Summary
Здесь мы представляем протокол для использования O-образный судов, специализированная подвеска культур клеточных агрегатов, с орбитальной встряхивания. HEK293 клеток, выращиваемых в этой сумке формируют более однородной агрегатов, чем те, которые выращиваются в обычных культуры судов.
Abstract
Подвеска культуры mammalian клетки агрегатов необходимы для различных применений в областях медицины и биотехнологий. Одноразовые метод, основанный на мешок является одним из простейших методов для массового производства клеточных агрегатов, но он не защищает культур против чрезмерного агрегирования, который происходит, когда они собираются в центре нижней части культуры судна. Для решения этой проблемы, мы разработали O-образный блюдо и O-образный мешок, ни один из которых содержит центрального региона. Агрегаты, выращенных в сосуде или O-образный культуры были заметно более однородными по размеру, чем агрегатов, выращенных в обычных судов. Гистологический анализ показал, что агрегаты в обычных культуры блюда содержали некротические ядер, наиболее вероятная причина бедных кислородом. В противоположность этому агрегатов, которые были выращены в O-образный мешок, даже те, с аналогичными диаметрами до агрегатов в обычных культуры блюда, не показывать некротические ядер. Эти результаты показывают, что O-образный мешок обеспечивает достаточно кислорода для агрегатов из-за проницаемости кислорода мешок материала. Мы, таким образом, предложить, что этот роман газопроницаемой O-образный культуры мешок подходит для массового производства единообразных агрегатов, которые необходимы в различных областях биотехнологии.
Introduction
Подвеска клеточной культуры играет важную роль в производстве ячейки для регенеративной медицины1 и рекомбинантных белков производства2 , потому что это легко масштабировать и достижения высоких клеток плотности, иногда до более чем 107 клеток / 5мл. Клеток яичника китайского хомяка (Чо)3 (HEK293)4 клеток человеческого эмбриона почек 293 выросли в культуре подвеска, и недавно человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) выросли в культуре подвески для регенерации терапия1,6,7. Использование подвеска культур, как ожидается, возрастет в будущем.
В культуре подвеска некоторые клеточные линии не растут как отдельные клетки и должны таким образом, форма агрегатов. К примеру hPSCs не может выжить в условиях подвески без формирования агрегатов. Однако это требование для агрегированных роста представляет трудности для единообразного подвеска культур. Одной из трудностей является формирование единой агрегатов в ранний период культуры, которая определяет эффективность подвеска культуры8. Другая трудность заключается в массообмена питательных веществ в агрегаты. В частности поступление кислорода ограничивает максимальный размер агрегатов, и бедных кислородом вызывает некроз в центре агрегаты9. Следовательно подвеска культур клеток агрегатов являются более трудно получить, чем обычные подвеска культур. Тем не менее, подвеска культур имеют решающее значение для биомедицинских и применения биотехнологии.
Орбитальная пожимая судов являются одним из простейших систем подвески культуры, обеспечивающие смеси питательной среды без крыльчатка агитации. Касательное напряжение с колесом и динамический средний поток является основной проблемой подвеска культуры потому, что это вызывает повреждение клеток и дифференциации. Для достижения агитации с ниже касательное напряжение, исследователей и промышленности разработали целый ряд орбитальных пожимая судно систем2,10.
Однако обычные культуры судов не предназначены для орбитального пожимая культур. В орбитальный пожимая судов клетки тяготеют к в центре нижней части судов по типу среднего потока, известный как «Эйнштейна чая листья парадокс»11, который вызывает неоднородного агрегации клеток. Круговой потока, вызванные центробежной силы и трения между питательной среды и судно, зачисток клеток в центре11,12. Кроме того традиционные культуры мешки для массовой культуры, квадратной формы, которая не подходит для орбитальных встряхивания.
В этом исследовании мы разработали Роман культуры мешок для орбитального пожимая культур. Новизна этой сумке является его O-форма, которая не имеет центр региона, поэтому клетки лишены возможности сбора в регионе центра нижней. Мы также продемонстрировали обработке этих судов с HEK293 культурой продемонстрировать возможности этих сумок для биотехнологии.
