Summary
シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス マーカーおよび興味の蛋白質を表現する容量をリサイクル、シナプス小胞のシナプス前のサイトを見つけて、興味の蛋白質の役割を決定することができます。
Abstract
アクティブのシナプス前神経終末では、シナプス小胞は exo とエンドサイトーシスのサイクルを受けます。リサイクル中に SV 膜貫通タンパク質の内腔のドメインは細胞表面でさらされます。これらの蛋白質の 1 つは、シナプトタグミン 1 (Syt1) です。培養液に追加した Syt1 の内腔のドメインに対する抗体は、エキソ エンドサイトーシス サイクル中にとられます。この吸収は SV が再資源化量に比例して蛍光抗体法で定量化することができます。ここでは、培養海馬神経細胞の二重トランスフェクション Syt1 抗体吸収と組み合わせています。これにより (1) 遺伝子組換えシナプス マーカー シナプトフィジン発現に基づくシナプス前サイトのローカライズ (2) Syt1 吸収を使用して機能を判断し、(3) 対象を特徴付けることと興味、GFP Rogdi の蛋白質の効果。
Introduction
シナプス小胞のリサイクルを勉強は、シナプス前のプロパティが変更されたシナプス可塑性中またはシナプス機能の摂動応答の方法を決定するのに重要です。抗体吸収シナプトタグミン 1 (Syt1) を勉強して SV リサイクルの量を測定する方法の 1 つを提供します。Syt1 は Ca2 +センサーとして機能し、神経伝達物質1,2の分泌のリリースに必要な SV 関連タンパク質です。SV 外 C 末端の細胞質ドメインと SV3中 N ターミナル内腔ドメイン膜貫通蛋白質であります。エキソサイトーシス、時 Syt1 の内腔のドメインは外部メディアに露出になります。この外部の媒体には、エンドサイトーシス中に内面になる細胞質ドメインに対する抗体を追加します。これらの抗体は、どちらかはあらかじめ fluorophores が付いてまたは二次抗体4,5,6,7immunostained 共役することができます。結果 immunosignal の蛍光強度は SV リサイクルの量に比例します。このアプローチは、6、8をリサイクル構成と脱分極誘導の SV を決定する使用できます。
Syt1 取り込みアッセイは、料理のほぼすべてのセルにウイルス媒介性遺伝子導入後、または少数の細胞の疎なトランスフェクション後に実行できます。本手法は、リン酸カルシウムの9を使用してプライマリの海馬ニューロンのスパース ダブル トランスフェクションとアッセイを兼ね備えています。我々 は神経終末を検索し、Rogdi の興味の私達の蛋白質をノザン蛍光タグ シナプトフィジン、presynapses で蓄積する知られていた遺伝子組換えマーカー蛋白質を使用します。Rogdi ターゲット機能がシナプスし、リサイクル SV に影響を与えるかどうかをテストことができます。Rogdi 遺伝子はもともと障害メモリ10によって特徴付けられるショウジョウバエ変異体の画面で同定されました。人間では、Rogdi 遺伝子の変異は、Kohlschütter Tönz 症候群と呼ばれる稀で、壊滅的な病気を引き起こします。患者は苦しむエナメル奇形、pharmacoresistant てんかん、精神運動遅延;しかし、遺伝子産物の細胞内局在は、とらえどころのない11を残った。したがって、Syt1 取り込みアッセイは、機能的なシナプス9時 GFP 付けられた Rogdi の局在化のため重要な証拠を提供しました。
この摂取方法には、いくつかの利点があります。まず、SV リサイクル観察できます両方リアルタイムでライブ イメージング7,12, を実行し、後に固定6,9 Syt1 蛍光ラベルの蛍光強度を測定することによって。さらに、いくつかの Syt1 抗体バリエーションが開発されています。固定後の免疫染色標準プロトコルの二次抗体を標識できますタグなしの変形そして既にアタッチされている蛍光ラベルを持つ共役事前の変形があります。最後に、抗体を用いた蛍光は使用できる市販のセカンダリまたは共役染料の大規模な選択のため有利です。
とき固定と染色ニューロンそれはまた追加タンパク質の染色し、共局在解析を実行することが可能。これはリサイクルの SVs に関連して保存されている場所を決定することができます。蛍光ラベルの強度は SV リサイクル量の直接測定です。さらに、抗体は選択的に Syt1 含む構造、高い特異性と小さなバック グラウンド蛍光4の結果をラベルします。脱分極のバッファーや電気刺激プロトコル9,12,13,14など、異なる刺激のプロトコルも使用できます。ただし、基底の SV のリサイクルは神経文化15を刺激することがなく測定できます。
本手法は特に固定後二次抗体反応二重 transfected ニューロン Syt1 抗体吸収を対処します。しかし、我々 はプロトコル固有のニーズに適応する機会を視聴者に我々 の議論のアッセイのすべての日常的に使用された変形を参照します。
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Protocol
生きている動物を用いた研究を行ったないです。文化は、認可を受けてローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されたセルを取得する動物の安楽死を含む実験番号 T10/30 です。承認されたプロトコルで実験を行った。
1. 主な海馬細胞培養
- 日 1916,17に海馬の解離細胞の培養を準備します。50,000-60,000 細胞/ウェルの密度で 24 ウェル料理ポリエチレンイミン (PEI) でコーティング 12 mm coverslips に細胞をプレートします。商工会議所と段階の対照の光学を数えるセルを用いた密度を確認します。
- 3 日間 (1 日体外(DIV) 3) 5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで 24 ウェル プレートでニューロンの文化.
