Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'utilizzo di vasi a forma di O, specializzati per colture in sospensione di aggregati cellulari, con agitazione orbitale. Le cellule HEK293 coltivate in questa borsa formano più aggregati omogenei di quelle coltivate in recipienti di coltura convenzionale.
Abstract
Colture in sospensione di aggregati di cellule di mammifero sono necessari per varie applicazioni in campo medico e biotecnologico. Il metodo basato su sacchetto usa e getta è una delle tecniche più semplici per la produzione di massa di aggregati cellulari, ma non protegge le colture contro eccessiva aggregazione, che si verifica quando si riuniscono in basso al centro della nave cultura. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un piatto O a forma e una borsa a forma di O, nessuno dei quali contiene una regione centrale. Aggregati cresciuti in sia vaso O a forma di cultura erano notevolmente più uniformi nel formato di aggregati cresciuti in navi convenzionali. Le analisi istologiche hanno mostrate che aggrega in piastre di coltura convenzionale contenevano Core necrotici molto probabilmente causati da una scarsa ossigenazione. Al contrario, gli aggregati che sono stati coltivati nel sacchetto O a forma, anche quelli con diametri simili agli aggregati in piastre di coltura convenzionale, non hanno mostrato Core necrotici. Questi risultati indicano che la borsa a forma di O fornisce ossigeno sufficiente agli aggregati a causa della permeabilità all'ossigeno del materiale borsa. Proponiamo, quindi, che questa borsa di romanzo gas-permeabili O a forma cultura è adatta per la produzione di massa di uniforme aggregati che sono necessari in vari campi biotecnologici.
Introduction
Coltura di sospensione cellulare svolge un ruolo importante nella produzione delle cellule per la medicina rigenerativa1 e recombinant della proteina produzione2 perché è facile da scalare e raggiungere cella ad alta densità, a volte fino a più di 107 cellule / mL5. Cellule ovariche di criceto cinese (CHO)3 e rene embrionale umano cellule 293 (HEK293)4 sono state coltivate in coltura in sospensione le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) recentemente sono state coltivate in sistemi di coltura di sospensione per rigenerativa terapie1,6,7. L'uso di colture in sospensione è previsto di aumentare in futuro.
Nella coltura di sospensione, alcune linee cellulari non possono crescere come singole cellule e devono, pertanto, formare aggregati. Ad esempio, hPSCs non può sopravvivere in condizioni di sospensione senza formare aggregati. Tuttavia, questo requisito per la crescita aggregata presenta difficoltà per colture in sospensione uniforme. Una delle difficoltà è la formazione di aggregati uniforme nel periodo in anticipo della cultura, che determina l'efficienza della sospensione cultura8. Un'altra difficoltà è il trasferimento di massa di sostanze nutrienti in aggregati. In particolare, l'apporto di ossigeno limita la dimensione massima degli aggregati, e un povero di ossigeno provoca necrosi al centro di aggregati9. Di conseguenza, colture in sospensione di aggregati cellulari sono più difficili da ottenere che le culture di sospensione convenzionale. Tuttavia, le colture in sospensione sono cruciali per biomedica e applicazioni biotecnologiche.
Vasi di agitazione orbitale sono uno dei più semplici sistemi di coltura di sospensione che ottenere miscele di terreno di coltura senza agitazione girante. Sollecitazione di taglio dalla girante e il flusso medio dinamico è il problema principale della cultura di sospensione perché provoca danno delle cellule e differenziazione. Per raggiungere agitazione con una sollecitazione di taglio inferiore, i ricercatori e le industrie hanno sviluppato una varietà di agitazione orbitale nave sistemi2,10.
Tuttavia, recipienti di coltura convenzionale non sono progettati per culture di agitazione orbitale. In orbital agitazione vasi, cellule gravitano verso il centro-fondo dei vasi da un tipo di flusso medio, noto come il "paradosso di foglia di tè di Einstein"11, che causa l'aggregazione non omogeneo delle cellule. Il flusso circolare, causato da una forza centrifuga e un attrito tra il terreno di coltura e di una nave, spazza le cellule nel centro11,12. Inoltre, borse di coltura convenzionale per la cultura di massa sono di forma quadrata, che non è adatto per agitazione orbitale.
In questo studio, abbiamo sviluppato un sacchetto di cultura romanzo adatto a culture di agitazione orbitale. La novità di questa borsa è la sua forma O che non ha una regione di centro, quindi cellule vengono impedite il raduno presso l'area di centro inferiore. Abbiamo anche dimostrato la manipolazione di questi vasi con una cultura HEK293 a dimostrare la possibilità di questi sacchetti per applicazioni biotecnologiche.
