Summary
Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van O-vormige vaartuigen, gespecialiseerd schorsing culturen van cellulaire aggregaten, met orbitale schudden. De HEK293 cellen gekweekt in deze tas vormen meer homogene aggregaten dan die gekweekt in een conventionele kweekvat.
Abstract
Schorsing culturen van zoogdiercellen aggregaten zijn vereist voor diverse toepassingen in de medische en biotechnologische velden. De wegwerp zak gebaseerde methode is een van de eenvoudigste technieken voor de massaproductie van cellulaire aggregaten, maar het beschermt niet de culturen tegen overmatige aggregatie, die optreedt wanneer ze in het midden van de bodem van het vaartuig van de cultuur verzamelen. U kunt dit probleem oplossen, ontwikkelden we een O-vormige schotel en een O-vormige zak, die geen van beide een regio Midden bevat. Aggregaten geteeld in een O-vormige cultuur schip waren merkbaar meer uniform in grootte dan aggregaten gegroeid in conventionele schepen. Histologische analyses bleek dat aggregaten in conventionele cultuur gerechten opgenomen necrotische kernen waarschijnlijk veroorzaakt door een slechte zuurstofvoorziening. Aggregaten die zijn geteeld in de O-vormige zak, zelfs degenen met soortgelijke diameters te aggregaten in conventionele cultuur gerechten, bleek daarentegen niet necrotisch kernen. Deze resultaten suggereren dat de O-vormige tas voldoende zuurstof naar de aggregaten als gevolg van de permeabiliteit van de zuurstof van de zak-materiaal biedt. Wij Stel, dat deze roman gas-permeabele O-vormige cultuur tas is geschikt voor de massaproductie van uniforme aggregaten die noodzakelijk in verschillende biotechnologische velden zijn.
Introduction
De cultuur van de cel van de schorsing speelt een belangrijke rol bij de celproductie voor regeneratieve geneeskunde1 en recombinant eiwit productie2 omdat het gemakkelijk aan schaal omhoog en het bereiken van hoge cel dichtheden, soms tot meer dan 107 cellen / mL5. Chinese hamster ovary (CHO) cellen3 menselijke embryonale nier cellen 293 (HEK293)4 zijn geteeld in schorsing cultuur en menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), onlangs is gegroeid in cultuur ophangingssystemen voor regeneratieve therapieën1,6,7. Het gebruik van schorsing culturen naar verwachting toenemen in de toekomst.
In schorsing cultuur, sommige cellijnen als afzonderlijke cellen niet groeien en moeten daarom aggregaten vormen. Bijvoorbeeld, kan niet hPSCs overleven in schorsing voorwaarden zonder vorming van aggregaten. Deze eis voor geaggregeerde groei kampt echter met moeilijkheden voor uniforme schorsing culturen. Één moeilijkheid is de vorming van uniforme aggregaten in de vroege periode van de cultuur, die bepalend is voor de efficiëntie van de schorsing cultuur8. Een ander probleem is de massale omzetting van voedingsstoffen in aggregaten. In het bijzonder de zuurstoftoevoer beperkt de maximale grootte van aggregaten, en een slechte zuurstoftoevoer veroorzaakt necrose in het midden van aggregaten9. Schorsing culturen van cel aggregaten zijn dus moeilijker te verkrijgen dan conventionele vering culturen. Schorsing culturen zijn echter cruciaal voor biomedische en biotechnologische toepassingen.
Orbitale schudden vaartuigen zijn een van de eenvoudigste cultuur ophangsystemen die kweekmedium mengsels zonder waaier agitatie bereiken. Shear stress van de waaier en de dynamische volumestroom medium is het grote probleem van schorsing cultuur, omdat het veroorzaakt celbeschadiging en differentiatie. Om te bereiken met een lagere schuifspanning agitatie, hebben onderzoekers en industrie ontwikkeld een scala aan orbitale schudden vaartuig systemen2,10.
Conventionele kweekvat zijn echter niet bedoeld voor orbital schudden van culturen. In orbital schudden van vaartuigen, neigen cellen naar midden-onder van de vaartuigen van een soort volumestroom medium bekend als de "Einsteins thee blad paradox"11, waardoor de inhomogene samenvoeging van cellen. De kringvormige stroom, veroorzaakt door een middelpuntvliedende kracht en een wrijving tussen het kweekmedium en een schip, veegt cellen in het centrum11,12. Daarnaast zijn conventionele cultuur zakken voor massacultuur vierkant-vormige, die is niet geschikt voor orbitale schudden.
In deze studie ontwikkelden we een nieuwe cultuur tas geschikt voor orbital schudden van culturen. De nieuwigheid van deze tas is de O-vorm die niet een center regio, hoeft zodat de cellen verzamelen aan de onderkant center regio wordt verhinderd. We hebben ook aangetoond dat de behandeling van deze schepen met een HEK293 cultuur laten zien van de mogelijkheid van deze zakken voor biotechnologische toepassingen.