- 透過光顕 (例えば段階の対照の光学 10-20 倍の倍率で) を使用して細胞の健康の指標、coverslips を評価します。健康の次のインジケーターを確認: 明確なフェーズ コントラスト ハロー、ビーズ構造を持たない神経突起と相馬のクラスタ リングや突起をバンドルします。
2. トランスフェクション
注: 次のプロトコルは、3 井戸のダブル トランスフェクションを指します。ただし、プロトコルは 4 井戸の十分な量を準備するときに最適です。
- エルレンマイヤー フラスコ 500 mL のトランスフェクション バッファー (274 mM NaCl、KCl、10 mM 1.4 mM Na2HPO4、15 mM グルコース、42 mM HEPES) を準備します。
- 400 mL の三角フラスコに蒸留水に HEPES の 5.0 g、グルコース、1.35 g Na2HPO40.095 g KCl の 0.37 g 塩化ナトリウム 8.0 g を溶かします。
- PH メーターを使用して 1 M NaOH で 6.95 に pH を調整します。
- 500 mL の蒸留水で音量を調整し、pH 計を用いて pH を確認してください。
- 注 1 により pH 値が次のトランスフェクション バッファーの 20-30 mL 因数トランスフェクション バッファーに M NaOH: 6.96、6.97、6.98、6.99、7.00、7.01、7.02、7.03、7.04、7.05、7.06、7.07、7.08、7.09、7.11。
注: トランスフェクション バッファーの pH は、トランスフェクション効率の重要です。 - 7.11 に 6.96 から各 pH 値をテスト、バッファーが transfected セルの最大数につながるトランスフェクションをテストします。2.2 2.11 および検証されたプラスミドを gfp で説明したトランスフェクション法を使用します。どのバッファーの最高の作品を評価するトランスフェクション バッファー pH 値ごとに coverslip あたり transfected セルの数を決定します。
- 分注 2 mL の遠心管に最も高いトランスフェクション効率を持つバッファーは凍結し、-20 ° C でチューブを格納
- あらかじめ減少血清培地、細胞培養培地と水のバスで 37 ° C に蒸留水を温めます。
- 1.5 mL 遠心チューブにトランスフェクション ミックスを準備します。滅菌の労働条件を確保するため層流フードの下で動作します。
- 各エンドトキシン フリー DNA (シナプトフィジン mOrange と mGFP/GFP-Rogdi) の 4 μ g と 2 M 塩化カルシウムのミックス 7.5 μ。1.5 mL 遠心チューブに 60 mL の容量に到達する水を追加します。
- 60 mL のトランスフェクション バッファーをミックスに追加します。最良の結果を得るためには、渦の DNA ミックスを軽く振りながら滴下トランスフェクション バッファーを追加します。
- 室温 (RT) で 20 分間インキュベートします。培養時間の間に層流フードの横にチューブを配置することによって培養管を振動を避けてください。
- 層流フードの下で 1000 mL のピペットを使用して井戸から細胞培養培地 (「馴化培地」) を削除、インキュベーターで別の容器に保存できます。
- 低血清培地 500 mL を各ウェルに追加します。20 分潜伏期間 (ステップ 2.3.3) が終わるまでは、37 ° C および 5% の CO2のセルを孵化させなさい。
- 各ウェルに数滴をピペッティングによるトランスフェクション ミックス 30 mL を追加します。チューブの底部の残基を破棄します。
- すべての井戸は、トランスフェクション ミックスで指定されている後、培地でトランスフェクション ミックスの配分を確保するため 24 ウェル プレートを軽く振る。
- 井戸を 37 ° C、5% CO2で 60 分間インキュベートします。
- 削除しトランスフェクション ミックスを破棄し、細胞培養液で 3 回洗います。各ウェルに細胞培養液の 1 mL と媒体のルート削除 750 mL で 30 秒間インキュベートして新鮮な媒体の同じ量を追加します。これを 3 回繰り返します。
注意: 洗浄のステップは重要です。最低媒体もそれぞれがない時間を保つ (すなわち。、取り外して交換する - も) 優しく洗浄媒体を追加。 - 削除し細胞培養液を破棄し、エアコン中--も 450 mL を追加します。
- 37 ° C、5% CO2 DIV 10 でインキュベーターで成熟したニューロンをしましょう。