Protocol
1. preparazione delle cellule e dei materiali
- Coltivare cellule HEK293 in mezzo di Eagle modificata di Dulbecco con un 10% di siero bovino fetale (FBS) e gli aminoacidi non essenziali di 1%. Regolare il pH del terreno di coltura a 6,8-7.6.
- Dopo la coltura per 5 a 7 d, dissociare le cellule con una soluzione di acido etilendiamminotetracetico tripsina 0,25% (tripsina-EDTA) e reinizializzare le cellule a 5.000-10.000 cellule/cm2.
2. le cellule in un sacchetto O a forma di semina
- Dissociare le cellule come descritto al punto 1.2 e li risospendere in 2-5 mL di terreno di coltura.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella (40 µm) per raccogliere una sospensione unicellulare.
- Contare il numero di celle di macchiatura blu di trypan e contatore di cellule automatico e quindi preparare 20 mL della sospensione delle cellule (2.0 x 105 cellule/mL).
- Collegare l'ingresso del sacchetto (Figura 1a) O a forma di una siringa da 50 mL bloccato senza uno stantuffo.
Figura 1: immagini schematiche e immagini dei vasi a forma di O. (a1) Si tratta di un'immagine schematica di un sacchetto a forma di O. (a2) Questa è una foto di una borsa a forma di O. (b1) Si tratta di un'immagine schematica di un piatto O a forma. (b2) Questa è una foto di un piatto O a forma. Il diametro interno ed esterno del sacchetto O a forma di sono 90 mm e 20 mm, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Dispensare la sospensione cellulare preparato nel sacchetto a forma di O attraverso la siringa bloccata.
- Sostituire la prima siringa bloccata con una siringa pulita. Aggiungere 55 mL di aria pulita attraverso la siringa pulita per espandere il sacchetto completamente.
- Fissare il tubo di aspirazione e quindi chiudere l'ingresso. Infine, rimuovere la pinza dal tubo.
- Incubare le cellule nella borsa O a forma agitando loro a 45 giri in condizioni di 37 ° C e 5% CO2.
3. medium cambiamento (opzionale)
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta 50 mL attraverso l'ingresso.
- E centrifugare per 2 min a 200 x g a temperatura ambiente e poi aspirare il supernatante.
- Aggiungere 20 mL di terreno di coltura e risospendere le cellule.
- Aggiungere le cellule sedimento la borsa a forma di O dai seguenti passaggi 2.4-2.7.
- Incubare le cellule nella borsa O a forma agitando loro a 45 giri in condizioni di 37 ° C e 5% CO2.
4. raccolta delle cellule dal sacchetto
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta 50 mL attraverso l'ingresso.
- Lavare l'interno del sacchetto con 20 mL di tampone fosfato di calcio/magnesio-free salina [PBS(-), pH = 7,4-7,6] e quindi svuotare il contenuto in una provetta per raccogliere le cellule rimanenti dal sacchetto.
- Centrifugare la sospensione cellulare raccolti per 3 min a 200 x g e a temperatura ambiente e poi aspirare il supernatante.
- Aggiungere 10 mL di PBS(-) e lavare gli aggregati.
- Li Centrifugare per 3 min a 200 x g e a temperatura ambiente e quindi aspirare il surnatante per raccogliere gli aggregati.
- Aggiungere 4 mL di PBS e 1 mL di tripsina e incubare li con gli aggregati per 10 min a 37 ° C per dissociare le cellule per il conteggio (opzionale).
5. preparazione di un piatto O a forma (opzionale)
Nota: Vedere Figura 1b per un'immagine schematica del piatto O a forma.
- Tagliare il fondo di un piatto di 60 mm o 35 mm con un coltello caldo e utilizzarlo come un piatto interno.
- Mettete la teglia di 60 mm a testa in giù al centro di un piatto di 100 mm.
Nota: Un foglio di guida può aiutare a decidere la posizione del piatto 60 mm. - Se necessario, mettere cicloesanone viscosità-regolata sul commissure dall'interno del piatto di 60 mm.
- Asciugare il piatto O a forma per un paio di giorni e sterilizzarlo di gas di ossido di etilene o gamma ray.
