Summary
We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.
Abstract
Bij actieve presynaptische zenuw terminals ondergaan synaptische vesikels cycli van exo- en endocytose. Tijdens de recycling, worden de luminal domeinen van SV transmembraan eiwitten op het celoppervlak blootgesteld. Een van deze proteïnen is Synaptotagmin-1 (Syt1). Een antilichaam gericht tegen het luminal domein van Syt1, eenmaal is toegevoegd aan het kweekmedium, wordt tijdens de exo-endocytotic cyclus in beslag genomen. Deze opname is evenredig aan het bedrag van SV recycling en kan worden gekwantificeerd door immunofluorescentie. Hier combineren we Syt1 antilichaam opname met dubbele transfectie van gekweekte hippocampal neuronen. Hierdoor is ons (1) lokaliseren presynaptische sites die zijn gebaseerd op expressie van recombinante presynaptische markering Synaptophysin, (2) het bepalen van hun functionaliteit met behulp van Syt1 opname en (3) karakteriseren de doelgerichtheid en de gevolgen van een proteïne van belang, GFP-Rogdi.
Introduction
Bestuderen van synaptic vesikel recycling is belangrijk bij het bepalen hoe presynaptische eigenschappen, tijdens de Synaptische plasticiteit of in reactie op verstoring van synaptische functie wijzigen. Synaptotagmin-1 (Syt1) bestuderen biedt antilichaam opname een methode voor het meten van de hoeveelheid SV recycling. Syt1 is een SV-geassocieerde proteïne dat fungeert als een Ca2 + sensor en is noodzakelijk voor de exocytotic release van de neurotransmitter1,2. Het is een transmembraan eiwit met een C-terminal cytoplasmatische domein buiten de SV en een N-terminal luminal domein binnen de SV-3. Tijdens exocytose, wordt het luminal domein van Syt1 blootgesteld aan het externe medium. We toevoegen naar deze externe medium, antilichamen gericht tegen de cytoplasmatische domein, waardoor het geëigd tijdens endocytose maken wordt. Deze antilichamen kunnen dat hetzij vooraf geconjugeerd met fluorophores of immunostained met secundaire antilichamen4,,5,,6,7. De intensiteit van de fluorescentie van de resulterende immunosignal is evenredig aan het bedrag van SV recycling. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen zowel de constitutieve en de depolarisatie-geïnduceerde SV recycling6,8.
Syt1 opname testen kunnen worden uitgevoerd na virus-gemedieerde genoverdracht op vrijwel alle cellen in de schotel of na sparse transfectie van een klein aantal cellen. Onze methode combineert de bepaling met sparse dubbele transfectie van primaire hippocampal neuronen met calciumfosfaat9. We gebruiken een recombinant marker eiwit bekend te accumuleren op presynapses, fluorescently tagged Synaptophysin, zoek presynaptische terminals en overexpress onze proteïne van belang, Rogdi. Daardoor kunnen we om te testen of Rogdi doelstellingen functionele synapses en treft SV recycling. Het gen Rogdi codering was het oorspronkelijk geïdentificeerd in een scherm voor Drosophila mutanten gekenmerkt door verminderde geheugen10. Mutaties in het Rogdi-gen veroorzaken bij de mens, een zeldzame en verwoestende ziekte heet het syndroom van Kohlschütter-Tönz. Patiënten lijden aan tandheelkundige glazuur misvormingen, pharmacoresistant epilepsie en psychomotorische vertraging; de subcellular localisatie van het gen product bleef echter ongrijpbare11. Aldus, is de bepaling van de opname Syt1 vastgestelde belangrijkste bewijs voor de lokalisatie van GFP-gelabeld Rogdi bij functionele synapsen9.
Deze opname-techniek heeft meerdere voordelen. Eerst, SV recycling waarneembaar zowel in real-time als door het uitvoeren van levende imaging7,12, en na fixatie6,9 door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van het label van de fluorescentie Syt1. Bovendien hebben verschillende varianten van Syt1 antilichamen ontwikkeld. Er zijn niet-gelabelde varianten die kunnen gelabeld zijn met een secundair antilichaam dat een standaard immunokleuring protocol na fixatie, en vooraf geconjugeerd varianten met een reeds bevestigd etiket van fluorescentie. Tenslotte is de fluorescentie antilichamen gebaseerde voordelige als gevolg van de grote selectie van verkrijgbare secundaire of geconjugeerd kleurstoffen die kunnen worden gebruikt.
