapasitet minst ti ganger, sammenlignet med manuell drift. Protokollen beskrevet nedenfor inkluderer en utformingen for stiller opp mal, sebrafisk gyting, fosteret samling, og stiller opp. Figur 1 viser utformingen av malen arraying. Figur 2 viser en oversikt over den trinnvise protokollen ved hjelp av malen beskrevet i delene 3 og 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design og fabrikasjon av en sebrafisk embryo stiller opp malen
-
Utforme arraying malen med en 12 av 8, 96-brønns oppsett som passer en standard 96-brønns plate. Bruk dimensjonene oppført i figur 1A for øvre embryoet entrapment kammeret (se også ekstra filen).
- Bruke dimensjoner vises i figur 1B og 1 D for entrapment godt.
- Bruke dimensjoner i figur 1 c for bunnen vakuum kammer.
- Bruke dimensjoner i figur 1B for luften i / stikkontakt.
- Bruke en 3D-printer (med 0,1 mm presisjon) skrive ut malen. se Tabellen for materiale for anbefalte harpiks brukes til utskrift.
Merk: 3D-skrivere med en 0,1 mm presisjon anbefales for fabrikasjon av malen arraying (se Tabell for materiale). Foreslåtte fargen på overflaten av malen er mørk grå eller sort.
2. sebrafisk Embryo gyting
- Plass to par mannlige og kvinnelige fisk per parring for én dag før gyting. Egne menn og kvinner ved en klar plast skillelinje.
- Ta av skillelinjene i morgen å blande mannlige og kvinnelige fisk.
- Fjern mannlige og kvinnelige fisken og samle sebrafisk embryo med en finmasket sil. Vask embryo med 250 mL egg vann (se Tabell for materiale).
- Overføre de innsamlede embryoene til petri retter (90 mm i diameter) med Holtfreters løsning (se Tabell for materiale) og fjerne døde og 5mas embryo ved hjelp av en stereomicroscope.
- Plass embryoene i en 28,5 ° C inkubator. På 4 h legge befruktning (hpf), observere embryoene og fjerne alle døde og usunn embryoer. The embryo er nå klar for neste trinn.
3. forberedelse av stiller opp malen
- Vask malen 2 – 3 ganger med 500 mL vaskebuffer vann og putte den i tørking ovnen (45 ° C) i 5 minutter.
- Tape bunnen kammer med en forsegling film (figur 2trinn 1).
- Koble en vakuumpumpe gjennom luften uttaket nederst i malen.
Merk: Det anbefalte max vakuumet for vakuumpumpe er 0,1 Mpa. Vær oppmerksom på styrken av vakuum brukes. Hvis den negative trykket er for sterk, klippe korsformede hull på tetting filmen å senke trykket.
4. stiller opp sebrafisk embryo i en 96-brønns plate
- Bruker en plast overføring pipette, plassere ca 150 embryo i malen, som vist i figur 2, trinn 2.
- Koble vakuumpumpe til luftutløpet å generere negative trykket i kammeret forseglet tetting filmen i trinn 3.3.
- Rist hele mal vannrett til hver har også en embryoet fanget (figur 2, trinn 3).
Merk: Hvis den Holtfreter løsningen tørker opp før embryoene er fanget i hver brønn, legge til flere Holtfreter løsning i entrapment kammeret og gjenta dette trinnet. - Kast ekstra Holtfreter løsning og embryo som ikke er fanget i brønnene (figur 2, trinn 4).
- Slå av og koble vakuumpumpe.
- Plasser en standard 96-brønns platen opp ned mot malen (figur 2, trinn 5) og vri begge samtidig (figur 2, trinn 6).
- Trykk på bunnen av malen eller koble luften uttak til en komprimert gass skur kan overføre alle fanget embryoer fra malen til 96-brønns plate (figur 2, trinn 6).
- Gjenta trinn 4.1 til 4,8 å forberede flere multi bra plater.
- Fjerne tetting filmen og vask malen 3 ganger fra topp til bunn med 500 mL vaskebuffer vann for fremtidig bruk.
Merk: Ikke bruk organiske løsemidler, som etanol, for å rengjøre malen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser en typisk 3D-trykt arraying mal. Denne malen bruker fotosensitive harpiks som råvare og ble laget av en 3D-skriver; et lag med sort maling ble brukt til å gi en bedre kontrast til fargen på embryoer. Plasseringen av 96 brønner (12 av 8) ble designet for å passe med en standard 96-brønns plate. Tilsvarende 384 (24 av 16) godt mal kan også være utformet og fabrikasjon benytter samme metode. På oppsiden kammer var litt større enn en standard 96-brønns plate å gi en bedre tilpassing. Sporene var også utformet for å holde de ekstra embryoene under stiller opp.
