Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar um embrião de zebrafish põr modelo, seguido por um procedimento detalhado sobre a utilização de tal modelo para alto throughput zebrafish embrião põr em uma placa de 96 poços.
Abstract
O peixe-zebra é que um organismo reconhecido mundialmente água doce frequentemente usada em biologia do desenvolvimento, toxicologia ambiental e humana doença campos de investigação com ele relacionada. Graças a suas características únicas, incluindo a grande fecundidade, translucidez do embrião, evolução rápida e simultânea, etc., zebrafish embriões são frequentemente utilizados para avaliação de toxicidade em larga escala de produtos químicos e drogas/compostom triagem. Um procedimento de rastreio típico envolve adulto zebrafish desova, seleção de embriões e põr os embriões em placas multi bem. A partir daí, embriões sejam sujeitos a exposição e a toxicidade do produto químico, ou a eficácia dos medicamentos/compostos pode ser avaliada relativamente rápido com base em observações fenotípicas. Entre estes processos, põr de embriões é uma das etapas mais demoradas e trabalhosas que limita o nível de produtividade. Neste protocolo, apresentamos uma inovadora abordagem que faz uso de um modelo arraying 3D-impresso juntamente com vácuo manipulação para acelerar esta etapa trabalhosa. O protocolo neste documento descreve o projeto total do modelo arraying, uma instalação experimental detalhada e procedimento passo a passo, seguido por resultados representativos. Quando implementado, essa abordagem deve provar benéfica em uma variedade de aplicações de pesquisa usando zebrafish embriões como assuntos de teste.
Introduction
Como um organismo modelo popular, o zebrafish é amplamente utilizado nos campos da medicina e toxicologia1,2,3,4. Em comparação com plataformas em vitro , zebrafish oferecem muito maior complexidade biológica que um ou dois tipos de células não podem oferecer. Além de ser um todo organismo modelo, do zebrafish grande fecundidade, rápido e simultâneo de desenvolvimento embrionário e órgão alta translucidez ter dado este vantagens exclusivas do modelo a ser usado para a toxicidade de grande escala ou drogas/composto5de triagem. As centenas de embriões produzidos por um par de zebrafish adulto cada semana superam qualquer outros modelos todo animais e tornaram apropriado para triagem de alto rendimento.
Um procedimento de rastreio típica usando zebrafish envolve uma quantidade significativa de trabalho manual, tais como adulto zebrafish desova, seleção de embriões e põr os embriões em recipientes adequados, onde eles são sujeitos a exposição através da imersão da água. O desenvolvimento dos embriões é monitorado e pontos de extremidade observáveis como anormalidade, eclodibilidade e mortalidade são muitas vezes avaliados manualmente e usados como a identificação preliminar da toxicidade de produtos químicos ou indicações da eficácia da drogas ou compostos. Para acelerar o processo de triagem, abordagens como a automatizada de imagem e análise de imagem computadorizada tem sido exploradas anteriormente. Por exemplo, microscópios com alto teor de imagem recursos foram adaptados para executar brilhante-campo automatizado ou imagens de fluorescência no zebrafish embriões em vários estágios do desenvolvimento de placas bem 384/966. Dispositivos microfluídicos juntamente com microscópios foram usados para posicionar o zebrafish larvas através de manipulação atual para a imagem latente do cérebro neurônios7. Essas abordagens podem melhorar significativamente a eficiência das aquisições de imagem em comparação com operação manual tradicional. Além disso, com grande número de imagens sendo gerada, ferramentas de análise de imagem também foram desenvolvidas para acelerar o processamento de dados, como demonstrado por Liu et al e Tu et al 8 , 9.
À medida que aumenta o nível de taxa de transferência de imagem e análise de imagem, ficou claro que o passo limitante para a seleção encontra-se no processo de preparação do zebrafish embriões para a exposição, que normalmente significa põr-los em placas de 96 ou 384 poços. Para resolver essa etapa gargalo, guiada por visão robótica foram desenvolvidos pela Mandrell et al 10 e nos11 anteriormente para substituir a movimentação manual, mas os instrumentos foram bastante sofisticado e há uma curva de aprendizagem profunda para implementar essas técnicas. Portanto, para fornecer uma abordagem de fácil de usar torna-se um fator importante para melhorar ainda mais o nível de taxa de transferência de zebrafish triagem e é o principal objetivo deste trabalho.
Neste trabalho, nós projetado e fabricado um embrião põr modelo por impressão 3D. Um modelo tão arraying foi projetado para incriminar o zebrafish embrião em poços que se encaixam com uma padrão placa de 96 poços. Em vez de selecionar embriões e põr os em poço individual um por um, um poderia executar matriz e uma armadilha de embrião todos os 96 embriões em uma placa multifoliada de uma só vez. Usando este modelo e o seguinte protocolo, um poderia aumentar significativamente a eficiência de põr os embriões em chapas multifoliadas, que em termo de aumentar a capacidade de rastreio pelo menos dez vezes, comparada a operação manual. O protocolo descrito abaixo inclui um design global para a põr o modelo, o zebrafish desova, a colheita de embriões e põr. A Figura 1 mostra a concepção global do modelo arraying. A Figura 2 mostra uma visão geral do protocolo passo a passo sobre como usar o modelo, descrito nas partes 3 e 4.