3. 刺激と Syt1 吸収
注: 次のプロトコルは、3 の井戸に取り込みを適用します。ウェルズの他の数の脱分極の量を調整します。
- 50 mL の三角フラスコに 10 の x 脱分極バッファー (640 mM NaCl、KCl、700 mM 10 mM MgCl2、20 mM CaCl2, 300 mM グルコース、200 mM HEPES、pH 7.4) を準備します。
注: 脱分極バッファーは 4 ° C で数週間保存できます。非脱分極性のソリューションも使用する場合、準備に 10 1290 mm で構成される x Tyrode のソリューション NaCl、KCl、10 mM MgCl2、50 mM 20 mM CaCl2, 300 mM グルコース、200 mM HEPES pH 7.4 を比較するために刺激誘起自然とリサイクルリサイクルしています。1 倍に希釈後、活動電位発生をブロックを使用する前にテトロドトキシンの 1 μ M を追加します。- NaCl、KCl、MgCl2-6 H20 0.1 g、CaCl2-2 H2O の 0.15 g、グルコース 1 H2O の 3.0 g と 50 mL の三角フラスコに蒸留水で HEPES 2.38 g の 2.61 g 1.87 g を溶解します。水酸化ナトリウムと滅菌フィルター ソリューションで pH を調整します。1 倍の濃度を達成するために蒸留水で、バッファー 1:10 を希釈します。
- 1 × PBS (pH 7.4) で刺激した後固定用 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。
- 4% の 500 mL の 1x PBS で PFA 分解蒸留 H2o. の 450 mL のパラホルムアルデヒドの 20 g
注: ソリューションを加熱、溶解のスピードが、PFA が崩壊する、ソリューション 70 ° C 以上の加熱はしないでください。
注意: PFA は有毒、潜在的発癌性および催奇形性です。PFA を使用するときは、手袋を着用、発煙のフードの下で働く、経口摂取を避けます。 - Rt ソリューションを冷ます、10 x PBS 原液 50 mL を加えます。水酸化ナトリウム/塩酸 pH メーターを使用して 7.4 に pH を調整します。
- 4% の 500 mL の 1x PBS で PFA 分解蒸留 H2o. の 450 mL のパラホルムアルデヒドの 20 g
- 事前脱分極バッファー x 1 600 mL とセル培地水のバスで 37 ° C の 10 mL を温めます。
- 脱分極のバッファーと渦 x 1 に 10 秒間マウス抗 Syt1 抗体 (クローン 604.2) の 1 つの mL を追加します。
- 取り外して細胞から細胞培養液を廃棄します。まあ各インキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 5 分間インキュベートし脱分極抗体ミックス 200 mL を追加します。
- 削除し脱分極抗体ミックスを破棄し、細胞培養液で 3 回洗います。各ウェルに細胞培養液の 1 mL と媒体のルート削除 750 mL で 30 秒間インキュベートし、新鮮な媒体の同じ量を追加します。3 回繰り返します。
- 削除し細胞培養液を破棄し、4% の 300 mL を追加 1x PBS で PFA。4 ° C で 20 分間インキュベートします。
- 1x PBS で 5 分ごとに 3 回洗います。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
4. 免疫細胞化学
- 50 mL のブロック バッファーを準備します。
注: 数ヶ月-20 ° C で保管できるバッファーをブロックします。- 10 x PBS 原液 5 mL に 2.5 g のショ糖とウシ血清アルブミン (BSA) の 1 g を溶解します。10% 中性洗剤ストック溶液 1.5 mL を追加します。すべてのコンポーネントが適切に溶解しているし、50 mL の最終的なボリュームに到達するまで蒸留 H2O を追加までソリューションをかき混ぜます。因数ソリューション、ストレージのための因数を凍結します。
- 200 mL の 1: 1000 希釈でのブロック バッファーの (プライマリ Syt1 抗体種に対して指示される) セカンダリ、fluorophore つながれた抗体を希釈します。
- 取り外してよく観察を含む各から 1 × PBS を廃棄します。