Protocol
1. Подготовка клетки и материалов
- Культивируйте клетки HEK293 в Дульбекко изменение среднего орла с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% несущественные аминокислот. Отрегулируйте pH питательной среды на 6,8-7,6.
- После культивирования для 5-7 d, разбить ячейки с 0,25% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота раствор (трипсин ЭДТА) и повторное заполнение ячеек на 5000-10 000 клеток/см2.
2. Заполнение ячеек в O-образный мешок
- Разбить ячейки, как описано в шаге 1.2 и Ресуспензируйте их в 2-5 мл питательной среды.
- Фильтр суспензию клеток через стрейнер клетки (40 мкм) для сбора подвеска одну ячейку.
- Подсчитать количество ячеек Трипановый синий окрашивание и Счетчик автоматические клеток, а затем подготовить 20 мл суспензии клеток (2,0 x 105 клеток/мл).
- Подключите к зажимается 50 мл шприц без поршень входе O-образный мешка (рис. 1a).
Рисунок 1: схема изображения и фотографии O-образный судов. (А1) Это схематическое изображение O-образный мешка. (А2) Это картина O-образный мешка. (b1) Это схематическое изображение O-образный блюдо. (b2) Это картина О-образные блюда. Внешний и внутренний диаметр мешка O-образный являются 90 мм и 20 мм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Пипетка подвеска подготовленные ячейки в O-образный сумку через зажимается шприца.
- Замените первый зажимается шприц чистый шприца. Добавление 55 мл чистого воздуха через чистый шприц для расширения мешок полностью.
- Зажим в трубку и затем закройте входе. Наконец удалите зажим из трубки.
- Инкубируйте клетки в мешок O-образный, встряхивая их на 45 об/мин в условиях 37 ° C и 5% CO2.
3. Средние изменения (опционально)
- Перенесите суспензию клеток в 50 мл трубки через вход.
- Центрифуга для 2 минут при 200 x g при комнатной температуре, а затем удалить супернатант.
- Добавить 20 мл питательной среды и Ресуспензируйте клетки.
- Добавьте ресуспензированы клетки в O-образный мешок, следующие шаги 2,4-2,7.
- Инкубируйте клетки в мешок O-образный, встряхивая их на 45 об/мин в условиях 37 ° C и 5% CO2.
4. сбор клетки из мешка
- Перенесите суспензию клеток в 50 мл трубки через вход.
- Вымыть внутри мешка с 20 мл фосфата кальция/магния бесплатная буфер солевой [PBS(-), pH = 7,4-7,6] и затем слейте содержимое в трубку собрать оставшиеся ячейки из мешка.
- Центрифуга собранных клеток подвеска на 3 мин на 200 x g при комнатной температуре, а затем удалить супернатант.
- Добавить 10 мл PBS(-) и мыть агрегатов.
- Центрифуга их за 3 мин на 200 x g при комнатной температуре, а затем удалить супернатант для сбора агрегатов.
- Добавьте 4 мл PBS и 1 мл трипсина и инкубировать их с агрегатами для 10 минут при 37 ° C, чтобы разбить ячейки для подсчета (опционально).
5. Подготовка O-образный блюдо (опционально)
Примечание: Смотрите рисунок 1b схематическое изображение O-образный блюдо.
- Вырезать из нижней части 60 мм и 35 мм блюдо с горячим ножом и использовать его как внутренний блюдо.
- Поместите блюдо 60 мм вверх вниз в центре блюдо 100 мм.
Примечание: Лист руководство может помочь решить положение блюдо 60 мм. - При необходимости, надел спайки отрегулировать вязкость циклогексанон изнутри блюдо 60 мм.
- Сухой O-образный блюдо на несколько дней и стерилизуют гамма-кванта или этилена оксид газом.