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Protocol
1. projeto e fabricação de embriões um Zebrafish põr modelo
-
Cria o modelo de arraying com um 12 por 8, layout de 96 poços que se encaixa uma padrão placa de 96 poços. Uso as dimensões listadas na figura 1A , para a câmara de compressão superior do embrião (consulte também o arquivo suplementar).
- Use as dimensões indicadas na figura 1B e 1D pela captura bem.
- Use as dimensões na Figura 1 , para a câmara de vácuo inferior.
- Use as dimensões na figura 1B para o ar / tomada.
- Usar uma impressora 3D (com precisão de 0,1 mm) para imprimir o modelo; consulte Tabela de materiais para a resina recomendada para ser usada para impressão.
Nota: as impressoras 3D com uma precisão de 0,1 mm são recomendadas para a fabricação do modelo arraying (ver Tabela de materiais). A cor sugerida para a superfície do modelo é cinzento escuro ou preto.
2. Zebrafish embrião desova
- Coloque dois pares de peixes machos e fêmeas por acasalamento caixa um dia antes da desova. Separado machos e fêmeas por um divisor de plástico transparente.
- Tire os divisores de manhã para misturar peixe masculino e feminino.
- Remover o peixe macho e fêmea e coletar embriões zebrafish usando um filtro de malha fina. Lave os embriões com ovo de 250 mL de água (ver Tabela de materiais).
- Transferir os embriões coletados para placas de Petri (90 mm de diâmetro) com solução de Holtfreter (ver Tabela de materiais) e remover os embriões mortos e não fertilizados usando um estereomicroscópio.
- Coloque os embriões em uma incubadora de 28,5 ° C. A 4 h pós fertilização (hpf), observar os embriões e remover qualquer embriões mortos e insalubres. Os embriões estão agora prontos para a próxima etapa.
3. preparação de põr o modelo
- Lave o modelo 2-3 vezes com 500 mL de água desionizada e colocá-lo em estufa (45 ° C) por 5 min.
- Fita câmara inferior com um pedaço de filme (Figura 2etapa 1) de vedação.
- Ligar uma bomba de vácuo através da saída de ar na parte inferior do modelo.
Nota: O vácuo máximo recomendado para a bomba de vácuo é 0.1 Mpa. Esteja ciente da força do vácuo usado. Se a pressão negativa é muito forte, corte um buraco em forma de cruz no filme de selagem para abaixar a pressão.
4. põr Zebrafish embriões em uma placa de 96 poços
- Utilizando uma pipeta de transferência plástica, coloque aproximadamente 150 embriões para o modelo, como demonstrado na Figura 2, passo 2.
- Conecte a bomba de vácuo à saída de ar para gerar pressão negativa na câmara selada pelo filme de selagem na etapa 3.3.
- Agite o modelo inteiro horizontalmente até cada um bem tem um embrião aprisionado (Figura 2, passo 3).
Nota: Se solução ao Holtfreter secar antes dos embriões estão presos em cada poço, adicionar solução da Holtfreter adicionais na câmara de compressão e repita este passo. - Descarte a solução do Holtfreter extra e embriões que não são aprisionados em poços (Figura 2, passo 4).
- Desligue e desconecte a bomba de vácuo.
- Coloque uma placa de 96 poços padrão de cabeça para baixo contra o modelo (Figura 2, etapa 5) e gire os dois ao mesmo tempo (Figura 2, passo 6).
- Toque a parte inferior do modelo ou ligar o ar tomada para uma camada de gás comprimido pode para transferir embriões todos presos o modelo para a placa de 96 poços (Figura 2, passo 6).
- Repita a etapa 4.1 a 4.8 para preparar placas multi bem adicionais.
- Remova a película de vedação e lave o modelo 3 vezes de cima para baixo com 500 mL de água desionizada para uso futuro.
Nota: Não utilize solventes orgânicos, como o etanol, para limpar o modelo.
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Representative Results
A Figura 3 mostra um típico modelo de arraying 3D-impresso. Este modelo usa resina fotossensível como matéria-prima e foi feito por uma impressora 3D; uma camada de tinta preta, aplicou-se para fornecer um melhor contraste com a cor dos embriões. A posição de 96 poços (12 por 8) foi projetada para se encaixar com uma padrão placa de 96 poços. Da mesma forma, um modelo de bem 384 (24 por 16) também pode ser projetado e fabricado usando o mesmo método. O lado positivo câmara era ligeiramente maior do que um padrão placa de 96 poços para fornecer um melhor encaixe. Sulcos também foram projetados para segurar os embriões extras durante a põr.
A uma taxa modesta, 20 placas podem ser preparadas usando o modelo arraying 3D-impresso dentro de 30 min, enquanto apenas dois ou três pratos podem ser preparados manualmente. A tabela 1 mostra uma comparação entre as operações do modelo manual, robótica e põr. A Figura 4 mostra uma comparação entre duas placas que se vestiu pelo modelo arraying 3D-impresso, preparado manualmente. Usando o modelo arraying, havia uma quantidade irrisória de líquido transferido com os embriões, que também é conveniente para experimentos de exposição ainda mais.