- 各ウェルにバッファー抗体ミックスをブロックの 200 mL を追加し、室温 60 分間インキュベート
注意: 二次抗体は感光性であるために前進のすべての手順は暗闇の中で実行する必要があります。 - インキュベーション後、1 mL の 1x PBS で 5 分間、3 回洗浄します。
- 埋め込みメディアと顕微鏡のスライド coverslips を埋め込みます。
- 顕微鏡スライド上に媒体を埋め込みの 7 mL のドロップを追加します。24 ウェル プレートから注射器でそれを持ち上げて、それを鉗子でつかんで、coverslip を削除します。
注意: カバーガラスの表面の細胞が簡単に破損している、ので、鉗子は、注意して処理する必要があります。 - PBS を外し、慎重に軟部組織への 1 つの端に触れることによってそれを乾燥に蒸留水に、coverslip を浸し。
- 細胞を運ぶ表面がそれによって埋め込み媒体にセルを埋め込み、顕微鏡スライドを向くように、埋め込みメディア液滴に coverslip を反転します。
- 顕微鏡スライド上に媒体を埋め込みの 7 mL のドロップを追加します。24 ウェル プレートから注射器でそれを持ち上げて、それを鉗子でつかんで、coverslip を削除します。
- 1-2 h のためのフードの下で乾燥するスライドを残す (光の露出を避けるためにそれらをカバー)、4 ° C で顕微鏡スライドのボックスに保管
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
5. 顕微解析
- Coverslips 乾燥後目的とカメラと顕微鏡下でそれらを配置します。
- いくつかのピクセルはグレー値の最大分布を確保するため露出オーバーすべてのチャネルのための露光時間を調整します。
注: チャンネル間露光時間が異なる場合があります、それはず、coverslips 間の比較可能性を確保するための 1 つのチャネルのための定数です。 - Coverslip の利子 (ROIs) の 10 の地域のためのマルチ チャンネル画像を取得します。投資収益率の点状される GFP 蛍光をチェックして transfected ニューロンからの軸索のプロセスが含まれていることを確認します。
6. 統計解析
- .Tif ファイルとしてイメージをエクスポートします。OpenView18にファイルをクリックして画像を読み込む |イメージファイルをロードします。
- チャネル 1 としてシナプトフィジン mOrange 画像、Rogdi-GFP/mGFP 画像 2、チャネル、およびチャネル 3 として Alexa647 蛍光画像を選択します。
- Roi のしきい値。
- クリックして分析|涙点の場所区域。のみ点状信号チャネル 1 のイメージ (表すシナプトフィジン mOrange 蛍光) を残して、拡散反射光蛍光が除外されて視覚検査時にしきい値とデルタの強度の値を選択します。すべての画像に同じしきい値を維持します。
- 今すぐ実行をクリックする (GFP-Rogdi/mGFP 蛍光) 対応するチャンネル 2 にこれらの Roi と coverslip 区分の 3 (Syt1 蛍光) を転送します。
注: Roi ダブル transfected セルがある場合考慮するべきのみ。このメソッドは、mOrange と GFP 蛍光ははっきりと見えるはずです。 - 分析ログ エディターにデータを保存するには、ログ データをクリックします。
- [ Windows ] タブの分析ログ エディターを開くし、各チャンネルの値をコピーします。別のチャンネルの値をスプレッドシートに貼り付けます。
- 両方のトランスフェクション条件 (GFP Rogdi および mGFP) で・ ロワで Syt1 チャンネルの平均蛍光強度を決定します。
- 有意差を決定する学生のt テストなど適切な統計テストを適用します。
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Representative Results
このアプローチの結果ウェルあたり 50,000 ニューロンの密度で約 50 倍 transfected ニューロン coverslip あたりの位置です。各ニューロンの軸索は、蛍光タグ シナプトフィジンの蓄積、クラスターの訓練を示す複数のホット スポットを表示する予定です。機能のシナプス部位で遺伝子組換えシナプトフィジン信号は点状の Syt1 蛍光 colocalizes します。ダブル トランスフェクションを使用すると、(図 1) 興味の蛋白質として GFP Rogdi またはコントロールと mGFP は組換えシナプトフィジン発現。