Representative Results
Secondo le nostre misurazioni, aggregati cresciuti nel piatto convenzionale avevano variato diametri dopo 5D di agitazione orbitale. Al contrario, aggregati cresciuti nei vasi a forma di O per 5D ha avuto molto più uniformi diametri. La cultura di piatto convenzionale ha mostrato piccoli aggregati (50-200 µm), mentre le culture nei vasi a forma di O non contiene alcun piccoli aggregati (Figura 2a). Secondo la misura della dimensione basata su immagine, la cultura di piatto convenzionale ha mostrato due picchi diversi (Figura 2b1), che indica un'ampia deviazione della dimensione aggregata. Questo risultato implica che aggregati nel piatto convenzionale crescevano in due condizioni diverse in una stessa cultura, che potrebbe tradursi in qualità eterogenea delle cellule. D'altra parte, aggregati in vasi a forma di O ha mostrati un singolo picco e meno deviazione di diametro rispetto a quelli nel piatto convenzionale (Figura 2b2 e 2b3), suggerendo che tali aggregati possono essere di qualità più uniforme.
Figura 2: morfologie e diametri di aggregati cresciuti in vari vasi. Questi pannelli mostrano (un) immagini di campo chiaro e (b) gli istogrammi di aggregati cresciuti in (a1 e b1) in un convenzionale piatto, (a2 e b2) un O-a forma di piatto, o (a3 e b3) un sacchetto a forma di O. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ematossilina ed eosina di sezioni trasversali di aggregazione ha mostrato che aggregati cresciuti nel piatto convenzionale avevano alcune cellule denucleated e Core necrotici (Figura 3a). Tuttavia, aggregati coltivati in vasi O a forma non hanno mostrato alcun Core necrotici (Figura 3b e 3C). In particolare, aggregati cresciuti nella borsa O a forma erano grandi come quelli nel piatto convenzionale ancora non hanno avuto alcun Core necrotici (Figura 3C). Questi risultati hanno indicato che la borsa gas-permeabili fornito abbastanza ossigeno per la cultura.
Figura 3: sezioni trasversali degli aggregati in vari vasi. Le sezioni trasversali di spessore 12 µm e sono state preparate da campioni congelati. Le sezioni sono state macchiate con ematossilina ed eosina per visualizzare le celle. (un) la cella aggregati cresciuti in una cultura di sospensione convenzionale ha mostrato Core necrotici. Aggregati di cellule coltivati in entrambi (b) in un piatto O a forma o (c), una borsa a forma di O ha mostrato la necrosi molto poco nei loro nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I conteggi delle cellule ha mostrato che più dell'85% delle cellule è sopravvissuto per 5D della coltura di sospensione in ciascun recipiente (Figura 4a). La densità di cella finale era di circa 1,5-2,0 x 106 cellule/mL. Anche se non c'era differenza significativa, il rapporto di crescita nella borsa O a forma era superiore rispetto a quelli in altri vasi (Figura 4b). I tassi di crescita specifici delle celle nel piatto convenzionale, il piatto O a forma e la borsa a forma di O tra 2 e giorno 5 erano 0,018, 0.025 e 0,020 h-1, rispettivamente.
Figura 4: redditività e crescita delle cellule. Questi pannelli mostrano il (un) cellula attuabilità e (b) cella densità di cellule HEK293 in vari recipienti di coltura dopo 2 d della cultura (giorno 2) e 5D della cultura (giorno 5). I valori indicati rappresentano la media dei risultati da 3 esperimenti indipendenti. I valori per ogni esperimento sono stati calcolati da trypan blu-macchiato le cellule contate con un contatore di cellule automatico. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: distribuzione in 2 formati di piatto diverso in varie condizioni di agitazione del branello. Questo pannello mostra la distribuzione della perla durante varie condizioni di agitazione (30, 40 e 45 giri) in un piatto convenzionale e a forma di O. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato O a forma di vasi ed abbiamo effettuato una cultura di sospensione HEK293 in loro per una formazione di aggregati uniforme e l'espansione. Nella piastra di coltura convenzionale, un orbitale scuotendo la cultura ha prodotto due diversi diametri degli aggregati, mentre abbiamo osservato uniformi aggregati nei vasi a forma di O (Figura 1). Secondo l'osservazione della distribuzione dei branelli macchiati negli Stati di agitazione orbitale, perline si riuniscono nella parte centro-inferiore di una piastra di coltura convenzionale. Quel raduno presumibilmente causato la differenza di densità delle cellule che conducono a vari formati di aggregati. In alternativa, branelli sono stati distribuiti nel piatto O a forma che non dispone della regione centro-inferiore (Supplemental figura 1). Questa distribuzione provoca probabilmente gli aggregati di dimensioni medie in modo uniforme nei vasi a forma di O. Un altro — ampiamente usato — approccio alla produzione di aggregati uniformi è la coltura in micropozzetti, ma questo approccio ha alcuni problemi, come ad esempio nella fornitura di un terreno di coltura senza aggregati abbandonano i micropozzetti13. Nel caso di navi O a forma, uniformi aggregati possono essere prodotti in una cultura di sospensione semplice.
