Summary
Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.
Abstract
Zebrafish è che un organismo riconosciuto a livello mondiale di acqua dolce frequentemente utilizzato in biologia dello sviluppo, tossicologia ambientale e malattia umana campi di ricerca correlate. Grazie alle sue caratteristiche uniche, tra cui la grande fecondità, traslucidità dell'embrione, sviluppo rapido e simultaneo, ecc., embrioni di zebrafish sono spesso utilizzati per la valutazione della tossicità su larga scala di prodotti chimici e droghe/mescola lo screening. Una procedura di screening tipica prevede la deposizione delle uova di zebrafish adulto, selezione di embrioni e arraying gli embrioni in piastre multi-pozzetto. Da lì, gli embrioni sono sottoposti per l'esposizione e la tossicità del prodotto chimico, o l'efficacia dei farmaci/composti può essere valutato relativamente rapidamente basata su osservazioni fenotipiche. Tra questi processi, embrioni arraying sono uno dei passaggi più molto tempo e laboriosi che limita il livello di velocità effettiva. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio innovativo che fa uso di un modello di arraying 3D-stampato accoppiato con manipolazione per accelerare questa laboriosa fase di vuoto. Il protocollo di questo documento descrive il disegno complessivo del modello arraying, una dettagliata messa a punto sperimentale e della procedura, seguita da risultati rappresentativi. Quando implementato, questo approccio dovrebbe rivelarsi vantaggioso in una varietà di applicazioni di ricerca utilizzando embrioni di zebrafish come soggetti di prova.
Introduction
Come organismo modello popolare, zebrafish è ampiamente usato nei campi della medicina e tossicologia1,2,3,4. Rispetto alle piattaforme in vitro , zebrafish offrono molto maggiore complessità biologica che uno o due tipi di cellule non potevano offrire. Oltre ad essere un intero organismo modello, grande fecondità di zebrafish, rapido e simultaneo dello sviluppo embrionale e organo ad alta traslucenza hanno dato questo vantaggi unici di modello da utilizzarsi per tossicità su larga scala o farmaci/mescola5di screening. Le centinaia di embrioni prodotti da una coppia di zebrafish adulto ogni settimana superano tutti gli altri modelli animali intero e hanno reso adatto per screening su vasta scala.
Una procedura di screening tipica utilizzando zebrafish comporta una notevole quantità di lavoro manuale, ad esempio di zebrafish adulto deposizione delle uova, selezione degli embrioni e arraying embrioni in idonei contenitori dove sono sottoposti all'esposizione attraverso l'immersione in acqua. Lo sviluppo degli embrioni è monitorato e osservabile endpoint come anomalia, la schiusa e la mortalità sono spesso valutati manualmente e utilizzati come le identificazioni preliminari la tossicità di sostanze chimiche o indicazioni sull'efficacia del farmaci o composti. Per velocizzare la procedura di screening, approcci come l'imaging automatici e analisi di immagine computerizzata sono stati esplorati precedentemente. Ad esempio, microscopi ad alto contenuto funzionalità di imaging sono stati adattati per eseguire automatizzato del luminoso-campo o fluorescenza sugli embrioni di zebrafish alle varie fasi di sviluppo da 96/384 pozzetti6. Dispositivi microfluidici accoppiati con microscopi sono stati utilizzati per posizionare le larve di zebrafish tramite manipolazione corrente per l'imaging del cervello neuroni7. Questi approcci potrebbero migliorare sensibilmente l'efficienza delle acquisizioni di immagine rispetto al tradizionale funzionamento manuale. Inoltre, con gran numero di immagini viene generato, strumenti di analisi di immagine sono anche stati sviluppati per velocizzare l'elaborazione di dati, come dimostrato da Liu et al e Tu et al. 8 , 9.