この実験では、GFP Rogdi または mGFP のいずれかを表現するニューロンのシナプス前サイトでリサイクル SV を分析します。制御タンパク質、mGFP、全体のセル全体に分散され均一共同ンエ濃縮されて第 2 蛋白質を使って必要があるし、シナプスのサイトでその影響がまだ検討するが、必要する場合、蛍光タグシナプトフィジン。
前述したように、細胞は脱分極誘導伝達物質放出を受けます。結果として、機能的なシナプスは、培地に添加 Syt1 抗体を取る。蛍光に分類された二次抗体と反応、Syt1 抗体後、Syt1 摂取量の範囲では immunosignal (図 2) を使用して定量化されます最後に。
図 1。ダブル transfected セル。ビューのフィールドは、GFP Rogdi (A) およびシナプトフィジン mCherry (B) を表現するダブルを発現させた細胞を示しています。シナプトフィジン、豊富なシナプス小胞蛋白質であります。その組み換え変形は、シナプス ボタンのラベル付けに使用できます。Synaptophysin-mCherry (C) の Rogdi GFP の局在パターンに似ています。スケール バー = 10 μ m。ボックスは、2.5 倍の倍率を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。機能性シナプスで GFP Rogdi.MGFP (緑) およびシナプトフィジン mOrange (赤; を表現するダブル transfected セル ライブ Syt1 取り込みを行ったA-D) GFP Rogdi (緑) やシナプトフィジン mOrange (赤;E-H)。Syt1 の内腔のドメインに対して指示されるマウスのモノクローナル抗体を用いた Syt1 抗体吸収を行った。PFA 固定後細胞はウサギ抗 GFP 抗体で染色しました。GFP や GFP Rogdi Syt1 をそれぞれ検出する二次抗体 (抗家兎アレクサ 488 と抗マウス Alexa 647) を追加しました。シナプトフィジン mOrange の蛍光は、シナプス前ターミナル (B と F) を検出する使用されました。点状の Syt1 蛍光を示すリサイクル (青で小胞のサイトC と G)。非導入のニューロンにシナプスの Syt1 ラベルの大半がローカライズされているに注意してください。GFP Rogdi アクティブなシナプスの標的にされ、リサイクル (I) シナプス小胞は変化しなかった。3 独立した文化実験を行った (N = 3)。それぞれの文化 (合計 10) から少なくとも 3 coverslips 使用した分析。Coverslip あたり 3 エリアを行った最後に、(n = 30)。Student´s t 検定は有意差を認めなかった。スケール バー = 10 μ m。誤差範囲 (S.E.M.) 平均値の標準誤差を表しています。「N. s.」意味がないことを示します。この図は、リーマンらから変更されています。9この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
日常的にシナプス小胞 (SV) リサイクルを研究するために使用 3 つの試金があります。最初の 2 つの使用を含む、) 蛍光スチリル色素など FM1-43 (これは膜に組み込む、エンドサイトーシス、中に細胞小器官にとられ、開口放出後にリリースされる);b) 蛍光付けられた (これは、過剰発現時にタンパク質のリサイクル機械を組み込む) 遺伝子組換えの SV 蛋白質。添付の fluorophores が付いて、pH によってその蛍光を変更する場合、は、エルサルバドルの酸性の内部と細胞中の pH の変化を監視する使用できます。GFP の pH に敏感なバリアント タグ組換えタンパク質は、Phluorins と呼ばれます。説明 2 つの試金は両方されている前に特色に19、20とそれぞれの賛否両論も見直し21をされています。
ここでは、3 分の 1、確立された方法4,5,6,7,9,14をについて説明します。SV のリサイクルをテストするため小胞蛋白質シナプトタグミン 1 (Syt1) の内腔のドメイン エキソサイトーシスによって細胞表面に露出するという事実の利点をとるまず、我々 は培養培地は、SV のリサイクル中が小胞によって、とらに内腔のドメインに対する抗体を追加します。この抗体吸収が可視化し、蛍光抗体法により定量化します。また、直接ラベル Syt1 抗体を使用できます。ラベルは、pH に依存している Syt1-抗体の内外、SVs の pH 依存性、外部表面に局在した蛍光変化に基づく報告ローカリゼーションを報告をすることができます。この SV リサイクル法興味、GFP-Rogdi、ターゲット機能のタンパク質はシナプスし、SV の循環に影響を与えるかどうかをテストするのには培養されたニューロンからダブル トランスフェクションの組み合わせについても述べる。GFP Rogdi はこの方法に特定ただし、同じ質問は興味のあらゆる蛋白質のため対処できます。