Wanneer vaststelling en immunokleuring de neuronen, het is ook mogelijk om de vlek voor extra eiwitten en colocalization analyses uit te voeren. Dit kan helpen bepalen waar zij zich bevinden met betrekking tot recycling SVs. De intensiteit van de fluorescentie-label is de directe maat voor de hoeveelheid SV recycling. Bovendien, label de antilichamen selectief Syt1-bevattende structuren, wat resulteert in hoge specificiteit en weinig achtergrond fluorescentie4. Stimulatie van de verschillende protocollen kunnen ook worden gebruikt, zoals de depolarisatie buffers of elektrische stimulatie protocollen9,12,13,14. Basale SV recycling kan echter worden gemeten zonder het stimuleren van de neuronale culturen15.
Onze werkwijze richt zich specifiek Syt1 antilichaam opname in neuronen met secundair antilichaam immunolabeling dubbel-transfected na fixatie. Echter, verwijzen we naar alle routinematig gebruikte varianten van de bepaling in onze discussie kijkers de gelegenheid te geven zich aan te passen van het protocol aan specifieke behoeften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Geen studies met levende dieren werden uitgevoerd. Experimenten met dieren om te verkrijgen van cel culturen werden goedgekeurd door de autoriteiten van de plaatselijke dierenbescherming (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder de goedkeuring euthanized nummer T10/30. De experimenten werden uitgevoerd met de goedgekeurde protocollen.
1. primaire Hippocampal celkweek
- Bereiden de gedissocieerde celcultuur van de rat hippocampus van embryonale dag 1916,17. Plaat van de cellen op 12 mm coverslips bekleed met polyethyleneimine (PEI) in 24-well gerechten bij een dichtheid van 50.000-60.000 cellen per putje. Controleer de dichtheid met behulp van een cel tellen kamer en fase contrast optiek.
- Cultuur de neuronen voor 3 dagen (dag in vitro (DIV) 3) in een 24-well plaat in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Beoordelen van de coverslips voor indicatoren van cell gezondheid met doorvallend licht microscopie (bijvoorbeeld fase contrast optiek bij een vergroting van 10-20 X). Controleer of de volgende indicatoren van een goede gezondheid: een duidelijke fase contrast halo, neurites zonder beaded structuren, en geen soma clustering of neurite bundelen.
2. de Transfectie
Opmerking: Het volgende protocol verwijst naar een dubbele-transfectie voor 3 putten. Het protocol werkt echter best wanneer er voldoende voor 4 putten bedragen worden opgesteld.
- Bereiden van 500 mL voor Transfectie buffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM nb2HPO4, 15 mM glucose, 42 mM HEPES) in een erlenmeyer.
- Los 8,0 g NaCl, KCl 0,37 g, 0.095 g nb2HPO4, 1,35 g van glucose, en 5.0 g HEPES in 400 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer.
- Breng de pH op 6,95 met 1 M NaOH met behulp van een pH-meter.
- Regel het volume met gedestilleerd water tot 500 mL en controleer de pH met behulp van een pH-meter.
- 20-30 mL aliquots van transfectie buffer met de volgende pH-waarden maken door pipetting 1 M NaOH aan de transfectie buffer: 6,96 6.97 6,98, 6.99, 7,00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7,06, 7,07, 7,08, 7.09, 7.11.
Opmerking: De pH van de buffer van de transfectie is cruciaal voor de doeltreffendheid van de transfectie. - Om te testen welke transfectie buffer leidt tot het hoogste aantal transfected cellen, testen van elke waarde van de pH van 6,96 aan 7.11. Gebruik de methode van de transfectie beschreven in 2.2-2.11 en een gevalideerde plasmide GFP uitdrukken. Bepaal het aantal transfected cellen per dekglaasje aan voor elke transfectie buffer pH waarde om te beoordelen welke buffer het beste werkt.
- Aliquot de buffer met de hoogste efficiëntie van de transfectie in 2 mL microcentrifuge buizen bevriezen en opslaan van de buizen bij-20 ° C.
- Vooraf warme de verlaagde serum medium, cel kweekmedium en gedestilleerd water tot 37 ° C in het waterbad.
- De transfectie mix in een tube van 1,5 mL microcentrifuge voor te bereiden. Werken onder de motorkap van de laminaire flow om steriele arbeidsomstandigheden.
- Mix 7.5 µL van 2 M calciumchloride met 4 µg voor elke endotoxine-gratis DNA (Synaptophysin-mOrange en mGFP/GFP-Rogdi). Voeg water tot een totaal volume van 60 mL in de tube van een 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg 60 mL buffer van de Transfectie aan de mix. Voor de beste resultaten, voeg de transfectie buffer ontkleuring terwijl het schudden van de DNA-mix zachtjes op de vortex.
- Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten. Vermijd de incubatie buis schudden tijdens de incubatietijd door het plaatsen van de buis naast de laminaire flow kap.
- Onder de motorkap van laminaire flow, verwijder het kweekmedium cel ("geconditioneerde medium") de putjes met behulp van een pipet 1000 mL en bewaar het in een aparte container in de incubator.