A Figura 5 mostra que existiam sem efeitos significativos sobre o estado geral de saúde dos embriões após sendo banhado por métodos manuais e põr modelo. Para garantir que os embriões não foram afetados por um processo tão arraying, seguimos o desenvolvimento do embrião após a põr-los para as placas de 96 poços para 3 dias. A taxa de eclosão, a taxa de sobrevivência e taxa de malformação de zebrafish embriões em 24, 48 e 72 hpf foram todos comparáveis com os embriões dispostos manualmente.
Figura 1: desenho de um embrião de zebrafish põr modelo. (A e C) 3-d Max desenho mostrando a visão geral do modelo. (B) seção transversal Ver os do modelo. (D) A vista parcial do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas típicas ao usar o modelo arraying. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fotografias de um modelo de 3D-impresso arraying. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens microscópicas de embriões depois transferida para placa de 96 poços. (A) imagem parcial de uma placa de 96 poços disposta pelo modelo. (B) imagem parcial de uma placa de 96 poços disposta manualmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: estado geral de saúde dos embriões após sendo banhado por métodos manuais e põr modelo. Baseia-se na incubação, anormal e taxas de sobrevivência de embriões após ser chapeados usando os métodos modelo arraying ou manual, sem efeitos significativos sobre a saúde geral dos embriões foram observados em ambos os casos. Barras de erro são desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Manual | Plataforma robótica | Põr o modelo | |
| Tempo de chapeamento | 10 – 30 min/placa | 5 – 10 min/placa | 1 – 2 min/placa |
| Custo | Baixa | Alta | Baixa |
| Formação exigida | Mínimo | Alta | Minumum |
| Área de trabalho | Pequeno | Grande | Pequeno |
| Efeito sobre os embriões | Pouco ou nenhum | Pouco ou nenhum | Pouco ou nenhum |
| Quantidade de líquido adicionado por alvéolo | Aleatórios | 5 – 10 Μ l | Mínimo |
Tabela 1: Comparação das operações do modelo manual, robótica e põr.
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Discussion
Há duas etapas críticas neste protocolo que exigem muita atenção para uma implementação bem sucedida do modelo 3D-impresso para põr o zebrafish embriões.
O fator mais importante no design do modelo arraying é a armadilha bem. Para garante há apenas um embrião preso em cada poço, um deve prestar atenção para o diâmetro e a profundidade do poço uma armadilha e o diâmetro do furo. O diâmetro recomendado é dentro de 1,5 a 2 vezes o diâmetro de um embrião típico (incluindo o córion). A profundidade da captura bem deve estar dentro 2 vezes o diâmetro de um embrião típico (incluindo o córion) evitar o empilhamento dos embriões no mesmo poço. O diâmetro do furo deve ser de aproximadamente metade do diâmetro de um embrião típico (incluindo o córion) para evitar embriões sendo espremidos através do buraco pela pressão negativa. Devido à complexidade do design, tecnologia de impressão 3D é recomendada para a fabricação do modelo arraying.
A essência do modelo arraying é incriminar embriões individuais em locais designados, ou seja, as posições que se encaixam com uma placa de 96 ou 384 poços. Para criar uma pressão negativa adequada para segurar os embriões individuais no lugar sem danificá-los, deve-se ajustar a pressão negativa gerada pelo dispositivo de vácuo. Muita pressão pode destruir os embriões, enquanto pouca pressão não pode prendê-los em poços. Portanto, é altamente recomendável para observar os embriões aprisionados no modelo sob um estereomicroscópio antes de transferi-los para as placas do multiwell. Além disso, durante uma armadilha, os embriões podem ser expostos ao ar durante este processo. Se tal acontecer, adicionar adicional Holtfreter médio na câmara de compressão de acordo com o passo 4.3. Também, devido à possibilidade de embriões sendo exposta ao ar, o protocolo atual não funciona em embriões de peixe-zebra de dechorionated.
O modelo arraying apresentado neste trabalho fornece uma abordagem inovadora para o estabelecimento de uma plataforma de baixo custo e elevado-throughput screening com embriões de peixe-zebra. Em comparação com as plataformas robóticas previamente estabelecidas ou instrumento baseado em citometria de fluxo disponível comercialmente, esse método é fácil de usar e não requer treinamento sofisticado. Tirar vantagens da tecnologia de impressão 3D, um facilmente pode mudar o formato do modelo arraying para caber a finalidades diferentes.
O protocolo na sua forma atual e o modelo ainda exigem algum trabalho manual. Agilizando o procedimento mais poderia melhorar o nível de produtividade e aumentar a quantidade de placas do multiwell preparado dentro de um curto período de tempo.
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Disclosures
Os autores têm preenchido uma patente sobre o modelo 3D-impresso descrito.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa "Juventude de 1000plan", os fundos de inicialização de Tongji University e NSFC Grant # 21607115 e 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
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