Representative Results
По нашим измерениям агрегаты, выращенных в обычных блюдо были различными диаметрами после 5 d орбитальных встряхивания. В противоположность этому агрегаты, выращенных в O-образный судов для 5 d был гораздо более единообразного диаметра. Обычных блюдо культуры показали малые агрегаты (50-200 мкм), тогда как культур в O-образный судов не содержит каких-либо малые агрегаты (Рисунок 2a). По данным измерения на основе образа размер обычных блюдо культуры показал две различные вершины (Рисунок 2Б1), указывающее широкий отклонение совокупного размера. Этот результат означает, что агрегаты в обычных блюдо росли под две разные условия в той же культуры, которая может привести к неоднородной ячейки качества. С другой стороны агрегаты в O-образный судов, показал один пик и менее отклонения в диаметре, чем в обычных блюдо (Рисунок 2b2 и 2Б3), предполагая, что такие агрегаты могут быть более однородного качества.
Рисунок 2: морфологии и диаметров агрегатов, выращенных в различных емкостях. Эти панели показывают изображения () brightfield и (b) гистограммы агрегатов, выращенных в либо (А1 и В1) обычных блюдо, (А2 и В2) O-образный блюдо, или (А3 и В3) O-образный мешок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Гематоксилином и эозином совокупного разрезов показали, что агрегаты, выращенных в обычных блюдо некоторые denucleated клеток и некротические ядер (Рисунок 3А). Однако агрегаты, выращенных в O-образный судов не показывать любую некротические ядер (Рисунок 3b и 3 c). В частности агрегаты, выращенные в контейнере O-образный были как большой, как в обычных блюдо еще не имеют каких-либо некротические ядер (рис. 3 c). Эти результаты свидетельствуют о том, переданную газопроницаемой мешок достаточно кислорода для культуры.
Рисунок 3: сечения агрегатов в различных емкостях. Сечения толщиной 12 мкм и были подготовлены замороженных пробах. Разделы были окрашивали гематоксилином и эозином для визуализации ячейки. () ячейку агрегатов, выращенных в обычных подвеска культуры показал некротические ядер. Агрегаты клеток, выращенных в либо (b), (c) O-образный мешок или O-образный блюдо показал очень мало некроза в их ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Клеток показало, что более 85% клеток выжил для 5 d подвеска культуры в каждом сосуде (рисунок 4a). Плотность окончательный клеток был примерно 1,5-2,0 x 106 клеток/мл. Хотя не было значительной разницы, коэффициент роста в O-образный мешок был выше, чем в других судов (рис. 4В). Темпы роста конкретных ячеек в обычных блюдо, O-образный блюдо и O-образный мешок между 2 и 5 день были 0,018, 0,025 и 0,020 h-1, соответственно.
Рисунок 4: сотовый жизнеспособность и рост. Эти панели показывают () клеток жизнеспособность и (b) клеток плотность HEK293 клеток в культуре различных судов после 2 d культуры (день 2) и 5 d культуры (день 5). Показанные значения представляют собой среднее значение результатов от 3 независимых экспериментов. Значения для каждого эксперимента были рассчитаны от Трипановый синий окрашенных клеток подсчитано с автоматической клеток счетчиком. Планки погрешностей указать стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: шарик распределения в 2 форматах разные блюдо в различных условиях тряски. Эта панель показывает распределение шарик при различных условиях тряски (30, 40 и 45 rpm) в обычных и O-образный блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
В этом исследовании мы разработали O-образный судов и осуществляется культура подвеска HEK293 в них для формирования единой агрегатов и расширения. В обычных культуры блюдо круговым пожимая культуры подготовила два разных диаметров агрегатов, в то время как мы наблюдали единообразных агрегатов в O-образный судов (рис. 1). По наблюдениям распределения окрашенные бусы в орбитальных условиях тряски бусины собираются в центре нижней части обычных культуры блюдо. Это собрание предположительно вызвало разницу в плотности клеток, приводит к различным размерам агрегатов. Кроме того бусины были распространены в O-образный блюдо, которое не имеют регионе Центр нижней (Дополнительные рис. 1). Это распределение вероятно вызывает равномерно размера агрегатов в O-образный судов. Другой — широко используется — подход к производству единообразных агрегатов культивирования в microwells, но этот подход имеет некоторые проблемы, такие, как поставки питательной среды без агрегатов, бросают microwells13. В случае судов, O-образный форма агрегатов могут быть произведены в простой подвеска культуры.
