Summary
우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.
Abstract
활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.
Introduction
연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca2 + 센서 역할을 신경 전달 물질1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV3내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과 immunosignal의 형광 강도 SV 재활용의 양에 비례 합니다. 이 방법은6,8재활용 제정 및 도발은 유도 SV를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
접시에 거의 모든 세포에 바이러스 중재 하는 유전자 이동 또는 세포의 작은 숫자의 스파스 transfection Syt1 이해 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 우리의 방법은 칼슘 인산 염9를 사용 하 여 기본 hippocampal 신경의 스파스 더블 transfection 분석 결과 결합 합니다. 재조합 마커 단백질 presynapses에서 축적 하는 것으로 알려져 붙일 태그 Synaptophysin, 연 접 맨끝을 찾아서 우리의 단백질, Rogdi의 overexpress를 사용 합니다. 수 있습니다 테스트 여부 Rogdi 기능 synapses 대상과 SV 재활용에 영향을 줍니다. Rogdi 인코딩 유전자 초파리 돌연변이 장애인된 메모리10특징에 대 한 화면에서 원래 확인 되었다. 인간에서는, Rogdi 유전자에 있는 돌연변이 Kohlschütter Tönz 증후군 이라는 희귀 하 고 치명적인 질병을 일으킬. 치과 나 멜 기형, pharmacoresistant 간 질 및 정신 운동 지연;에서 고통 받는 환자 그러나, 유전자 제품의 subcellular 지 방화 하기 어려운11남아 있었다. 따라서, Syt1 이해 분석 결과 제공 기능 시 냅 스9에서 GFP 태그 Rogdi의 지역화에 대 한 주요 증거.
이 통풍 관 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, SV 재활용 관찰할 수 있습니다 모두 실시간으로 라이브 이미징7,12, 수행 하 여 및 고정6,9 후 Syt1 형광 라벨의 형광 강도 측정 하 여. 또한, 여러 Syt1 항 체 변종 개발 되었습니다. 다음 표준 immunostaining 프로토콜, 고정 후 2 차 항 체로 표시 될 수 있습니다 태그 변종 그리고 이미 연결 된 형광 라벨와 사전 활용된 이체 있다. 마지막으로, 형광 항 체 기반으로 사용할 수 있는 상용 보조 또는 활용 된 염료의 큰 선택 때문에 유리 하다.
때 고정 하 고 immunostaining 신경, 그것은 또한 추가적인 단백질을 위한 얼룩 colocalization 분석을 수행 하. 이 그들이 있는 재활용 SVs에 관하여 결정을 도울 수 있다. 형광 라벨의 강도 SV 재활용의 양 직접 측정. 또한, 항 체는 선택적으로 포함 하는 Syt1 구조, 높은 특이성 및 작은 배경 형광4결과로 라벨. 다른 자극 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다, 같은 도발은 버퍼 또는 전기 자극 프로토콜9,12,,1314. 그러나, 기초 SV 재활용 신경 문화15자극 없이 측정할 수 있습니다.
우리의 방법은 구체적으로 고정 후 이차 항 체 immunolabeling와 더블 페 뉴런에서 Syt1 항 체 이해를 해결합니다. 그러나, 우리는 시청자에 게 프로토콜 특정 요구에 적응 하는 기회를 우리의 논의에 분석 결과의 모든 일상적으로 사용 된 이체를 참조 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
아니 살아있는 동물 연구를 실시 했다. 안락사 동물 세포 문화 승인 아래 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다를 포함 하는 실험 번호 T10/30. 실험 승인 프로토콜 실시 했다.
1. 기본 Hippocampal 세포 배양
- 배아 하루 1916,17에 쥐 해 마의 천연된 세포 배양을 준비 합니다. 12 m m coverslips polyethyleneimine (페이) 50000-60000 셀/잘의 조밀도에 24-잘 요리 코팅에 셀 접시 챔버 및 단계 대조 광학 계산 셀을 사용 하 여 밀도 확인 합니다.
- 3 일 동안 (하루 생체 외에서 (DIV) 3) 5% CO2와 37 ° c 배양 기에서 24-잘 접시에서 뉴런을 문화.
- 전송 된 가벼운 현미경 검사 법 (예를 들어, 단계 대조 광학 10-20의 확대)를 사용 하 여 셀 건강의 지표에 대 한 coverslips를 평가 합니다. 건강의 다음 지표에 대 한 확인: 명확한 단계 대비 후광, 파란색된 구조 없이 neurites 그리고 소마 클러스터링 또는 neurite 번들.