- Voeg 500 mL van verminderde serum medium toe aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot de 20 minuten incubatie periode (stap 2.3.3).
- Voeg 30 mL voor Transfectie mix aan elk putje door pipetteren enkele druppels. Gooi het residu aan de onderkant van de buis.
- Nadat alle de putjes zijn geleverd met transfectie mix, schud zachtjes de 24-well plaat zodat de verdeling van de transfectie mix in het medium.
- Incubeer de putjes gedurende 60 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijderen en verwijderen van de transfectie mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en hen Incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer.
Opmerking: De wassen stap is essentieel. Houd de tijd die elk goed geen medium minimaal heeft (dwz., verwijderen en vervangen van goed-door-well) en het medium wassen voorzichtig toe te voegen. - Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 450 mL van de geconditioneerde middellange goed-door-put.
- Laat de neuronen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 DIV 10 volwassen.
3. stimulatie en Syt1 opname
Opmerking: Het volgende protocol geldt de opname 3 putjes. Voor de depolarisatie van een ander nummer van putten, de bedragen dienovereenkomstig aanpassen.
- Bereiden 10 x depolarisatie buffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glucose, 200 mM HEPES, pH 7.4) in een conische kolf van 50 mL.
Opmerking: Depolarisatie buffer kan worden bewaard bij 4 ° C voor enkele weken. Als een niet-depolarizing oplossing ook gebruikt wordt, bereiden een 10 x Tyrode de oplossing bestaande uit 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glucose, 200 mM HEPES pH 7.4 te vergelijken stimulatie-geïnduceerde recycling met spontane recycling. Na verdunning 1 x, voeg 1 µM van tetrodotoxine vóór gebruik te blokkeren actiepotentiaal generatie.- Los 1.87 g NaCl, KCl, 0,1 g MgCl2-6 H20, 0.15 g CaCl2-2 H2O en 3,0 g glucose-1 H2O en 2,38 g. van HEPES in 50 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer 2.61 g. Breng de pH met NaOH en steriele-filter de oplossing. De buffer 1:10 verdunnen in gedestilleerd water tot een concentratie van 1 x.
- Voorbereiden op 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS (pH 7.4) fixatie na stimulatie.
- Voor 500 mL 4% PFA in 1 x PBS, los 20 g paraformaldehyde in 450 mL gedestilleerd H2O.
Opmerking: Verwarming van de oplossing kan versnellen oplost, maar doen niet Verwarm de oplossing meer dan 70 ° C, zoals de PFA kan desintegreren.
Let op: PFA is teratogene, toxische en potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen bij het werken met PFA, werken onder de zuurkast en vermijden van inname. - Laat de oplossing afkoelen aan RT en voeg 50 mL van de 10 x PBS stamoplossing. Breng de pH op 7.4 met NaOH/HCl met behulp van een pH-meter.
- Voor 500 mL 4% PFA in 1 x PBS, los 20 g paraformaldehyde in 450 mL gedestilleerd H2O.
- Vooraf warm 600 mL 1 x depolarisatie buffer en 10 mL cel kweekmedium tot 37 ° C in het waterbad.
- Voeg 1 mL muis anti-Syt1 antistof (kloon 604.2) naar de 1 x depolarisatie buffer en vortex gedurende 10 seconden.
- Verwijderen en verwijderen van de cel cultuurmedium van de cellen. Voeg 200 mL van het mengsel van de depolarisatie-antilichaam elk goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 in de incubator.
- Verwijderen en verwijderen van de depolarisatie-antilichaam-mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer.
- Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 300 mL 4% PFA in 1 x PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 x PBS.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
4. immunocytochemie
- 50 mL blokkeerbuffer voor te bereiden.
Opmerking: Blokkeerbuffer kan worden bewaard bij-20 ° C voor enkele maanden.- Los 2,5 g van sacharose en 1 g bovien serumalbumine (BSA) in 5 mL 10 x PBS stamoplossing. Voeg 1,5 mL 10% wasmiddel stamoplossing. Roer de oplossing totdat alle onderdelen goed hebben opgelost en gedestilleerd H2O toevoegen tot het bereiken van een eindvolume van 50 mL. Aliquot de oplossing en het bevriezen van de aliquots voor opslag.
- Verdun het antilichaam van het secundaire, fluorophore-combinatie (gericht tegen de primaire Syt1-antilichaam-soorten) in 200 mL blokkeerbuffer in elk putje bij een verdunning van 1:1000.
- Verwijderen en verwijderen van de PBS 1 x van elk putje met een dekglaasje aan.
- Voeg 200 mL van het blokkeren van de buffer-antilichaam mix aan elk putje en incubeer gedurende 60 minuten op RT.