Protocol
1. voorbereiding van de cellen en materialen
- Cultiveren van HEK293 cellen in Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium met een 10% foetale runderserum (FBS) en 1% niet-essentiële aminozuren. Breng de pH van het kweekmedium aan 6,8-7.6.
- Na het kweken voor 5 tot en met 7 d, distantiëren van de cellen met een zure oplossing van 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra (trypsine-EDTA) en de cellen op 5.000-10.000 cellen/cm2reseed.
2. het zaaien van de cellen in een O-vormige zak
- Distantiëren van de cellen, zoals beschreven in stap 1,2 en resuspendeer hen in 2-5 mL gestolde voedingsbodem.
- Filtreer de celsuspensie door een zeef van de cel (40 µm) voor het verzamelen van de schorsing van een enkele cel.
- Het aantal cellen tellen met trypan blauw kleuring en automatische cel teller en vervolgens 20 mL van de celsuspensie (2.0 x 105 cellen/mL) worden bereid.
- De inlaat van de O-vormige zak (Figuur 1a) verbinden met een geklemd 50 mL injectiespuit zonder een zuiger.
Figuur 1: schematische afbeeldingen en foto's van O-vormige vaartuigen. (a1) Dit is een schematische afbeelding van een O-vormige tas. (a2) Dit is een foto van een O-vormige tas. (b1) Dit is een schematische afbeelding van een O-vormige schotel. (b2) Dit is een foto van een O-vormige schotel. De diameter van het buitenste en binnenste van de O-vormige zak zijn 90 mm en 20 mm, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Pipetteer de bereid celsuspensie in de O-vormige zak via de geklemd spuit.
- Vervang de eerste geklemd spuit met een schone injectiespuit. Voeg 55 mL schone lucht door middel van de schone injectiespuit op de zak volledig uit te breiden.
- Klem de inlaat buis en sluit vervolgens de inlaat. Ten slotte Verwijder de klem van de buis.
- Incubeer de cellen in de zak O-vormige door hen schudden bij 45 rpm in omstandigheden van 37 ° C en 5% CO2.
3. middelgrote verandering (optioneel)
- Breng de celsuspensie in een tube van 50 mL de instroomopening passeren.
- Centrifugeer het gedurende 2 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur, en vervolgens het supernatant gecombineerd.
- Voeg 20 mL gestolde voedingsbodem en resuspendeer de cellen.
- De geresuspendeerde cellen toevoegen aan de tas van O-vormige door volgende stappen 2.4-2.7.
- Incubeer de cellen in de zak O-vormige door hen schudden bij 45 rpm in omstandigheden van 37 ° C en 5% CO2.
4. het verzamelen van de cellen uit de zak
- Breng de celsuspensie in een tube van 50 mL de instroomopening passeren.
- De binnenkant van de zak met 20 mL van de calcium/magnesium-gratis fosfaatgebufferde zoutoplossing wassen [PBS(-), pH = 7.4-7,6] en vervolgens de afvoer van de inhoud in een buis voor het verzamelen van de resterende cellen uit de zak.
- Centrifugeer de verzamelde celsuspensie gedurende 3 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur, en vervolgens het supernatant gecombineerd.
- Voeg 10 mL van PBS(-) en wassen van de aggregaten.
- Centrifugeer ze gedurende 3 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur, en vervolgens gecombineerd het supernatant voor het verzamelen van de aggregaten.
- Voeg 4 mL PBS en 1 mL trypsine en hen met de aggregaten gedurende 10 minuten bij 37 ° C te distantiëren van de cellen voor het tellen van (optioneel) uit te broeden.
5. bereiding van een O-vormige schotel (optioneel)
Opmerking: Zie Figuur 1b voor een schematische afbeelding van de O-vormige schotel.
- De bodem van een schotel van 60 mm of 35 mm met een warme mes uitgesneden en gebruiken als een innerlijke schotel.
- Zet de schotel van 60 mm ondersteboven op het midden van een schotel van 100 mm.
Opmerking: Een gids blad kan helpen om te beslissen de positie van de schotel van 60 mm. - Indien nodig zetten viscositeit-aangepast cyclohexanon de commissuur vanaf de binnenkant van de schotel van 60 mm.
- Droog de O-vormige schotel voor een paar dagen en het steriliseren in gamma ray of ethyleen oxide gas.