2입니다. transfection
참고: 다음 프로토콜 3 웰 스에 대 한 이중 transfection를 말합니다. 그러나, 프로토콜 금액 4 우물에 대 한 충분 한 준비가 때 가장 잘 작동 합니다.
- Transfection 버퍼 (274 m m NaCl, 10mm KCl, 1.4 m m 나2HPO4, 15 m m 포도 당, 42 mM HEPES)의 500 mL를 삼각 플라스 크에 준비 합니다.
- 8.0 g의 NaCl, KCl의 0.37 g, 나2HPO4의 0.095 g, 포도 당의 1.35 g와 400 ml 삼각 플라스 크에 증류수의 HEPES의 5.0 g을 분해.
- PH 미터를 사용 하 여 1 M NaOH와 6.95에 pH를 조정 합니다.
- 500 ml 증류수와 볼륨을 조정 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 확인 하십시오.
- Transfection 버퍼 pH 값의 20-30 mL aliquots pipetting 1 확인 transfection 버퍼에 M NaOH: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
참고: transfection 버퍼의 pH transfection 효능에 대 한 결정적 이다. - 테스트 하려면 transfected 세포의 높은 숫자가 있는 transfection 버퍼 리드, 7.11 6.96에서 각 pH 값을 테스트 합니다. 2.2 2.11 및 검증된 플라스 미드 GFP 표현에 설명 된 transfection 방법을 사용 합니다. 버퍼는 최고의 작품을 평가 하는 모든 transfection 버퍼 pH 값 coverslip 당 transfected 세포의 수를 결정 합니다.
- Aliquot 2 mL microcentrifuge 튜브로 높은 transfection 효율 버퍼 동결 및 저장-20 ° c.에 튜브
- 미리 따뜻한 물 목욕에서 37 ° C에 증류수, 세포 배양 매체, 감소 된 혈 청 매체.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 transfection 믹스를 준비 합니다. 살 균 작업 조건을 보장 하기 위해 층 류 후드 작동 합니다.
- 믹스 7.5 µ L 2 M 염화 칼슘의 각 내 무료 DNA (Synaptophysin-mOrange 및 mGFP/GFP-Rogdi)의 4 µ g. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 60 mL의 총 볼륨에 도달 물을 추가 합니다.
- 믹스를 transfection 버퍼의 60 mL를 추가 합니다. 최상의 결과 얻으려면 추가 transfection 버퍼 dropwise 소용돌이에 DNA-믹스를 부드럽게 흔들어 동안.
- 20 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 층 류 두건 옆 튜브를 배치 하 여 보육 시간 동안 부 화 튜브를 떨고 하지 마십시오.
- 층 류 두건에서 1000 mL를 피펫으로 사용 하 우물에서 세포 배양 매체 (이 하 "조건된 매체")를 제거 하 고 인큐베이터에서 별도 컨테이너에 저장 합니다.
- 각 우물에 감소 된 혈 청 매체의 500 mL를 추가 합니다. 20 분 잠복기 (2.3.3 단계)가 끝날 때까지 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.
- 여러 상품 pipetting으로 각 잘 하 transfection 믹스의 30 mL를 추가 합니다. 튜브의 바닥에 찌 꺼 기를 삭제 합니다.
- 모든 우물이 transfection 믹스와 함께 제공 된, 후 부드럽게 transfection 혼합 매체에서의 배포를 보장 하기 위해 24-잘 접시를 흔들.
- 37 ° C, 5% CO260 분 동안 우물을 품 어.
- 제거 및 transfection 믹스를 폐기 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 그들을 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 이 세 번 반복 합니다.
참고: 세척 단계는 중요 한. 최소한 각 잘 없는 매체는 시간 유지 (즉., 제거 하 고 잘에 의해 잘 대체) 부드럽게 세척 매체를 추가. - 제거 하 고 세포 배양 매체를 버리고 바른된 중간 잘-의해-우물의 450 mL를 추가.
- DIV 10 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 성숙한 뉴런을 하자.
3. 자극과 Syt1 통풍 관
참고: 다음 프로토콜 글귀 3 웰 스에 적용 됩니다. 웰 스의 다른 수의 도발은에 대 한 금액을 적절 하 게 조정 합니다.
- 50 mL 삼각 플라스 크에 10 x 도발은 버퍼 (640 m m NaCl, 700 m m KCl, 10mm MgCl2, 20 m m CaCl2, 포도 당 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7.4)을 준비 합니다.