Come aumenta il livello di velocità effettiva di analisi di formazione immagine e l'immagine, è diventato chiaro che il passaggio limitante per lo screening si trova nel processo di preparazione di embrioni di zebrafish per l'esposizione, che in genere significa arraying li in piastre da 96 o 384 pozzetti. Per risolvere questo passaggio di collo di bottiglia, Fixed-based robotics sono stati sviluppati da Mandrell et al. 10 e noi11 in precedenza per sostituire movimentazione manuale ma gli strumenti erano piuttosto sofisticato e c'è una curva di apprendimento profonda per implementare tali tecniche. Di conseguenza, per fornire un approccio easy-to-use diventa un fattore importante per migliorare ulteriormente il livello di velocità effettiva dello zebrafish screening ed è l'obiettivo principale di questo lavoro.
In questo lavoro, abbiamo progettato e fabbricato un embrione arraying modello di stampa 3D. Un modello di questo arraying è stato progettato per intrappolare embrione di pesce zebra in pozzetti che si adattano con una piastra a 96 pozzetti standard. Anziché selezionare embrioni e li arraying in singoli pozzetti uno per uno, uno potrebbe eseguire matrice e l'allettamento di embrione 96 tutti gli embrioni in una piastra a parete multipla in una sola volta. Utilizzando questo modello e il seguente protocollo, uno potrebbe aumentare significativamente l'efficienza di arraying embrioni in lastre multiparete, che a termine Spinta la capacità di screening almeno dieci volte, rispetto al funzionamento manuale. Il protocollo descritto di seguito include un disegno complessivo per la disposizione di modello, la deposizione delle uova di pesce zebra, raccolta degli embrioni e arraying. La figura 1 Mostra il disegno complessivo del modello arraying. La figura 2 Mostra una panoramica del protocollo dettagliata sull'utilizzo del modello descritto nelle parti 3 e 4.
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Protocol
1. progettazione e fabbricazione di un embrioni di Zebrafish Arraying modello
-
Progettazione del modello di arraying con un 12 di 8, 96 pozzetti layout che si adatta una piastra a 96 pozzetti standard. Uso le dimensioni riportate in Figura 1A per l'alloggiamento di allettamento superiore dell'embrione (Vedi anche il File supplementare).
- Utilizzare le dimensioni riportate in Figura 1B e 1D per l'allettamento bene.
- Utilizzare le dimensioni in Figura 1 per la camera a vuoto inferiore.
- Utilizzare le dimensioni in Figura 1B per l'aria in / presa.
- Utilizzare una stampante 3D (con precisione di 0,1 mm) per stampare il modello; Vedi Tabella materiali per resina consigliata da utilizzare per la stampa.
Nota: le stampanti 3D con una precisione di 0,1 mm sono raccomandate per la fabbricazione del modello arraying (Vedi Tabella materiali). Il colore suggerito per la superficie del modello è grigio scuro o nero.
2. Zebrafish embrione deposizione delle uova
- Posizionare due paia di pesce maschio e femmina per accoppiamento scatola un giorno prima della deposizione delle uova. Separati maschi e femmine da un divisorio in plastica trasparente.
- Togliere i divisori al mattino per mescolare pesce maschio e femmina.
- Togliere il pesce maschio e femmina e raccogliere embrioni di zebrafish usando un colino a maglia fine. Lavare gli embrioni con uovo 250 mL di acqua (Vedi Tabella materiali).
- Trasferire gli embrioni raccolti di Petri (diametro 90 mm) con soluzione di Holtfreter (Vedi Tabella materiali) e rimuovere embrioni morti e non fertilizzati usando uno stereomicroscopio.
- Posizionare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C. A 4 h dopo fertilizzazione (hpf), osservare gli embrioni e rimuovere eventuali embrioni morti e malsane. Gli embrioni sono pronti per il passo successivo.
3. preparazione di Arraying modello
- Lavare il modello 2 – 3 volte con 500 mL di acqua deionizzata e metterlo in forno di essiccazione (45 ° C) per 5 min.
- La camera inferiore con un pezzo di pellicola (Figura 2passaggio 1) di tenuta del nastro.
- Collegare una pompa a vuoto attraverso l'uscita dell'aria nella parte inferiore del modello.
Nota: Il vuoto max consigliato per la pompa del vuoto è 0.1 Mpa. Essere consapevole della forza del vuoto utilizzato. Se la pressione negativa è troppo forte, tagliare un buco a forma di croce sulla pellicola sigillante per abbassare la pressione.