Representative Results
Volgens onze metingen had aggregaten geteeld in de conventionele schotel diameters gevarieerd na 5 d van de orbitale schudden. Daarentegen had aggregaten gegroeid in O-vormige vaartuigen voor 5 d veel meer uniforme diameters. De cultuur van de conventionele schotel toonde kleine aggregaten (50-200 µm), overwegende dat de culturen in de O-vormige vaartuigen niet alle kleine aggregaten (Figuur 2a bevatte). Volgens de grootte van het beeld-gebaseerde meting toonde de conventionele schotel cultuur twee verschillende bergtoppen (figuur 2b1), die een breed afwijking van totale omvang aangeeft. Dit resultaat impliciet dat aggregaten in de conventionele schotel groeiden onder twee verschillende omstandigheden in de dezelfde cultuur, die in heterogene cel kwaliteit resulteren kan. Aan de andere kant, suggereren aggregaten in O-vormige vaartuigen toonde een één piek en minder afwijking in diameter dan die in de conventionele schotel (Figuur 2b2 en 2b3), dat dergelijke aggregaten van meer uniforme kwaliteit kunnen zijn.
Figuur 2: Morphologies en diameters van aggregaten gegroeid in verschillende vaartuigen. Deze panelen tonen (een) helderveld beelden en (b) histogrammen van aggregaten gegroeid in ofwel (a1 en b1) een conventionele schotel (a2 en b2) een O-vormige schotel, of (a3 en b3) een O-vormige zak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Haematoxyline en eosine kleuring van statistische dwarsdoorsneden bleek dat aggregaten geteeld in de conventionele schotel had wat denucleated cellen en necrotische kernen (Figuur 3a). Aggregaten gegroeid in O-vormige vaartuigen bleek echter niet alle necrotische kernen (Figuur 3b en 3 c). In het bijzonder aggregaten gegroeid in de O-vormige zak waren zo groot als die van de conventionele schotel maar heb niet alle necrotische kernen (Figuur 3 c). Deze resultaten voorgesteld dat de gas-permeabele zak voldoende zuurstof naar de cultuur kopen.
Figuur 3: dwarsdoorsneden van aggregaten in verschillende vaartuigen. De dwarsdoorsneden 12 µm dik zijn en waren bereid uit bevroren monsters. De secties zijn gekleurd met haematoxyline en eosine te visualiseren van de cellen. (een) de cel aggregaten gekweekt in een conventionele vering cultuur toonde necrotische kernen. Cel aggregaten gegroeid in ofwel (b) een O-vormige schotel of (c) een O-vormige zak toonde weinig necrose in hun kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Cellen toonde aan dat meer dan 85% van de cellen overleefd voor 5 d van schorsing cultuur in elk vaartuig (figuur 4a). De definitieve celdichtheid was ongeveer 1,5-2,0 x 106 cellen/mL. Hoewel er geen significant verschil was, was de verhouding van de groei in de tas van O-vormige hoger liggen dan die in andere vaartuigen (figuur 4b). De specifieke groeisnelheden van de cellen in de conventionele schotel, de O-vormige schotel en de O-vormige zak tussen dag 2 en dag 5 waren 0.018, 0,025 en 0.020 h-1, respectievelijk.
Figuur 4: cel levensvatbaarheid en groei. Deze panelen de (een) cel levensvatbaarheid en (b) celdichtheid van HEK293 cellen in verschillende kweekvat weergeven na 2 d van cultuur (dag 2) en 5 d van cultuur (dag 5). De aangegeven waarden vertegenwoordigen de gemiddelde van de resultaten uit 3 onafhankelijke experimenten. De waarden voor elk experiment werden berekend op basis van trypan blauw-gekleurde cellen geteld met een automatische cel teller. De foutbalken geven standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: verdeling in 2 verschillende schotel formaten in verschillende schudden omstandigheden Bead. Dit paneel toont de verdeling van de kraal tijdens verschillende schudden voorwaarden (30, 40 en 45 rpm) in een conventionele en O-vormige schotel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
In deze studie, wij ontwikkeld O-vormige vaartuigen en een cultuur van de schorsing HEK293 uitgevoerd in hen voor een uniforme aggregaten vorming en de uitbreiding. In de conventionele cultuur schotel produceerde een orbitaal schudden cultuur twee verschillende diameters van aggregaten, overwegende dat we uniforme aggregaten in de O-vormige vaartuigen (Figuur 1 waargenomen). Volgens de waarneming van de verdeling van gekleurde parels in de orbitale schudden voorwaarden verzamelen kralen in de Midden-bodem van een schotel van conventionele cultuur. Dat het verzamelen vermoedelijk veroorzaakt het verschil in celdichtheid leiden tot verschillende groottes van aggregaten. U kunt ook werden kralen verspreid in de O-vormige schotel die niet bij de regio Midden-onder (aanvullende figuur 1). Deze verdeling waarschijnlijk zorgt ervoor dat de aggregaten gelijkmatig-en kleinbedrijf in O-vormige vaartuigen. Een ander — gebruikte — benadering op het produceren van uniforme aggregaten is het kweken in microwells, maar deze aanpak heeft een aantal problemen, zoals bij het verstrekken van een kweekmedium zonder aggregaten te laten vallen uit de microwells13. In het geval van O-vormige vaartuigen, kunnen uniforme aggregaten worden geproduceerd in een eenvoudige schorsing cultuur.