Let op: Omdat de secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn, alle stappen vooruit moeten worden uitgevoerd in het donker. - Na incubatie, door de cellen te wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 mL 1 x PBS.
- De coverslips op Microscoop dia insluiten met het insluiten medium.
- Voeg een 7 mL druppel medium op het microscoopglaasje te embedding. Verwijder het dekglaasje aan uit de 24-well plaat door tillen met een spuit en het grijpen met een tang.
Let op: Cellen op het oppervlak van het dekglaasje aan zijn gemakkelijk beschadigd, waardoor deze pincet moeten met zorg worden behandeld. - Dompel het dekglaasje aan in gedestilleerd water te verwijderen van de PBS en droog het zorgvuldig door het aanraken van een van de randen tot een zacht weefsel.
- Spiegelen het dekglaasje aan op de insluiten middellange druppel, zodat de uitvoering van de cellen van het microscoopglaasje zijde, waardoor de cellen te embedding in het insluiten medium.
- Voeg een 7 mL druppel medium op het microscoopglaasje te embedding. Verwijder het dekglaasje aan uit de 24-well plaat door tillen met een spuit en het grijpen met een tang.
- Laat de dia's te drogen onder de motorkap voor 1-2 h (dek ze Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. de microscopische analyse
- Nadat de coverslips droog is, plaats ze onder de microscoop met de doelstelling en de camera.
- De belichtingstijd voor elk kanaal zodanig aanpassen dat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden.
Opmerking: Hoewel de belichtingstijd tussen de kanalen variëren kan, moet het constant voor één kanaal om vergelijkbaarheid tussen de coverslips. - Verwerven van meerkanaals beelden voor 10 regio's van belang (ROIs) per dekglaasje aan. Controleer de ROI bevat axonale processen van een transfected neuron door het controleren van GFP-fluorescentie, die moet worden punctate.
6. statistische analyse
- De beelden als .tif-bestanden exporteren. Laden van de beelden in OpenView18 door te klikken op bestand | Load image-bestand.
- Kies de afbeelding van de Synaptophysin-mOrange als kanaal 1, het beeld van de Rogdi-GFP/mGFP zoals 2-kanaals en het beeld van de fluorescentie Alexa647 als kanaal 3.
- Drempel de ROIs.
- Klik op analyse | Plaats gebied over puncta. Kies waarden voor drempel en Delta intensiteit zodat bij visuele inspectie, diffuse fluorescentie is uitgesloten, waardoor alleen punctate signalen naar het beeld van kanaal 1 (vertegenwoordigt Synaptophysin-mOrange fluorescentie). Houd de dezelfde drempel voor alle afbeeldingen.
- Deze ROIs naar de bijbehorende zender 2 (GFP-Rogdi/mGFP fluorescentie) en 3 (Syt1-fluorescentie) van elk gebied dekglaasje aan overbrengen door te klikken op nu uitvoeren.
Opmerking: De ROIs moeten alleen worden overwogen indien de cel dubbel-transfected. Bij deze methode moet mOrange - en GFP-fluorescentie duidelijk zichtbaar zijn. - Sla de gegevens in de analyse log-editor door te klikken op logboekgegevens.
- Open de editor log analyse op het tabblad Windows en kopieert u de waarden voor elk kanaal. De waarden voor de afzonderlijke kanalen in een werkblad plakken.
- Het bepalen van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het Syt1-kanaal op de ROI in beide transfectie voorwaarden (GFP-Rogdi en mGFP).
- Toepassing van passende statistische proeven zoals de Student t-test om te bepalen van verschillen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een verwacht resultaat van deze aanpak is het lokaliseren van ongeveer 50 double-transfected neuronen per dekglaasje aan bij een dichtheid van 50.000 neuronen per putje. De axon van elk neuron wordt verwacht om te laten zien van meerdere hotspots van fluorescently-tagged Synaptophysin accumulatie, clusters ofSVs aangeeft. Op functionele presynaptische sites colocalizes de recombinante Synaptophysin signaal met punctate Syt1 fluorescentie. Het gebruik van dubbele transfectie, is GFP-Rogdi als de proteïne van belang (Figuur 1) of mGFP als het besturingselement mede uitgedrukt met recombinant Synaptophysin.
In dit experiment analyseren we SV recycling op presynaptische plaatsen in neuronen uiten GFP-Rogdi of mGFP. Als het besturingselement eiwit, mGFP, is homogeen verspreid over de hele cel, maar haar invloed op synaptic sites nog worden onderzocht, moet dan is het noodzakelijk mede transfect een tweede eiwit dat presynaptically wordt verrijkt, fluorescently gelabeld Synaptophysin.