4. arraying embrioni di Zebrafish in una piastra a 96 pozzetti
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, inserire circa 150 embrioni nel modello, come dimostrato nella figura 2,, passo 2.
- Collegare la pompa a vuoto per la presa di aria per generare pressione negativa nell'alloggiamento sigillato con la pellicola sigillante in fase 3.3.
- Agitare l'intero modello orizzontalmente fino a quando ognuno ha anche un embrione intrappolato (Figura 2, passo 3).
Nota: Se soluzione del Holtfreter si prosciuga prima che gli embrioni sono intrappolati in ciascun pozzetto, aggiungere soluzione di ulteriori Holtfreter nella camera di allettamento e ripetere questo passaggio. - Scartare di supplementare Holtfreter soluzione e gli embrioni che non vengono intrappolati nei pozzetti (Figura 2, passaggio 4).
- Spegnere e scollegare la pompa del vuoto.
- Capovolgere una piastra a 96 pozzetti standard contro il modello (Figura 2, Step 5) e ruotare entrambi allo stesso tempo (Figura 2, passaggio 6).
- Toccare il fondo del modello o collegare l'aria presa a una spolverata di gas compresso possibile per trasferire gli embrioni tutti intrappolati dal modello per la piastra a 96 pozzetti (Figura 2, passaggio 6).
- Ripetere il passaggio 4.1 a 4,8 per preparare ulteriori piastre multi-pozzetto.
- Rimuovere la pellicola sigillante e lavare il modello 3 volte da cima a fondo con 500 mL di acqua deionizzata per un utilizzo futuro.
Nota: Non utilizzare solventi organici, come l'etanolo, per pulire il modello.
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Representative Results
La figura 3 Mostra un tipico modello di arraying 3D-stampato. Questo modello utilizza resina fotosensibile come materia prima ed è stata fatta da una stampante 3D; per fornire un migliore contrasto con il colore di embrioni è stato applicato uno strato di vernice nera. La posizione di 96 pozzetti (12 da 8) è stata progettata per adattarsi con una piastra a 96 pozzetti standard. Allo stesso modo, un modello di ben (24 x 16) 384 potrebbe anche essere progettati e fabbricati utilizzando lo stesso metodo. Il lato positivo camera era leggermente più grande di una piastra a 96 pozzetti standard per offrire una migliore vestibilità. Scanalature inoltre sono stati progettati per contenere gli embrioni supplementari durante arraying.
Ad un tasso modesto, 20 piastre potrebbero essere preparati utilizzando il modello arraying 3D-stampato entro 30 min, mentre solo due o tre piastre potrebbero essere preparate manualmente. La tabella 1 Mostra un confronto tra le operazioni manuali, Robotica e arraying modello. La figura 4 Mostra un confronto tra due piatti, uno schierati dal modello 3D-stampato arraying, preparata manualmente. Utilizzando il modello di arraying, c'era una quantità trascurabile di liquido trasferito con gli embrioni, che inoltre ha reso comodo per ulteriori esperimenti di esposizione.
La figura 5 Mostra che non c'erano effetti significativi sullo stato di salute generale degli embrioni dopo essere placcato con metodi manuali e arraying modello. Per assicurarsi che gli embrioni non sono stati colpiti da un tale processo arraying, abbiamo seguito lo sviluppo dell'embrione dopo li arraying in piastre a 96 pozzetti per 3 giorni. Il tasso di schiusa, il tasso di sopravvivenza e il tasso di malformazione degli embrioni di zebrafish a 24, 48 e 72 hpf erano tutti comparabili con gli embrioni schierati manualmente.