참고: 도발은 버퍼 수 보관 4 ° C에서 몇 주 동안. Depolarizing 비 솔루션은 또한, 사용 하는 경우, 10 준비 1290 m m로 구성 된 x Tyrode의 솔루션 NaCl, KCl, 10mm MgCl2, 50mm 20 m m CaCl2, 300 m m 포도 당, 200 mM HEPES pH 7.4 비교 하기 위해 자극 유발 자발적 재활용 재활용. 1 x 희석, 1 µ M 테트로도톡신의 활동 전위 생성을 차단 하는 사용 하기 전에 추가 합니다.- 1.87 g의 NaCl, KCl, MgCl2-6 H20의 0.1 g, CaCl2-2 H2O의 0.15 g과 포도 당-1 H2O의 3.0 g와 삼각 플라스 크에 증류수 50ml에 HEPES의 2.38 g의 2.61 g을 분해. NaOH와 살 균 필터 솔루션 pH를 조정 합니다. 1 x 농도 달성 하기 위해 증류수에 희석 버퍼 1시 10분.
- 자극 후 고정을 위한 1 개의 x PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.
- 4%의 500 mL에 대 한 1 x PBS에 PFA 분해 450 ml 증류수 H2o.의 paraformaldehyde의 20 g
참고: 솔루션을가 열 용 해, 최대 속도 수 있습니다 하지만 PFA 수 분해로 솔루션 70 ° C 이상가 열 하지 마십시오.
주의: PFA 이며 독성, 잠재적으로 발암 성 않았음. PFA 작업할 경우 장갑을 착용 연기 후드, 작업과 섭취 하지 않도록 합니다. - Rt 솔루션 식 고 10 배 PBS 재고 솔루션 50 mL를 추가 합니다. NaOH/HCl pH 미터를 사용 하 여 함께 pH 7.4에 조정 합니다.
- 4%의 500 mL에 대 한 1 x PBS에 PFA 분해 450 ml 증류수 H2o.의 paraformaldehyde의 20 g
- 미리 버퍼 도발은 x 1의 600 mL와 10 mL 물 목욕에서 37 ° C에 세포 배양 매체의 따뜻한.
- 10 초 동안 x 도발은 버퍼 및 회오리 1 마우스 안티 Syt1 항 체 (클론 604.2)의 1 mL를 추가 합니다.
- 제거 하 고 세포에서 세포 배양 매체를 삭제. 각 잘 하는 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 5 분 동안 품 어 도발은 항 체 혼합의 200 mL를 추가 합니다.
- 제거 및 삭제 도발은 항 체 혼합 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 세 번 반복 합니다.
- 제거 및 세포 배양 매체를 삭제 하 고 300 mL 4%의 추가 PFA 1 x PBS에. 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
- 1 x PBS 각 5 분 동안 세 번 씻는 다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
4입니다. Immunocytochemistry
- 블로킹 버퍼의 50 mL를 준비 합니다.
참고: 버퍼를 차단 수 있습니다 보관-20 ° C에서 몇 달 동안.- 10 x PBS 재고 솔루션의 5 mL에 자당의과 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1 g 2.5 g를 용 해. 10% 세제 재고 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다. 모든 구성 요소는 제대로 녹이 고 증류수 H2O 50 mL의 최종 볼륨을 도달할 때까지 추가 때까지 솔루션을 저 어. 약 수는 솔루션 및 스토리지에 대 한 aliquots를 동결.
- 보조, fluorophore 결합 항 체 (기본 Syt1 항 체 종에 대 한 감독)에 1:1000의 희석에 각 잘 차단 버퍼의 200 mL에 희석.
- 제거 하 고 각 잘을 포함 하는 coverslip에서 1 x PBS를 삭제.
- 버퍼-항 체 혼합 각 잘 차단의 200 mL를 추가 하 고 실시간에 60 분 동안 품 어
주의: 2 차 항 체는 빛에 민감한, 때문에 앞으로 이동 하는 모든 단계는 어둠 속에서 수행 합니다. - 부 화, 후 셀 1 x PBS의 1 mL와 5 분 동안 세 번 씻어.
- 포함 매체와 현미경 슬라이드에 coverslips를 포함 합니다.
- 현미경 슬라이드에 매체를 포함 한 7 mL 방울을 추가 합니다. 주사기와 그것을 해제 하 고 집게로 잡아 여는 coverslip 24-잘 접시에서 제거 합니다.
주의:는 coverslip의 표면에 세포는 쉽게 손상, 그래서 집게 관리와 처리 해야 합니다. - 으로 PBS를 제거 하 고 부드러운 조직에 한 가장자리를 만져 그것을 신중 하 게 건조 하는 coverslip 찍어.