この試金は SVs4の自然リサイクルを監視する 1992 年に導入された最初と12をリサイクル誘発の SV を監視する同じグループによって更に開発されました。彼らの実験は、Syt1 吸収ブロック SV エキソサイトーシス12クロストリジウムの神経毒に敏感であることを設立しました。また、37 ° C で脱分極によって文化の刺激がほとんどエンドサイトーシスを防ぎ、氷の上に保持される 1) 文化と 2) 刺激なしの 37 ° C で培養した培養に比較して Syt1 抗体の内面化を高めることを示した、自発的なリサイクルが可能になりますが、リサイクルの12,22を呼び起こすはないです。アッセイは、SV リサイクルなど 2 つの状態間の興味の分子と容易に比較できます。特に、このプロトコルは特定の発現タンパク質の欠如と存在の Syt1 抗体摂取量を比較することに焦点を当てます。表面結合、自発的なリサイクルと誘発リサイクルの相対的な貢献を評価する必要がある場合、プロトコルを拡張できます。たとえば、ニューロン刺激せず氷の上をインキュベート エンドサイトーシス、明らかに Syt1 抗体の表面の結合を防ぎます。37 ° c テトロドトキシンを持つ基底ソリューションでニューロンをインキュベート活動電位伝搬、明らかに自発的なリサイクルができなくなります。したがって、刺激的な条件ことができます下の 37 ° C でインキュベーターのニューロンは、誘発 SV リサイクルの程度を明らかにします。
生きているセルは、理想的な生理的条件に敏感したがって、メンテナンス、トランスフェクション、および脱分極バッファーは、常に pH と温度を含む生理学的なパラメーターをテストする必要があります。一方、pH が調整された後、滅菌フィルターを脱分極のバッファーを渡すことが、トランスフェクション バッファーは滅菌フィルターに敏感です。ですから、その pH を調整、使用まで冷凍しておいて、任意の細菌をペレットにテーブル トップ遠心分離機でスピンします。トランスフェクション、リン酸カルシウムの結晶とプラスミドの協会を確保するため適切にバッファーをミックスする重要です。リン酸カルシウム トランスフェクション、2-4 日の in vitro (DIV) に最適です。SV の膜貫通タンパク質タグ シナプトフィジン transfected ニューロンのシナプス前の端末を識別するためのマーカーとして使用します。SV2、Synapsin、ヴァンプ/シナプトブレビンなど他の SV 蛋白質またはファゴット、リム、Munc13 1、キャストなどアクティブなゾーン分子のタグ付きバージョンを使用もできます。
MCherry と mOrange の両方赤の蛍光を発する。MCherry は mOrange よりも明るく、mOrange よりも長波長でより発光があります。したがって、GFP、赤の染料の 700 nm の範囲で発光する色素とトリプル蛍光イメージング、mOrange、mCherry よりも良いオプションです。GFP と赤い色素二重蛍光の mCherry が、明るい染料だからも有利な可能性があります。スパース トランスフェクションを保証するには、トランスフェクション ミックスは 60 分以上のない培養する必要があります。また、脱分極のバッファーで潜伏、すべて小胞の開口放出を確認する適切な長さであることが重要です。しかし、脱分極のバッファーに長時間露光を避けなければなりません。画像取り込みの時に、同じ露出時間と光強度の定量化比較実験の別のセットを確実に適用する重要ですも。
最後に、画像解析、間私達のプロトコルにはいくつかの考慮事項が含まれます。組換えシナプトフィジン涙点を示す関心の 1 つの領域、低輝度しきい値は、拡散反射光蛍光を除外するように設定されています。次に、このしきい値は、他のエリアやびまん性蛍光の点状の信号の類似の包含と除外を観察する coverslips にテストされます。適切なしきい値を識別すると、それが遺伝子組換えシナプトフィジン (mCherry または mOrange が付いた) チャネルの興味 (ROIs) の点状産地すべての画像に適用されます。最後に、Roi9Syt1 強度が設定されます。