L'orbitale scuotendo la cultura è un sistema di cultura popolare utilizzato per cellule di mammifero. Ci sono vari metodi di coltura per la produzione di massa di cellule di mammifero, come il serbatoio agitata bioreattore14, onda-cenno borse15e bottiglie di rotazione. Culture di agitazione orbitale non includono una ventola interna per mescolare il mezzo, a differenza del serbatoio agitato non bioreattore. Questa funzionalità è simile all'onda-cenno borse e bottiglie rotanti. Questi sistemi di coltura privo di girante possono evitare il danno cellulare dalla forza di taglio che circondano le giranti e realizzare bassa sollecitazione di taglio nella coltura di sospensione. In particolare, sistemi di coltura di agitazione orbitale sono efficaci per la produzione di massa di cellule sensibili quali le cellule dei mammiferi a causa della loro elevata scalabilità e basso shear stress.
O a forma di vasi possono migliorare il problema rimanente di agitazione orbitale cultura nella formazione degli aggregati. In orbital agitazione sistemi di coltura, galleggiante cellule migrano verso il centro e la parte inferiore della nave, che è conosciuta come il "paradosso di foglia di tè di Einstein"11. Questa migrazione provoca l'aggregazione non omogeneo e produzione aggregata non uniforme in convenzionale orbitale scuotendo le navi. In questo studio, vasi a forma di O ha impedito la concentrazione delle cellule nella parte centro-inferiore dei vasi, che è speculata come motivo di aggregazione uniforme nei vasi O a forma d'agitazione orbitale.
Le analisi istologiche hanno mostrato che gli aggregati nel piatto convenzionale ha contenuto le cellule denucleated (Figura 2a). Al contrario, le cellule denucleated non sembrava degli aggregati da vasi a forma di O (Figura 2b e 2C). È possibile che queste cellule denucleated sono state causate da una carenza di substrati quali glucosio, glutamina e ossigeno9. Secondo la misura della dimensione, aggregati nei vasi a forma di O avevano omogenei diametri inferiori a 400 µm. Al contrario, in un piatto convenzionale, alcuni aggregati avevano un diametro superiore a 400 µm, e questi aggregati compreso le cellule denucleated. Questo risultato suggerisce che la creazione di aggregati di dimensioni omogenee nei vasi a forma di O è efficace nel controllare la qualità degli aggregati. Inoltre, si ipotizza anche che l'ossigenazione attraverso il film di polietilene gas-permeabili ostacolava la comparsa di cellule denucleated nella borsa a forma di O.
Questi esperimenti hanno indicato la possibilità di questi vasi a forma di O come un semplice sistema per la produzione di aggregati uniformi. Anche se altri sacchetti di cultura per la coltura di sospensione sono stati sviluppati15, il quelle borse di cultura sono di forma quadrata, il che impedisce di ottenere efficacemente misto in agitazione orbitale la cultura. La borsa in questo studio ha un romanzo adatto di agitazione orbitale per produrre aggregati con una dimensione omogenea di forma rotonda. Questa caratteristica dei vasi è importante per controllare le condizioni e l'elevata riproducibilità delle cellule nella produzione di massa. L'eventuale applicazione della nave O a forma è molto diffusa. Può essere utilizzato durante la produzione di proteine ricombinanti da cellule e per la medicina rigenerativa quando si tratta di cellule staminali.
In conclusione, abbiamo sviluppato un romanzo O a forma borsa adatta per la produzione di aggregati cellulari uniforme con una cultura di agitazione orbitale. La borsa Mostra possibilità per varie applicazioni biomedicali come nella medicina rigenerativa.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è sostenuta da una collaborazione con Yoshida Takao FUKOKU, Co., Ltd. da FUKOKU, Co., Ltd. fornito l'idea della borsa a forma di O cultura. Takamasa Sato da FUKOKU, Co., Ltd. supportato questa ricerca in termini di una simulazione computazionale per lo sviluppo della borsa a forma di O cultura. Ci piacerebbe apprezzare affiliazione corrente dell'autore corrispondente, Università di Osaka, per averci permesso di lavorare sulla pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
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