Zoals eerder beschreven, ondergaan cellen depolarisatie-geïnduceerde zender release. Dientengevolge, duren functionele synapsen Syt1 antilichamen toegevoegd aan het medium. Na immunolabeling de Syt1 antilichaam met een fluorescently gelabeld secundair antilichaam, is de omvang van Syt1 opname ten slotte gekwantificeerd aan de hand de immunosignal (Figuur 2).
Figuur 1. Dubbel-transfected cellen. Het gezichtsveld toont een dubbel-transfected cel GFP-Rogdi (A) en Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin is een overvloedige synaptic vesikel eiwit. De recombinante variant kan worden gebruikt voor het labelen van synaptic los. Het patroon van de lokalisatie van GFP-Rogdi lijkt op die van Synaptophysin-mCherry (C). Schaal bars = 10 μm. Vakken geven aan 2.5 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. GFP-Rogdi op functionele synapsen. Live opname van Syt1 werd uitgevoerd in dubbel-transfected cellen, uiting geven aan hetzij de mGFP (groen) en de Synaptophysin-mOrange (rood; A-D) of GFP-Rogdi (groen) en Synaptophysin-mOrange (rood; E-H). Syt1 antilichaam opname werd uitgevoerd met behulp van een muis monoklonaal antilichaam gericht tegen het luminal domein van Syt1. Na PFA fixatie, werden cellen gekleurd met konijn anti-GFP antilichaam. Secundaire antilichamen (anti-konijn Alexa 488 en anti-muis Alexa 647) werden toegevoegd voor het opsporen van GFP of GFP-Rogdi en Syt1, respectievelijk. Autofluorescence van Synaptophysin-mOrange werd gebruikt voor het detecteren van de presynaptische terminals (B en F). Punctate Syt1 immunofluorescentie geeft aan sites van vesikel recycling (blauw; C en G). Merk op dat de meerderheid van de Syt1-geëtiketteerden synapsen zijn gelokaliseerd aan niet-transfected neuronen. GFP-Rogdi was gericht op actieve synapsen en veranderde niet synaptische vesikel recycling (I). 3 onafhankelijke cultuur experimenten werden uitgevoerd (N = 3). Ten minste 3 coverslips van elke cultuur (totaal 10) werden gebruikt voor de analyse. Ten slotte, 3 gebieden per dekglaasje aan werden geanalyseerd (n = 30). Student´s t-test toonde geen significant verschil. Schaal bars = 10 μm. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.). "N.s." geeft geen betekenis. Dit cijfer is gewijzigd van Riemann et al. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn drie testen routinematig gebruikt bij het bestuderen van synaptic Vesikel (SV) recycling. De eerste twee omvatten het gebruik van een) fluorescerende styryl kleurstoffen zoals FM1-43 (die nemen in membranen, bij endocytose in organellen omhoog worden genomen en worden uitgebracht na exocytose); en b) fluorescently gelabeld recombinante eiwitten van SV (die op overexpressie, integreren in de eiwithoudende recycling machines). Als de bijgevoegde fluorophores hun fluorescentie afhankelijk van de pH wijzigen, kunnen ze worden gebruikt om te controleren van wijzigingen tussen de zure interieur voor een SV en de pH van het extracellulaire medium. De recombinante eiwitten gelabeld met een pH-gevoelige variant van GFP heten Phluorins. De twee tests besproken geweest beide featured eerder19,20, en de voors en tegens van elk geweest ook gereviseerde21.
Hier beschrijven we een derde, gevestigde methode4,5,6,7,9,14. Om te testen SV recycling, profiteren we van het feit dat het luminal domein van vesikel-geassocieerde proteïne Synaptotagmin-1 (Syt1) wordt blootgesteld aan het celoppervlak van exocytose. Eerst voegen we een antilichaam gericht tegen het luminal domein aan het kweekmedium, die vervolgens in beslag door het blaasje tijdens SV recycling genomen wordt. De opname van dit antilichaam is gevisualiseerd en gekwantificeerd met immunofluorescentie. U kunt ook kan een direct gelabeld Syt1-antilichaam worden gebruikt. Het label kan worden pH-onafhankelijke, rapportage van de lokalisatie van het Syt1-antilichaam zowel binnen als op het buitenoppervlak van SVs of pH-afhankelijk, rapportering lokalisatie gebaseerd op wijzigingen van de fluorescentie. Ook beschrijven we de combinatie van deze SV recycling assay met dubbele transfectie van beschaafde neuronen te testen of een proteïne van belang, GFP-Rogdi, doelen functionele synapses en SV recycling treft. GFP-Rogdi is specifiek voor deze aanpak; dezelfde vragen kunnen echter worden aangepakt voor elk eiwit van belang.