- 셀을 운반 표면 얼굴 현미경 슬라이드, 그로 인하여 포함 매체 셀에 포함 되도록 포함 중간 물방울에 coverslip 플립.
- 현미경 슬라이드에 매체를 포함 한 7 mL 방울을 추가 합니다. 주사기와 그것을 해제 하 고 집게로 잡아 여는 coverslip 24-잘 접시에서 제거 합니다.
- 1-2 h의 후드 아래에서 말리를 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
5. 현미경 분석
- coverslips, 건조 후 목표와 카메라 현미경 그들을 놓습니다.
- 회색 값의 최대 배포 되도록 몇 픽셀 과도 노출 되도록 모든 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
참고: 노출 시간 채널 간에 다를 수 있지만, 그것은 해야는 coverslips 사이 comparability을 위해 1 개 채널에 대 한 상수. - 관심 (ROIs) coverslip 당 10 영역에 대 한 다중 채널 이미지를 취득 합니다. Punctate 해야하는 GFP 형광을 확인 하 여 투자 수익에 transfected 신경에서 axonal 프로세스 포함 되어 있는지 확인 하십시오.
6. 통계 분석
- .Tif 파일로 이미지를 내보냅니다. 파일 을 클릭 하 여 오픈 뷰18 에 이미지를 로드 | 로드 이미지 파일입니다.
- 채널 1로 Synaptophysin mOrange 이미지, Rogdi-GFP/mGFP 이미지로 2, 채널 및 채널 3로 Alexa647 형광 이미지를 선택 합니다.
- ROIs 임계값입니다.
- 분석 을 클릭 | Puncta 이상의 장소 지역. 육안 검사에 따라 확산 형광 제외, 채널 1의 이미지에만 punctate 신호 (대표 Synaptophysin mOrange 형광)을 떠나 있도록 임계값 및 델타 강도 값을 선택 합니다. 모든 이미지에 대 한 동일한 임계값을 유지.
- 지금 실행을 클릭 하 여 해당 채널 2에 이러한 ROIs (GFP-Rogdi/mGFP 형광) 및 3 (Syt1-형광) 각 coverslip 영역을 전송.
참고: 셀이 더블 페는 ROIs만 고려 한다. 이 방법에서는, mOrange 및 GFP 형광 명확 하 게 표시 되어야 합니다. - 로그 데이터를 클릭 하 여 분석 로그 편집기에 데이터를 저장 합니다.
- 분석 로그 편집기 Windows 탭에서 열고 각 채널에 대 한 값을 복사 합니다. 스프레드시트에 별도 채널에 대 한 값을 붙여 넣습니다.
- 두 transfection 조건 (GFP-Rogdi 및 mGFP)에서 ROIs에서 Syt1 채널의 평균 형광 강도 결정 합니다.
- 상당한 차이 확인 하기 위해 학생의 t-검정 등 적절 한 통계적 테스트를 적용 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 접근의 예상된 결과 잘 당 50000 뉴런의 밀도에 coverslip 당 약 50 더블 페 뉴런 찾는 것입니다. 각 신경의 축 삭 붙일 태그 Synaptophysin 축적, 나타내는 클러스터 ofSVs의 여러 핫스팟 표시 예정 이다. 기능적 연 접 사이트에서 재조합 Synaptophysin 신호 punctate Syt1 형광으로 colocalizes. 더블 transfection를 사용 하 여, 관심 (그림 1)의 단백질으로 GFP-Rogdi 또는 mGFP 제어 재조합 Synaptophysin와 공동 표현 이다.
이 실험에서 우리는 SV GFP-Rogdi 또는 mGFP을 표현 하는 신경 세포 연 접 사이트에서 재활용 분석. 경우 컨트롤 단백질, mGFP, 균질 전체 셀에 걸쳐 배포 됩니다 하지만 시 냅 스 사이트에서 영향력 여전히 공부 될 공동 transfect 농축 presynaptically 두 번째 단백질 필요 하다, 붙일 태그 Synaptophysin입니다.
앞서 설명한 대로 셀 도발은 유도 송신기 릴리스를 받 다. 그 결과, 기능 시 냅 스 Syt1 항 체는 매체에 추가 차지 합니다. Immunolabeling는 Syt1 붙일 레이블된 이차 항 체와 항 체, 후 Syt1 통풍 관의 범위는 immunosignal (그림 2)를 사용 하 여 측정할 마침내는.