Figura 1: disegno di un embrione di zebrafish arraying modello. (A e C) 3-d Max disegno che mostra la panoramica del modello. Sezione trasversale (B) Mostra del modello. (D) una vista parziale del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: passaggi tipici quando si utilizza il modello di arraying. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: fotografie di un modello 3D-stampato di arraying. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini microscopiche di embrioni dopo trasferito alla piastra a 96 pozzetti. (A) immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti schierata dal modello. (B) immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti disposte manualmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: lo stato di salute complessivo degli embrioni dopo essere placcato con metodi modello manuale e arraying. Base alla schiusa, anormale e tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo essere stato placcato utilizzando manuale o i metodi di modello arraying, nessun effetto significativo sulla salute globale degli embrioni sono stato osservato in entrambi i casi. Barre di errore sono deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Manuale | Piattaforma robotica | Arraying Template | |
| Tempo di placcatura | 10 – 30 min/piastra | 5 – 10 min/piastra | 1 – 2 min/piastra |
| Costo | Basso | Alta | Basso |
| Formazione necessaria | Minimo | Alta | Minumum |
| Area di lavoro | Piccolo | Grande | Piccolo |
| Effetto sugli embrioni | Poco o nessuno | Poco o nessuno | Poco o nessuno |
| Quantità di liquido aggiunto per pozzetto | Casuale | 5-10 Μ l | Minimo |
Tabella 1: Confronto delle operazioni modello manuale, Robotica e arraying.
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Discussion
Ci sono due punti critici in questo protocollo che richiedono particolare attenzione per la corretta implementazione del modello di stampa 3D per arraying embrioni di zebrafish.
Il fattore più importante sul design del modello arraying è l'allettamento. Rende sicuro che c'è un solo embrione intrappolato in ciascun pozzetto, uno dovrebbe prestare particolare attenzione per il diametro e la profondità del pozzo allettamento e il diametro del foro passante. Il diametro consigliato è all'interno di 1,5 a 2 volte del diametro di un embrione tipico (tra cui il corion). La profondità dell'allettamento ben dovrebbe essere all'interno di 2 volte del diametro di un embrione tipico (tra cui il corion) per evitare la sovrapposizione degli embrioni nel pozzo stesso. Per evitare gli embrioni schiacciati dalla pressione negativa attraverso il foro, il diametro del foro passante dovrebbe essere a circa la metà del diametro di un embrione tipico (tra cui il corion). A causa della complessità del disegno, tecnologia di stampa 3D è consigliata per la fabbricazione del modello arraying.
L'essenza del modello arraying è di intrappolare singoli embrioni a luoghi designati, cioè le posizioni che si adattano con una piastra a 96 o 384 pozzetti. Per creare una pressione negativa per tenere gli embrioni individuali sul posto senza danneggiarli, uno necessario regolare la pressione negativa generata dal dispositivo vuoto. Troppa pressione può distruggere gli embrioni, mentre troppo poca pressione non può intrappolarli nei pozzetti. Pertanto, si consiglia vivamente di osservare gli embrioni intrappolati nel modello sotto un microscopio stereoscopico prima di trasferirli nelle piastre multipozzetto. Inoltre, durante l'allettamento, gli embrioni potrebbero essere esposti all'aria durante questo processo. In tal caso, aggiungere ulteriori Holtfreter media nella camera di allettamento secondo punto 4.3. Inoltre, a causa della possibilità di embrioni viene esposto all'aria, l'attuale protocollo non funziona sugli embrioni di zebrafish di dechorionated.
Il modello arraying presentato in questo lavoro fornisce un approccio innovativo per la creazione di una piattaforma di screening ad alta resa e a basso costo utilizzando embrioni di zebrafish. Rispetto al precedentemente stabiliti piattaforme robotiche o uno strumento basato su citometria a flusso commercialmente disponibile, questo metodo è facile da usare e non richiede una formazione sofisticati. Vantaggi di assunzione di tecnologia di stampa 3D, uno potrebbe facilmente cambiare il formato del modello arraying per adattarsi a diversi scopi.
Il modello e il protocollo nella sua forma attuale richiedono ancora qualche lavoro manuale. Snellire la procedura potrebbe ulteriormente migliorare il livello di produttività e aumentare la quantità di piastre multipozzetto preparato entro un breve periodo di tempo.
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Disclosures
Gli autori hanno riempito un brevetto sul modello 3D-stampato descritto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma "gioventù 1000plan", i fondi di avvio da Università di Tongji e NSFC Grant # 21607115 e 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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