Deze test werd geïntroduceerd in 1992 om te controleren de spontane recycling van SVs4 en werd verder ontwikkeld door de zelfde groep te controleren evoked SV recycling van12. Hun experimenten opgezet dat Syt1 opname is gevoelig voor clostridial neurotoxines, die SV exocytose12blokkeren. Ze toonde ook aan dat stimulatie van culturen door depolarisatie bij 37 ° C de internalisering van Syt1 antilichamen in vergelijking met 1) culturen die worden gehouden op het ijs, waardoor de meeste endocytose verbetert, en 2) culturen geïncubeerd bij 37 ° C zonder stimulatie, die zorgt voor spontane recycling, maar doet niet roepen recycling12,22. De bepaling kan gemakkelijk vergelijken SV recycling tussen twee voorwaarden, zoals met en zonder een molecule van belang. In het bijzonder dit protocol is gericht op het vergelijken van Syt1 antilichaam opname in de aanwezigheid ten opzichte van de afwezigheid van een bepaalde overexpressie eiwit. Het protocol kan worden uitgebreid als de relatieve bijdragen van oppervlak-bindend, spontane recycling en evoked recycling moeten worden beoordeeld. Bijvoorbeeld, voorkomt het broeden van neuronen op ijs zonder stimulatie endocytose, elke oppervlakte binding van het antilichaam Syt1 onthullen. Het broeden van de neuronen bij 37 ° C in basale oplossing met tetrodotoxine voorkomt actiepotentiaal propagation, onthullend spontane recycling. Dus, drachtige neuronen bij 37 ° C onder stimulerende voorwaarden kan onthullen de mate van evoked SV recycling.
Levende cellen zijn gevoelig voor ideale fysiologische omstandigheden; Daarom, onderhoud, transfectie en depolarisatie buffers moeten altijd worden getest voor fysiologische parameters, met inbegrip van pH en temperatuur. Terwijl de depolarisatie buffers kunnen worden doorgegeven via steriele filters nadat de pH is afgesteld, zijn transfectie buffers gevoelig voor steriele filteren. Dus we breng de pH, houd het bevroren tot gebruik, en draai het in een centrifuge tafelblad om alle bacteriën pellet. Voor transfectie is het essentieel voor het mengen van de buffer voldoende om ervoor te zorgen van de vereniging van de plasmide met de kristallen calciumfosfaat. De transfectie van het calciumfosfaat werkt het beste op dag in vitro (DIV) 2-4. Tagged Synaptophysin, een transmembraan eiwit van SV, gebruiken we als merkstof voor de identificatie van de presynaptische terminals in de transfected neuronen. Tagged versies van andere SV eiwitten zoals SV2, Synapsin, en VAMP/Synaptobrevin of actieve zone moleculen zoals fagot, RIM, Munc13-1 en CAST kunnen ook worden gebruikt.
Zowel mCherry als mOrange stoten rode fluorescentie. Hoewel mCherry lichter dan mOrange is, heeft grotere emissie bij lange golflengten dan mOrange. Voor de beeldvorming van de triple fluorescentie met GFP, een rode kleurstof en een kleurstof uitstoten in de 700 nm-bereik, daarom mOrange een betere optie dan mCherry. Voor dubbele fluorescentie met GFP en een rode kleurstof mogelijk mCherry gunstig zijn omdat het de helderder kleurstof. Om te garanderen sparse transfectie, moet de transfectie mix niet langer dan 60 minuten worden geïncubeerd. Het is ook belangrijk dat incubatie in een depolarizing buffer is de juiste lengte te bieden van exocytose van alle blaasjes. Langdurige blootstelling aan de depolarizing buffer moet echter worden vermeden. Tijdens Beeldacquisitie is het ook essentieel dezelfde blootstelling tijden en de licht intensiteit om kwantificeerbare vergelijking tussen verschillende sets van experimenten wilt toepassen.
Tot slot, tijdens beeldanalyse, ons protocol bevat verscheidene overwegingen. Voor één interessegebied tonen van recombinante Synaptophysin puncta, ligt de drempel lager-intensiteit zodat diffuus fluorescentie is uitgesloten. Deze drempel wordt vervolgens getest op andere gebieden en de coverslips te observeren de soortgelijke integratie van punctate signalen en uitsluiting van diffuse fluorescentie. Zodra een passende drempel is geïdentificeerd, wordt deze toegepast op alle beelden, punctate regio's van belang (ROIs) produceren in de recombinante Synaptophysin (gelabeld met mCherry of mOrange) kanaal. Tot slot, Syt1 intensiteit wordt bepaald voor de ROIs9.