그림 1입니다. 더블 페 셀. 보기의 필드 GFP-Rogdi (A)와 Synaptophysin-mCherry (B) 더블 페 셀을 보여 줍니다. Synaptophysin는 풍부한 시 냅 스 소포 단백질 이다. 그것의 재조합 변형 시 냅 스 boutons를 라벨에 대 한 사용할 수 있습니다. GFP-Rogdi의 지역화 패턴 Synaptophysin-mCherry (C)의 유사합니다. 스케일 바 = 10 μ m. 상자 2.5 배 확대를 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 기능 시 냅 스에서 GFP-Rogdi. 라이브 Syt1 통풍 관 더블 페 셀 (녹색) mGFP와 Synaptophysin-mOrange (빨강;에서 수행 되었다 A-D) 또는 GFP-Rogdi (녹색)와 Synaptophysin-mOrange (빨강; E-H). Syt1 항 체 이해 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여 수행 되었다. PFA 고정 후 셀 토끼 안티-GFP 항 체와 얼룩이 있었다. 2 차 항 체 (항 토끼 알 렉 사 488와 안티 마우스 알 렉 사 647) 감지 GFP 또는 GFP Rogdi Syt1, 각각에 추가 되었습니다. Autofluorescence Synaptophysin-mOrange의 연 접 단자 (B와 F)을 감지 하 사용 되었다. 면역 형광 Syt1 punctate 나타냅니다 소포 (블루; 재활용의 사이트 C와 G)입니다. Note 대부분 Syt1 표시 된 시 냅 스의 페 비 신경에 지역화 됩니다. GFP Rogdi 활성 시 냅 스를 대상 고 시 냅 스 소포 (I)을 재활용 하는 것은 변화 하지 않았다. 3 독립적인 문화 실험 수행 되었습니다 (N = 3). 각 문화 (10 총)에서 적어도 3 coverslips 분석을 위해 사용 되었다. 마지막으로, 3 지역 coverslip 당 분석 되었다 (n = 30). Student´s t-검정 큰 차이 보였다. 스케일 바 = 10 μ m. 오차 막대 (S.E.M.) 의미의 표준 오류를 나타냅니다. "N.s." 아무 의미를 나타냅니다. 이 그림에서 리만 외 수정 되었습니다. 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매체의 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 재조합 형 단백질 GFP의 pH에 민감한 변종 태그 Phluorins 라고 합니다. 두 분석 논의 되었습니다 모두 이전19,20, 그리고 각각의 찬 부 양론 또한 검토21되었습니다.
여기, 우리는 세 번째, 잘 설립 방법4,5,6,7,,914설명합니다. SV 재활용을 테스트 하려면 우리 활용 사실 소포 관련 단백질 Synaptotagmin-1 (Syt1)의 luminal 도메인 exocytosis 시 세포 표면에 노출 된다. 첫째, 우리는 항 체는 다음에 의해 촬영에 소포 SV 재활용 하는 동안 문화 매체에 luminal 도메인에 대 한 감독을 추가 합니다. 이 항 체 이해 시각 이며 면역 형광에 의해 정량 합니다. 또는, 직접 레이블이 Syt1 항 체를 사용할 수 있습니다. 라벨은 pH-독립, 지역화 Syt1-항 체의 내부와 SVs, 또는 pH 의존의 외부 표면에 형광 변화를 기반으로 하는 지역화 보고 보고 될 수 있습니다. 우리는 또한이 SV 재활용 분석 결과 단백질, GFP-Rogdi, 관심 대상 기능 synapses와 SV 재활용에 영향을 미치는 여부를 테스트 하려면 양식된 뉴런의 더블 transfection의 조합을 설명 합니다. GFP Rogdi는이 접근; 그러나, 관심사의 어떤 단백질에 대 한 같은 질문을 해결할 수 있습니다.
이 분석 결과 SVs4 의 자발적인 재활용 모니터링을 1992 년에 처음 도입 하 고 갖는 SV12재활용을 모니터링 하는 데 같은 그룹에 의해 더 개발 되었다. 그들의 실험 Syt1 글귀는 SV exocytosis12차단 clostridial 신경에 민감한 설립. 그들은 또한 자극 도발은 37 ° C에 의해 문화의 대부분 endocytosis 방지, 얼음에 보관 된 문화 1)에 비해 2) 문화, 자극 없이 37 ° C에서 incubated Syt1 항 체의 국제화 강화 보여주었다는 자발적 재활용 가능 하지만 재활용12,22를 연상 하지 않습니다. 분석 결과 쉽게와 관심의 분자 없이 SV와 같은 두 가지 조건 사이 재활용 비교할 수 있습니다. 특히,이 프로토콜은 특정 overexpressed 단백질의 부재와 존재에서 Syt1 항 체 이해를 비교에 집중 한다. 표면-바인딩, 자발적인 재활용 및 재활용 evoked의 상대적 기여 평가 될 필요가 있는 경우 프로토콜을 확장할 수 있습니다. 예를 들어 신경 자극 없이 얼음에 잠복기 endocytosis Syt1 항 체의 어떤 표면 바인딩을 공개를 방지할 수 있습니다. 테트로도톡신 기저 솔루션에서 37 ° C에서 뉴런 잠복기 자발적 재활용 공개 활동 전위 전파를 방지 합니다. 따라서, 잠복기 신경 자극 조건 수에서 37 ° C에서 갖는 SV 재활용의 범위를 공개 했다.