我々 のアプローチは、スパース トランスフェクションに最適です。我々 は複雑な設定におけるシナプス前機能分析 SV 融合ニューロンに囲まれた transfected ニューロンの軸索にリサイクルがあります。このセットアップにダブル トランスフェクション神経機能を操作して transfected ニューロンのシナプスを見つけることが出来ます。融合のシナプス後ニューロンに連絡 transfected のシナプス前ニューロンは SV リサイクル シナプス前ニューロンの影響を評価する上で重要な要因です。設定には、シナプス後の操作は、シナプス前の変化を引き起こすかどうかをテストするのには簡単に適応することができます。この場合、ニューロンはシナプス後サイトをターゲット蛋白質のスパース トランスフェクションは transfected ニューロンのシナプスのサイトをローカライズして Syt1 取り込み融合ニューロンのシナプス ボタンでも確認できます。
スパース トランスフェクションが必要ない場合は、異なるトランスフェクション プロトコルを適用できます。たとえば、DIV 7 - 8 結果トランスフェクション率が高いが、それに Lipofectamine のトランスフェクションはまた各 transfected セル9の強い表現を伴います。さらに、ウイルス伝達はほぼ 100% で培養されたニューロン14,23,24式で起因できます。SV リサイクルの監視を目的とした実験でトランスフェクションを一つの蛋白質を実行または完全にできます。たとえばときに、全体的なシナプス リサイクルなしの野生型からニューロン間比較、遺伝子組み換えマウス、トランスフェクションによって個々 のニューロンを分類するは必要はありません。また、これにより内因性のタンパク質の反応です。検証されたプラスミドに遺伝子導入バッファーをテストまたは異なる ph バッファーを使用することが重要だ、トランスフェクションが失敗した場合 (トランスフェクション バッファーの準備を見なさい)。エンドトキシン フリー DNA 製剤を使用しても重要であると表示されます。免疫染色は内面 Syt1 抗体両方 PFA 固定およびメタノール固定サンプル作品です。またメタノール固定後、GFP と RFP 蛍光が失われることに注意する必要があります。GFP または RFP メタノール固定セルでローカライズする必要があります、これらの蛋白質はカルビンディン抗体をある必要があります。Syt1 取り込みが失敗した場合、脱分極時間と K+濃度分極バッファーそれに応じて変更する必要があります。多くのプロトコルのバリエーションを公開されている、時間 60 分12、90 s25の脱分極と 45 ミリメートル、50 ミリメートル、70 ミリメートル、および 110 mM6,25,26 K+濃度 ,27。再発の活動を阻止する必要があります、グルタミン酸受容体ブロッカーが脱分極時に追加もできます。最後に、高 K+の脱分極は、最強の刺激と考えられている、一方、活動電位は SV より生理的刺激22,28再商品化を引き起こすことができます。Syt1 抗体吸収効果の違いがラットおよびマウスの文化であります。手法では, マウスのモノクローナル抗 Syt1 クローン 604.2 (RRID:AB_993036) が生成されますウサギ ポリクローナル抗 Syt1 抗体 (RRID:AB_11042457) マウスの文化で強い染色を作り出す間、ラット マウス培養よりも文化の強い染色しますが、注意のいくつかのメモを以下に示します。
SVs に吸収抗シナプトタグミン抗体の使用に関するいくつかの注意事項を検討してください。まず、Syt1 のアスパラギン 24 の N-グリコシル蛋白質29,30のエンドサイトーシスの取り込みを促進します。アスパラギン 24 Syt1 の内腔のドメインの一部であります。我々 が使用しているマウスおよびウサギ抗体はアミノ酸 1-12、1-8、それぞれの Syt1 に対して指示されます。一方エピトープは、糖鎖のサイトと重複しない、立体障害や、逆に、抗体の結合による取り込みの誘導は除外できません。Syt1 で糖鎖サイトの突然変異は、エンドサイトーシスの動態と SVs に Syt1 のターゲットは変更されません。エンドサイトーシスは弱い刺激によって誘導するときに外側の細胞膜表面に残り Syt1 の割合が増加します。高 K+偏光などの強い刺激を適用すると Syt1 吸収の減少は30は認められなかった。