Onze aanpak is geoptimaliseerd voor sparse transfectie. We analyseren presynaptische functie in een complexe omgeving waar SV recycling in de axonen van transfected neuronen omgeven door untransfected neuronen. In deze set-up toelaat dubbel-transfectie ons om neuronale functie manipuleren en zoek de presynaptische terminals van de transfected neuronen. Transfected presynaptische neuronen die contact maken met untransfected postsynaptisch neuronen is een belangrijke factor bij de beoordeling van een presynaptische neuron effecten op SV recycling. De instelling kan ook gemakkelijk worden aangepast om te testen of een postsynaptisch manipulatie presynaptische wijzigingen veroorzaakt. In dit geval, sparse transfectie van neuronen met een eiwit dat is gericht op postsynaptisch sites zal het lokaliseren van de postsynaptisch sites van de transfected neuronen, en opname van de Syt1 kan worden bepaald op synaptic los van untransfected neuronen.
Wanneer sparse transfectie niet nodig is, kunnen verschillende transfectie protocollen worden toegepast. Transfectie met Lipofectamine op div-7 - 8 resultaten in hogere tarieven van de transfectie, maar het houdt bijvoorbeeld ook sterkere uitdrukking in elke transfected cel9. Bovendien, virale transductie kan resulteren in expressie in bijna 100% van beschaafde neuronen14,23,24. In experimenten om te controleren of SV recycling, kan transfectie worden uitgevoerd voor een enkele eiwit of helemaal weggelaten. Bijvoorbeeld, wanneer algemene synaptic recycling is vergeleken tussen de neuronen van wildtype en genetisch gemodificeerde is muizen, labelen van individuele neuronen door transfectie niet nodig. Daarnaast maakt dit immunolabeling van endogene eiwitten. Als de transfectie mislukt, is het belangrijk te testen van de transfectie buffer met een gevalideerde plasmide of gebruiken van een buffer met een pH van verschillende (Zie voorbereiding van transfectie buffer). Met behulp van endotoxinen gratis DNA preparaten lijkt ook te zijn cruciaal. Immunokleuring geïnternaliseerd Syt1 antilichamen werken in zowel PFA-fixed en methanol vaste monsters. Ook opgemerkt moet worden dat de autofluorescence van GFP en RFP na methanol fixatie verloren is. Als GFP of RFP worden vertaald in methanol-vaste cellen moet, moet deze eiwitten immunolabeled. Als Syt1 opname mislukt, moeten depolarisatie tijd en K+ concentratie in de depolarisatie buffer dienovereenkomstig worden gewijzigd. Vele variaties van het protocol zijn gepubliceerd, met depolarisatie tijden variërend van 90 s25 tot 60 min12en K+ concentraties van 45 mM, 50 mM, 70 mM en 110 mM6,25,26 ,27. Als terugkerende activiteit moet worden voorkomen, kunnen glutamaat-receptor blokkers ook worden toegevoegd tijdens de depolarisatie. Tot slot, terwijl hoge K+ depolarisatie wordt gezien als de sterkste prikkel, actie potentieel kan leiden tot SV recycling via meer fysiologische stimuli22,28. Verschillen in Syt1 antilichaam opname werkzaamheid kunnen optreden in rat en muis culturen. In onze werkwijze, de monoclonal muis anti-Syt1 kloon 604.2 (RRID:AB_993036) produceert sterkere kleuring in rat culturen dan in muis culturen, terwijl de polyklonale konijn anti-Syt1 antistof (RRID:AB_11042457) produceert sterkere kleuring in muis culturen, maar enkele notities van voorzichtigheid worden hieronder besproken.
Verschillende waarschuwingen met betrekking tot het gebruik van anti-Synaptotagmin antilichamen voor opname in SVs moeten worden beschouwd. Eerst, N-glycosylation van asparagine 24 van Syt1 bevordert de endocytotic opname van de eiwitten29,30. Asparagine 24 maakt deel uit van het luminal domein van Syt1. De muis en konijn antilichamen die we gebruiken gericht zijn tegen aminozuren 1-12 en 1-8, respectievelijk, van Syt1. Terwijl hun epitopes elkaar niet met de N-glycosylation site overlappen, kan niet sterische hinder of, omgekeerd, een inductie van ICT door antilichaam-bindende worden uitgesloten. Mutatie van de N-glycosylation site in Syt1 verandert niet de kinetiek van endocytose en de doelgerichtheid van Syt1 naar SVs. Het verhoogt de Fractie van de Syt1 nog op het oppervlak van de buitenmembraan plasma wanneer endocytose wordt veroorzaakt door zwakke prikkels. Wanneer er sterke prikkels, zoals hoge K+ depolarisatie, worden toegepast, wordt geen vermindering van de Syt1-opname30waargenomen. Over het algemeen als de antilichamen bemoeid met de N-glycosylation site op enigerlei wijze ze misschien veroorzaken een verandering in de SV endocytose in vergelijking met antilichaam-vrij voorwaarden, maar deze wijziging moet ongeveer gelijk zijn voor het experiment (in ons geval de overexpressie van GFP-Rogdi) en het besturingselement (in ons geval de uitdrukking van GFP). Bovendien kunnen polyclonal antilichamen waarschijnlijk meer voor het opwekken van sterische problemen en crosslinking dan monoclonal antilichamen, omdat een grotere exemplaaraantal van antilichamen aan de epitoop bindt. Wij zijn zich niet bewust zijn van systematische studies vergelijken de beschikbare antilichamen met elkaar; Sommige studies hebben echter de geldigheid van bepaalde antistoffen gericht. Bijvoorbeeld, wanneer SV recycling kinetiek werden bestudeerd met behulp van het monoclonal muis anti-Syt1 antistof kloon 604.2 en Synaptophluorin-fluorescentie wijzigingen in een directe vergelijking, werden vergelijkbare resultaten verkregen, het valideren van het gebruik van deze antistof28. Laden van SVs met polyklonale konijn Syt1 antilichamen en opname van synaptische transmissie electrophysiologically onthuld dat de geladen synapsen synaptische transmissie op een manier die doet denken aan de verlies-of-function mutanten van Syt1 had verminderd. Daarom is deze polyclonal antilichamen synaptische transmissie beïnvloeden. De werkelijke opname bleek zowel spontane en evoked recycling, suggereren dat een polyclonal antilichaam geschikt om te controleren van een ronde is van AVP recycling, maar voorzichtigheid moet worden genomen bij het interpreteren van de resultaten na opname van deze antilichamen31.