라이브 셀 이상적인 생리 조건;에 민감합니다. 따라서, 유지 보수, transfection, 및 버퍼 도발은 항상 시험 되어야 한다 pH, 온도 등 생리 적인 매개 변수에 대 한. 도발은 버퍼 산도 조정 되었습니다 후 살 균 필터를 통해 전달 될 수 있습니다, 하는 동안 transfection 버퍼 살 균 필터링 민감합니다. 따라서, 우리의 pH 조정, 사용까지 동결 그것을 유지 하 고 작은 어떤 박테리아를 탁상 원심 분리기에서 회전. Transfection를 위해 적절 하 게 인산 칼슘 크리스탈 플라스 미드의 협회를 위해 버퍼를 혼합에 생명 이다. 칼슘 인산 염 transfection 작품 최고의 하루에서 생체 외에서 (DIV) 2-4. 태그 Synaptophysin, SV 막 횡단 단백질 transfected 신경 연 접 맨끝을 식별 하기 위한 표식으로 사용 합니다. SV2, Synapsin, 뱀파이어/Synaptobrevin 등 다른 SV 단백질 또는 바 순, RIM, Munc13-1, 그리고 캐스트와 같은 활성 영역 분자의 태그 버전도 사용할 수 있습니다.
MCherry와 mOrange 둘 다 빨간 형광 방출. MCherry는 mOrange 보다 밝게, 더 큰 방출 mOrange 보다 긴 파장에 있다. 따라서, 트리플 형광 이미징 GFP, 붉은 염료, 그리고 700 nm 범위에서 방출 하는 염료, mOrange mCherry 보다 더 나은 옵션입니다. 그것이 이기 때문에 밝은 염료 GFP와 붉은 염료 형광 두에 대 한 mCherry는 유리한 수 있습니다. 스파스 transfection를 하려면 transfection 믹스 해야 하지 알을 품을 60 분 이상. 그것은 또한 외피 depolarizing 버퍼에 모든 소포 exocytosis 되도록 시간의 오른쪽 길이. 그러나, depolarizing 버퍼에 확장된 노출은 피해 야 한다. 이미지 수집, 동안 또한 동일한 노출 시간 및 정량 비교 실험의 다른 세트를 위해 가벼운 강렬을 적용할 필수적 이다.
마지막으로, 이미지 분석, 중 우리의 프로토콜 몇 가지 고려 사항이 포함 되어 있습니다. 재조합 Synaptophysin puncta를 보여주는 관심의 한 영역에 대 한 낮은-강도 임계값 확산 형광 제외 되도록 설정 됩니다. 다음,이 임계값은 다른 지역과 coverslips punctate 신호에의 유사한 포함 및 제외 확산 형광의 관찰 하에 테스트 됩니다. 적절 한 임계값을 확인 한 재조합 Synaptophysin (mCherry 또는 mOrange 태그로) 채널에 관심 (ROIs) punctate 영역을 생산 하는 모든 이미지에 적용 됩니다. 마지막으로, Syt1 강도 ROIs9에 대 한 결정 됩니다.
우리의 접근은 스파스 transfection에 최적화 되어 있습니다. 우리는 복잡 한 설정에 연 접 기능 분석 SV untransfected 신경에 의해 둘러싸인 transfected 뉴런의 축 삭에 재활용입니다. 이 설정에서 더블 transfection 신경 기능을 조작 하 여 transfected 신경의 연 접 맨끝을 찾을 수 있습니다. Transfected 연 접 신경 postsynaptic 신경 untransfected 문의 SV 재활용에 대 한 연 접 신경의 효과 평가에 중요 한 요소 이다. 설정은 postsynaptic 조작 하면 연 접 변경 여부 테스트를 쉽게 적응 수 있습니다 또한. 이 경우에, 신경 postsynaptic 사이트를 대상으로 하는 단백질의 스파스 transfection transfected 뉴런의 postsynaptic 사이트 지역화 됩니다 그리고 Syt1 통풍 관 untransfected 신경의 시 냅 스 boutons에서 확인할 수 있습니다.