De orbital schudden van cultuur is een populaire cultuur-systeem gebruikt voor zoogdiercellen. Er zijn verschillende methoden van de cultuur voor de massaproductie van cellen van zoogdieren, zoals de stirred tank bioreactor14, Golf-wees zakken15, en roterende flessen. Orbitale schudden culturen hebben geen een innerlijke waaier voor het roeren van het medium, in tegenstelling tot de stirred tank bioreactor doet. Deze functie is vergelijkbaar met de Golf-wees zakken en roterende flessen. Deze waaier-vrije cultuur-systemen kunnen voorkomen van cellulaire schade als gevolg van de shear kracht rond de waaiers en realiseren van lage shear stress in schorsing cultuur. Orbitale schudden cultuur systemen zijn met name effectief voor de massaproductie van gevoelige cellen zoals de cellen van zoogdieren vanwege hun hoge schaalbaarheid en lage schuifspanning.
O-vormige vaartuigen kunnen verbeteren het resterende probleem van de orbitale schudden cultuur bij de vorming van aggregaten. In orbital schudden cultuur systemen, migreren zwevende cellen naar het centrum en de onderkant van het vaartuig, die bekend als de "Einsteins thee blad paradox"11 staat. Deze migratie zorgt ervoor dat de inhomogene aggregatie en niet-uniforme statistische productie in conventionele orbital schudden van vaartuigen. In deze studie voorkomen O-vormige vaartuigen de concentratie van cellen in de centrum-onderkant van de vaartuigen, die als de reden van uniforme aggregatie in orbitale schudden O-vormige vaartuigen wordt gespeculeerd.
Histologische analyses bleek dat de aggregaten in de conventionele schotel denucleated cellen (Figuur 2a bevatte). In tegenstelling, denucleated cellen niet was opgenomen in de aggregaten van O-vormige vaartuigen (Figuur 2b en 2 c). Het is mogelijk dat deze denucleated cellen werden veroorzaakt door een tekort aan substraten zoals zuurstof, glucose en glutamine9. Volgens de meting van grootte had aggregaten in de O-vormige vaartuigen homogene diameter lager dan 400 µm. In tegenstelling, in een conventionele schotel, sommige aggregaten had een diameter die groter is dan 400 µm, en deze aggregaten opgenomen denucleated cellen. Dit resultaat wijst erop dat het creëren van homogene middelgrote aggregaten in O-vormige vaartuigen effectief in het controleren van de kwaliteit van de aggregaten. Het is daarnaast ook gespeculeerd dat de oxygenatie door middel van de gas-permeabele polyethyleenfilm het uiterlijk van denucleated cellen in de zak O-vormige voorkomen.
Deze experimenten toonde de mogelijkheid om van deze O-vormige schepen als een eenvoudig systeem voor het opstellen van uniforme aggregaten. Hoewel andere "cultuur" tassen voor schorsing cultuur ontwikkelde15 geweest, zijn die cultuur tassen vierkant-vormige, waardoor de cultuur niet effectief krijgen gemengd in het orbitale schudden. De zak in deze studie heeft een ronde vorm geschikt voor orbitale schudden om te produceren aggregaten met een homogene grootte roman. Dit kenmerk van vaartuigen is belangrijk voor de controle op de voorwaarden en de hoge reproduceerbaarheid van cellen in massaproductie. De eventuele toepassing van het schip O-vormige is wijdverbreid. Het kan worden gebruikt bij de productie van recombinante eiwitten uit cellen en voor regeneratieve geneeskunde bij de behandeling van stamcellen.
Kortom, ontwikkelden we een roman O-vormige tas geschikt voor het produceren van uniforme cel aggregaten met een orbitale schudden cultuur. De zak toont mogelijkheden voor verschillende biomedische applicaties zoals in regeneratieve geneeskunde.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door een samenwerking met FUKOKU, CO., Ltd. Takao Yoshida van FUKOKU, CO., Ltd., verstrekt het idee van de tas van O-vormige cultuur. Takamasa Sato uit FUKOKU, CO., Ltd. ondersteund dit onderzoek in termen van een computationele simulatie voor de ontwikkeling van de tas van O-vormige cultuur. Wij zouden willen waarderen van de auteur van de overeenkomstige huidige aansluiting, Universiteit van Osaka, voor het toestaan van ons om te werken aan de publicatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