Drie tests worden routinematig gebruikt bij het bestuderen van SV recycling, waaronder membraan etikettering met styryl kleurstoffen, overexpressie van Phluorins, en de Syt1-antilichaam opname hier uitgevoerd. Alle drie tests kunnen worden gebruikt om te bepalen van endocytotic en exocytotic benen van SV recycling. Terwijl alle drie tests krachtige voordelen hebben, heeft elk ook een beginsel waarschuwing. FM kleurstoffen label van het oppervlak van de gehele cel en worden overgenomen in de cel met alle recycling membranen. Phluorins moet worden ingevoerd door overexpressie. Syt1-antistoffen label de endogene proteïne, maar sommige antilichamen van invloed kunnen zijn op zijn functie onder bepaalde voorwaarden. Elk voorbehoud kan wel op de juiste manier aangepakt21.
Over het geheel genomen heeft de Syt1 antilichaam opname assay diverse doeleinden gediend. Ten eerste, het werd gebruikt om selectief label SVs ondergaan spontane of evoked recycling, respectievelijk28,31,32,33. Ten tweede, het werd gebruikt om te bepalen van het effect van een geneesmiddel of eiwit op de mate van SV recycling; Als u bijvoorbeeld wilt weergeven dat BDNF verbetert zowel spontane en evoked SV recycling6. Ten derde, het werd gebruikt om te bepalen van het aantal synapsen met hergebruik van SVs als een percentage van het totale aantal morfologisch gedefinieerde synapsen34,35. Dit bleek dat het percentage van de synapsen recycling SVs25 het postsynaptisch cel-adhesie molecuul Neuroligin-1 overexpressing verhoogt en dat het percentage van de vermindering van het uiten van AMPA-type glutamaat receptoren afneemt synapsen recycling SVs, verhoging van het percentage van presynaptically stille synapsen36. Bovendien is de bepaling werd gebruikt voor het analyseren van de mobiliteit van gelabelde SVs27 en om te bepalen van de lokalisatie van Syt1 met behulp van nanoscopy13,22,33. Ten slotte, wordt deze methode nog steeds gebruikt om te testen of bepaalde eiwitten lokaliseren naar functionele synapsen9. Het antilichaam Syt1 kan ook worden gebruikt voor de lange termijn studies, waar het antilichaam blijft in de neuronen voor dagen na opname37. Dit kan worden gecombineerd met een tweede ronde van de opname met behulp van een afzonderlijk gelabeld antilichaam van Syt1 of een antilichaam gericht tegen het luminal domein van een verschillende SV-eiwit. Hierdoor is het testen van die SVs gerecycleerd aanvankelijk en recycle die door het einde van een experiment. Het zou interessant zijn om te passen deze test naar meer intact modelsystemen, zoals acute segmenten en organotypic segment culturen. In principe de bepaling van de opname kunt vergelijking van weefsel van wildtype en genetisch gemodificeerd dieren of kan worden gecombineerd met virale levering of biolistics, dwz., een "gene gun," te manipuleren eiwituitdrukking in deze modelsystemen. In dergelijke systemen, kan de invloed van bepaalde verstoringen op presynaptische machines, gecontroleerd door de bepaling van de opname, en de dynamiek van de netwerk gelijktijdig worden bestudeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Irmgard Weiss voor deskundige technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de DFG via het Cluster of excellence voor microscopie op het nanometer bereik en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB, B1-7, T.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K.
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