스파스 transfection 필요 하지 않을 경우, 다른 transfection 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어 DIV 7-8 결과 높은 transfection 요금, 하지만 그것에 Lipofectamine와 transfection에 각 transfected 세포9에 강한 식 임무 인. 또한, 바이러스 성 변환 교양된 뉴런14,,2324의 거의 100%에 식에서 발생할 수 있습니다. SV 재활용을 모니터링 하기 위한 실험, transfection 단일 단백질에 대 한 수행 하거나 완전히 탈락 될 수 있습니다. 예를 들어 때 전반적으로 시 냅 스 재활용 wildtype에서 뉴런 사이 비교 유전자 변형 생쥐, transfection에 의해 개별 뉴런 라벨 필요 하지 않습니다. 또한, 내 생 단백질의 immunolabeling 수 있습니다. Transfection는 실패 하면, 그것은 유효한 플라스 미드와 transfection 버퍼를 테스트 하거나 다른 ph 버퍼를 사용 하는 것이 중요 ( transfection 버퍼의 준비참조). 내 무료 DNA 준비를 사용 하 여 또한 중요 한 것 같다. Immunostaining 모두 PFA 고정 및 메탄올 고정 샘플에서 Syt1 항 체 작품을 내 면. 그것은 GFP와 RFP autofluorescence 메탄올 고정 후 손실 됩니다 주목 해야한다. GFP 또는 RFP 메탄올 고정 셀에 지역화 될 필요가,이 단백질 immunolabeled 이어야 합니다. Syt1 이해 못하면 도발은 시간과 도발은 버퍼에 K+ 농도 변경 해야 그에 따라. 45 m m, 50mm, 70mm, 및 110 m m6,25,26 K+ 농도 도발은 60 분12, 90 s25 까지 시간 함께 많은 프로토콜 변형 출판 되었습니다. ,27. 재발 활동은 방지 되어야 한다, 도발은 동안 또한 글루타민 산 염 수용 체 차단제를 추가 수 있습니다. 마지막으로, 동안 높은 K+ 도발은 강한 자극 생각, 활동 전위는 SV 재활용 더 많은 생리 적 자극22,28을 통해 유도할 수 있다. 쥐와 쥐 문화에서 Syt1 항 체 이해 효능에 차이가 발생할 수 있습니다. 우리의 방법에 단일 클로 널 마우스 안티 Syt1 클론 604.2 (RRID:AB_993036) 생산 polyclonal 토끼 안티 Syt1 항 체 (RRID:AB_11042457) 생산 마우스 문화에 더 강한 얼룩 하는 동안 마우스 문화에 보다 쥐 문화에 강한 얼룩 하지만 주의의 몇 가지 메모 아래 설명 되어 있습니다.
SVs로 통풍 관에 대 한 안티-Synaptotagmin 항 체의 사용에 관한 몇 가지 주의 사항은 고려해 야 합니다. 첫째, 아스파라긴 24 Syt1의의 N glycosylation 단백질29,30endocytotic 이해를 촉진합니다. 아스파라긴 24 Syt1 luminal 도메인의 일부입니다. 우리가 사용 하는 마우스와 토끼 항 체 아미노산 1-12, 1-8, Syt1의 각각에 대 한 이동 합니다. 그들의 epitopes N glycosylation 사이트와 중복 되지 않습니다, 하는 동안 입체 방해 또는, 반대로, 항 체 바인딩에 의해 통풍 관의 유도 제외할 수 없습니다. Syt1에 N glycosylation 사이트의 돌연변이 endocytosis의 활동 및 Syt1 SVs 대상으로 변경 되지 않습니다. 그것은 증가 endocytosis 약한 자극에 의해 유발 됩니다 때 외부 원형질 막 표면에 남아 있는 Syt1의 분수. 높은 K+ 도발은 등 강한 자극, 적용 될 때30Syt1 통풍 관에 있는 감소는 관찰 됩니다. 전반적으로, 항 체는 어떤 식으로든에서 N glycosylation 사이트와 방해 하는 경우 그들은 SV endocytosis 항 체 없는 조건에 비해 변경 될 수 있습니다 하지만이 변경 (우리의 케이스에서 GFP Rogdi의 overexpression) 실험을 위해 유사 해야 하 고 (우리의 케이스에서 GFP의 표현) 컨트롤입니다. 또한, polyclonal 항 체 항 체의 큰 복사본 수는 epitope에 바인딩하므로 입체 문제 및 단일 클론 항 체, 보다 가교를 유도 하 더 가능성이 있을 수 있습니다. 우리는 서로;와 함께 사용할 수 있는 항 체를 비교 하는 체계적인 학문의 인식 그러나, 일부 연구는 특정 항 체의 유효성을 해결 하 고 있다. 예를 들어 SV 재활용 활동 직접 비교의 단일 클로 널 마우스 안티 Syt1 항 체 클론 604.2 및 Synaptophluorin 형광 변화를 사용 하 여 조사 했다 때 비슷한 결과 얻은 했다,이 항 체28를 사용 하 여 유효성 검사. Polyclonal 토끼 Syt1 항 체와 SVs를 로드 및 electrophysiologically 시 냅 스 전송 녹음 로드 시 냅 스에 손실의 기능 돌연변이의 연상 Syt1 시 냅 스 전송 감소 했다 밝혔다. 따라서, 이러한 polyclonal 항 체는 시 냅 스 전송 영향 을지 않습니다. 실제 통풍 관 모두 자연과 갖는 재활용, polyclonal 항 체는 SV 재활용의 한 라운드를 모니터링 하는 데 적합 하지만 이러한 항 체31의 후 결과 해석할 때 주의 취해야 한다 밝혔다.