Орбиталь, пожимая культуры является популярной культуре системой, используемой для клеток млекопитающих. Существуют различные методы культуры для массового производства mammalian клеток, как возбудили танк биореактор14, волна жестом мешки15и вращающиеся бутылки. Орбитальная пожимая культур не включают в себя внутренний крыльчатка для перемешивания среднего, в отличие от перемешивают танк делает биореактора. Эта функция подобна волна жестом Сумки и вращающейся бутылки. Эти культуры, крыльчатка свободной системы можно избежать повреждения клеток от поперечной силы вокруг крыльчатки и реализовать низкого напряжения сдвига в культуре подвеска. Особенно орбитальных систем пожимая культуры являются эффективными для массового производства чувствительных клеток, таких как mammalian клеток из-за их высокой масштабируемости и низкого напряжения сдвига.
O-образный судов может улучшить оставшиеся проблемы орбитального пожимая культуры в формировании агрегатов. В орбитальный пожимая культуры систем плавающие клетки мигрируют в центр и нижней части судна, который известен как «Эйнштейна чая листья парадокс»11. Эта миграция вызывает неоднородного агрегации и неоднородной совокупного производства в обычных орбиталь, пожимая судов. В этом исследовании O-образный судов помешали концентрации клеток в центре внизу судов, который предположил, как причина единообразного агрегирования в орбитальных пожимая O-образный судов.
Гистологические анализы показали, что агрегаты в обычных блюдо содержится denucleated клетки (Рисунок 2a). В противоположность этому denucleated клетки не в агрегатах с O-образный судов (Рисунок 2b и 2 c). Вполне возможно, что эти denucleated клетки были вызваны нехваткой субстратов, например глюкоза, глютамина и кислород9. Согласно размер измерения агрегатов в O-образный судов были однородной диаметром меньше, чем 400 мкм. В противоположность этому в обычных блюдо, некоторых агрегатов имели диаметр больше чем 400 мкм, и эти агрегаты включены denucleated клетки. Этот результат свидетельствует о том, что создание однородных размера агрегатов в O-образный судов является эффективным средством контроля качества агрегатов. Кроме того он также предположил, что оксигенации через газопроницаемой полиэтиленовая пленка предотвратить появление denucleated клеток в O-образный мешок.
Эти эксперименты показали возможность этих судов, O-образный как простой системы для производства единообразной агрегатов. Хотя другие культуры мешки для подвески культуры были развитыми15, эти культуры мешки квадратной формы, которая предотвращает культуры эффективно получать смешанные в орбитальных встряхивания. Сумка в этом исследовании имеет Роман круглая форма подходит для орбитальных пожимая производить агрегатов с размером однородной. Эта характеристика судов имеет важное значение для контроля условий и высокая воспроизводимость клеток в массовое производство. Возможное применение корабля O-образный широко распространена. Он может использоваться при производстве рекомбинантных белков из клеток и регенеративной медицины при работе с стволовых клеток.
В заключение мы разработали Роман O-образный мешок подходит для производства форма клеток агрегатов с орбитальной пожимая культуры. Мешка показывает возможности для различных биомедицинских приложений, таких как в регенеративной медицине.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается сотрудничество с Есида Такао FUKOKU, CO., Ltd. от FUKOKU, CO., Ltd. представил идею мешок O-образный культуры. Такамаса Sato от FUKOKU, CO., Ltd. поддержали это исследование с точки зрения вычислительной моделирования для разработки мешок O-образный культуры. Мы хотели бы оценить текущие принадлежность соответствующего автора, Осакский университет, за предоставленную нам возможность работать на публикацию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