Beskjeden satser kan 20 plater tilberedes ved hjelp av 3D-trykt arraying malen innen 30 min, mens bare to til tre plater kan tilberedes manuelt. Tabell 1 viser en sammenligning mellom manuell, robot og stiller opp malen operasjoner. Figur 4 viser en sammenligning mellom to plater, en plassert ved 3D-trykt arraying malen, en forberedt manuelt. Bruk malen arraying, var det en ubetydelig mengde væske overført med embryoer, som også gjorde det praktisk for videre eksponering eksperimenter.
Figur 5 viser at det var ingen signifikant effekt på samlet helsetilstanden til embryoene etter å være belagt med manuell og stiller opp mal metoder. Sikre embryoene ikke ble påvirket av slikt arraying prosess, fulgte vi embryo utvikling etter stiller opp dem i 96-brønnen platene i 3 dager. Klekking pris, overlevelse, og misdannelse antall sebrafisk embryoer på 24, 48 og 72 hpf var alle sammenlignbare med embryoene plassert manuelt.
Figur 1: utformingen av en sebrafisk embryoet stiller opp malen. (A og C) 3-d Max tegningen viser en oversikt over malen. (B) tverrsnitt Vis av malen. (D) en delvisning av malen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: typisk trinn når du bruker malen arraying. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilder av en 3D-trykt arraying mal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mikroskopiske bilder av embryo etter overført til 96-brønns plate. (A) delvis image av en 96-brønns plate plassert av malen. (B) delvis image av en 96-brønns plate plassert manuelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: samlede helsetilstanden til embryoene etter å være belagt med manuell og stiller opp mal metoder. Basert på klekking, unormal, og overlevelse av embryoene etter å ha blitt belagt med enten manuell eller metodene for arraying mal, ingen signifikant effekt på den generelle tilstanden til embryoene ble observert uansett. Feilfelt er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Manuell | Robot plattform | Stiller opp malen | |
| Plating tid | 10-30 min/plate | 5-10 min/plate | 1-2 min/plate |
| Kostnader | Lav | Høy | Lav |
| Nødvendige opplæring | Minimum | Høy | Minumum |
| Arbeider området | Liten | Store | Liten |
| Effekt på embryoene | Lite til ingen | Lite til ingen | Lite til ingen |
| Mengde væske lagt per brønn | Tilfeldig | 5 – 10 ΜL | Minimum |
Tabell 1: Sammenligning av manuell, robot og stiller opp malen operasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to avgjørende skritt i denne protokollen som krever nøye for en vellykket gjennomføring av 3D-trykt mal for stiller opp sebrafisk embryoer.
Den viktigste faktoren på utformingen av malen arraying er entrapment. Forsikre deg om det er bare én embryoet fanget i hver brønn, en bør være oppmerksom på diameteren og dybden av entrapment brønn og diameteren på gjennom hullet. Anbefalt diameter er innen 1,5 til 2 ganger diameteren på en typisk embryo (inkludert i plasmocitara). Dybden av entrapment godt bør være innen 2 ganger diameteren på en typisk embryo (inkludert plasmocitara) å unngå stabling av embryo samme brønnen. Diameteren på gjennom hullet bør være omtrent halvparten av diameteren på en typisk embryo (inkludert plasmocitara) å unngå embryo presset gjennom hullet av den negative trykket. Design så komplekse anbefales 3D trykking teknologien fabrikasjon av malen arraying.
Essensen av malen arraying er å lure personlige embryo i utpekte områder, dvs stillinger som passer med en 96 - eller 384-godt plate. For å opprette en skikkelig negative trykk å holde de personlige embryoene på plass uten å skade dem, må en justere den negative trykket generert av vakuum enheten. For mye press kan ødelegge embryoer, mens for lite press ikke kan fange dem i brønnene. Derfor er det sterkt anbefalt å observere embryoene fanget i malen under et stereomicroscope før du overfører dem til multiwell platene. Videre under entrapment, kunne embryoene bli utsatt for luft under denne prosessen. Skulle dette skje, legge til flere Holtfreter medium i entrapment kammeret etter trinn 4.3. Også, på grunn av muligheten for embryo blir utsatt for luft, gjeldende protokollen ikke fungerer på dechorionated sebrafisk embryoer.
Arraying malen i verket gir en innovativ tilnærming for å etablere en lav pris og høy gjennomstrømming screening plattform benytter sebrafisk embryoer. I forhold til tidligere etablerte robot-plattformer eller kommersielt tilgjengelig flyt cytometri-baserte instrument, denne metoden er enkel å bruke og krever ikke avanserte trening. Tar fordeler av 3D trykking teknologien, en kan enkelt endre malen arraying å passe ulike formål.
Malen og protokollen i sin nåværende form fortsatt krever litt manuelt arbeid. Strømlinjeforme prosedyren kan videre forbedre gjennomstrømmingsnivået og øke multiwell plater utarbeidet innen en kort tidsperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har fylt patent på beskrevet 3D-trykt malen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av programmet "1000plan Youth", oppstart midlene fra Tongji-universitetet og NSFC Grant # 21607115 og 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