3 분석 SV 재활용 공부 하는 일상적으로 사용, 막 styryl와 라벨을 포함 하는 염료, Phluorins의 overexpression 그리고 Syt1 항 체 이해 여기 수행 모든 3 개의 분석 실험 SV 재활용의 endocytotic 및 exocytotic 다리를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 모든 3 개의 분석 실험 강력한 혜택을가지고, 또한 마다 원칙 주의 해야. FM 염료 전체 세포 표면에 레이블을 하 고는 모든 재활용 멤브레인과 셀으로 채택. Phluorins는 overexpression에 의해 도입 해야 합니다. Syt1 항 체 라벨 생 단백질, 하지만 일부 항 체 특정 조건 하에서 그것의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 각 경고, 수 있다 적절 하 게 제시 된21.
전반적으로, Syt1 항 체 이해 분석 결과 다양 한 목적을 역임 했다. 첫째, 자발적 또는 갖는 재활용, 각각28,31,,3233겪고 SVs를 선택적으로 사용 되었다. 둘째, SV 재활용;의 범위에는 약물 또는 단백질의 효과 결정 하는 데 사용 했다 예를 들어, BDNF 자연과 갖는 SV6재활용 향상을 보여. 셋째, SVs 형태학 상으로 정의 된 시 냅 스34,35의 총 수의 재활용과 시 냅 스의 수를 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 계시는 SVs25 재활용과 시 냅 스의 비율 증가 postsynaptic 세포 접착 분자 Neuroligin-1 overexpressing와 그의 비율을 감소 감소 AMPA 형 글루타민 산 염 수용 체의 표현 SVs, presynaptically 침묵 시 냅 스36의 비율이 증가 재활용과 시 냅 스. 또한, 분석 결과 이라는 SVs27 의 이동성을 분석 하 고 Syt1 nanoscopy13,22,33를 사용 하 여 지역화를 결정 하기 위해 사용 되었다. 마지막으로,이 메서드는 특정 단백질 기능 시 냅 스9지역화 여부 테스트를 여전히 사용 됩니다. Syt1 항 체도 사용할 수 있습니다 장기 연구에 대 한 항 체는 신경에 다음과 같은 글귀37일 동안 남아. 이 별도로 분류 Syt1 항 체 또는 항 체의 다른 SV 단백질 luminal 도메인에 대 한 지시를 사용 하 여 통풍 관의 2 차 결합 될 수 있다. SVs 처음 재활용 하 고 있는 실험의 끝에 의해 재활용의 테스트 수 있습니다. 그것은이 분석 결과 급성 조각 organotypic 조각 문화 등 더 많은 그대로 모델 시스템에 맞게 재미 있을 것. 원칙적으로, 통풍 관 분석 결과 조직 wildtype에서의 비교를 허용 한다 유전자 동물 수정 및 바이러스 배달 또는 biolistics, 즉결합 될 수 있습니다., "유전자 총"이 모델 시스템에서 단백질 식이 조작 하. 이러한 시스템에서 연 접 기계, 통풍 관 분석 결과, 및 네트워크 역동성에 의해 감시에 특정 물결의 영향을 동시에 공부 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 전문가 기술 지원을 위한 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 이 작품은 나노미터 범위에 현미경 검사 법에 대 한 우수성의 클러스터 (CNMPB, b 1-7, T.D.) 뇌의 분자 생리학을 통해 DFG에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