全体的に、抗体が何らかの方法で糖鎖サイトと干渉抗体無料条件と比較して SV エンドサイトーシスで変化を起こす可能性がありますがこの変更を (GFP Rogdi の過剰発現症例) の実験と同様にする必要があり、(GFP 発現症例) で制御します。また、ポリクローナル抗体コピー多数抗体のエピトープにバインドするために立体問題およびモノクローナル抗体よりも架橋を誘発する可能性が高くあります。学的研究; 他の入手可能な抗体を比較するは確認されていませんただし、いくつかの研究は、特定の抗体の有効性を対処しています。たとえば、SV リサイクル動態は、直接比較でマウスのモノクローナル抗 Syt1 抗体クローン 604.2 と Synaptophluorin 蛍光変化を使用してプローブが、同様の結果が得られた、この抗体28の使用を検証します。ポリクローナル ウサギ Syt1 抗体と SVs を読み込んで、シナプス伝達の生理記録は、読み込まれたシナプスが Syt1 の機能喪失変異体を連想させる方法でシナプス伝達を減少していたことを明らかにしました。したがって、これらの抗体はシナプス伝達に影響を与えます。実際の摂取量は、自発および誘発リサイクル、ポリクローナル抗体は SV がリサイクルの 1 ラウンドを監視に適していますが、これらの抗体の31の取り込み後結果を解釈するときに注意が必要を示唆して明らかにしました。
3 つの試金 SV リサイクル研究を日常的に使用、膜の styryl のラベリングを含む染料、Phluorins の過剰発現は、Syt1 抗体吸収はここで実行されます。3 つすべてのアッセイは、SV のリサイクルのエンドサイトーシスと分泌の足を決定する使用できます。すべての 3 つの試金には、強力な利点がありますが、原則として注意も備わっています。FM 染料は全体の細胞の表面にラベルを付けるし、すべてリサイクル膜細胞にとられます。Phluorins は、過剰発現によって導入されなければなりません。Syt1 抗体ラベル内因性のタンパク質がいくつかの抗体は特定の条件下でその機能に影響を与えます。、各注意点が適切に演説された21のことできます。
全体的にみて、Syt1 抗体吸収法は様々 な目的を提供しています。最初、それは選択的に自発性または誘発、それぞれ28,31,32,33のリサイクルを受けている SVs をラベルに使用されました。第二に、それは SV リサイクル; の範囲に薬やタンパク質の効果を決定に使用されました。たとえば、BDNF が自発および誘発 SV6をリサイクルが強化されることを表示します。第三に、それは SVs を形態学的に定義されたシナプス34,35の総数の割合としてリサイクルのシナプスの数を決定するために使用されました。これはシナプス後細胞接着分子ニューロリギン 1 を過剰発現 SVs25リサイクル シナプスの割合が増加して、AMPA 型グルタミン酸受容体の発現を減らすことの割合を減少させることを明らかにしました。ンエ サイレントの割合を増やすこと、SVs をリサイクル シナプス シナプス36です。さらに、アッセイは、ラベルの SVs27の移動を分析し、nanoscopy13,22,33を使用して Syt1 の局在を決定する使用されました。最後に、このメソッドは、機能的なシナプス9ある特定の蛋白質をローカライズするかどうかをテストするのにはまだされます。Syt1 抗体は、抗体がニューロンの次の取り込み37日間が長期的な研究は、使用できます。これは別に分類された Syt1 抗体または異なる SV タンパク質の内腔のドメインに対する抗体を使用して吸収の第 2 ラウンドと組み合わせることができます。これは、SVs が最初に再生し、実験の終わりによってごみをテストできます。このアッセイによる急性スライスや脊髄スライス培養などのより多くのままのモデル システムを適応する興味深いものになるでしょう。原則として、取り込みアッセイ野生型から組織の比較が可能遺伝子改変動物やウイルス配信または上、すなわち併用します。、「遺伝子銃」これらのモデル システムにおけるタンパク質発現を操作します。このようなシステムで取り込みアッセイとネットワーク ・ ダイナミクスによって監視されているシナプス前の機械の特定の摂動の影響を同時に学ぶことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
サポート ヴァイスシュヴァルツは、専門的な技術支援を感謝いたします。この作業は、顕微鏡、ナノメートルの範囲のための卓越性のクラスターと (CNMPB, B1-7、両手を使ったのため) 脳の分子生理学を介して DFG によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
