Summary
Мы описываем оптических assay для синаптических пузырьков (SV) рециркуляции в культивированный нейронов. Сочетание этот протокол с двойной трансфекции выразить Пресинаптический маркер и протеин интереса позволяет нам найти Пресинаптический сайтов, их синаптических пузырьков, утилизации потенциала и определить роль протеина интереса.
Abstract
В активных Пресинаптический нервных окончаний синаптических пузырьков проходить циклы экзо - и эндоцитоз. В процессе рециркуляции, просветный домены SV трансмембранные белки подвергаются на поверхности клеток. Один из этих белков-Синаптотагмин-1 (Syt1). Антитела, направленные против Люминал домен Syt1, однажды добавила к питательной среды, take up в ходе экзо endocytotic цикла. Это поглощение пропорционально количеству SV рециркуляции и может быть определена количественно через иммунофлюоресценции. Здесь мы сочетаем Syt1 антитела поглощения с двойной трансфекции культивировали гиппокампа нейронов. Это позволяет нам (1) локализации Пресинаптический сайты, основанные на выражения рекомбинантных Пресинаптический маркера Synaptophysin, (2) определить их функциональность с помощью Syt1 поглощения и (3) характеризуют ориентации и эффекты белка интерес, GFP-Rogdi.
Introduction
Изучая синаптических пузырьков рециркуляции важную роль в определении как Пресинаптический свойств изменить, либо во время синаптической пластичности, или в ответ на возмущение синаптических функции. Изучение Синаптотагмин-1 (Syt1) антитела поглощение предоставляет один метод измерения объема переработки SV. Syt1 — SV-связанный белок, который действует как Ca2 + датчик и необходимые для exocytotic выпуска нейромедиатора1,2. Это трансмембранный белок с C-терминал цитоплазматических доменов вне SV и N-терминальный Люминал домена внутри SV-3. Во время экзоцитоз становится подвергаются Люминал домена Syt1 на внешний носитель. Этот внешний носитель мы добавляем антитела, направленные против цитоплазмы домен, который становится внутренним во время эндоцитоз. Эти антитела могут быть либо предварительно проспряганное с флуорофоров или immunostained с вторичные антитела4,5,6,7. Интенсивность флуоресценции результате immunosignal пропорциональна количество SV рециркуляции. Этот подход может использоваться для определения составных и деполяризации индуцированной SV рециркуляции6,8.
Syt1 поглощение анализов может выполняться после генов вируса опосредованной передачи практически все клетки в блюдо или разреженный трансфекции небольшого числа клеток. Наш метод сочетает в себе проба разреженных двойной трансфекции первичного гиппокампа нейронов, при использовании фосфата кальция9. Мы используем рекомбинантных маркер протеин, называемый накапливаться в presynapses, дневно тегами Synaptophysin, чтобы найти Пресинаптический терминалы и overexpress наш протеин интереса, Rogdi. Это позволяет нам проверить ли или не Rogdi цели функциональных синапсов и влияет на SV рециркуляции. Гену Rogdi был первоначально определен на экране дрозофилы мутантов, характеризующееся нарушением памяти10. В организме человека мутации в гене Rogdi вызывают редких и разрушительные болезнь под названием Kohlschütter-Tönz синдром. Пациенты страдают от пороков развития зубной эмали, фармакорезистентности эпилепсии и психомоторные задержки; Однако субцеллюлярные локализации продукта гена оставался неуловимым11. Таким образом пробирного поглощение Syt1 представил основные доказательства для локализации GFP-тегами Rogdi функциональных синапсы9.
Эта техника поглощение имеет несколько преимуществ. Во-первых SV рециркуляции может наблюдаться как в режиме реального времени, выполняя живых изображений7,12и после фиксации6,9 путем измерения интенсивности флуоресценции Syt1 флуоресцентной метки. Кроме того были разработаны несколько вариантов Syt1 антитела. Есть непомеченным варианты, которые могут быть помечены вторичное антитело после стандартного иммуноокрашивания протокол после фиксации и предварительно конъюгированных варианты с уже этикетку флуоресценции. Наконец на основе антител флуоресценции выгодно из-за большой выбор имеющиеся вторичные или конъюгированные красителей, которые могут быть использованы.
При фиксации и иммуноокрашивания нейронов, это также возможно для пятно для дополнительных белков и выполнять анализ colocalization. Это может помочь определить, где они расположены по отношению к утилизации СВС. Интенсивность флуоресценции лейбла является прямой мерой количество SV рециркуляции. Кроме того антитела выборочно ярлык Syt1-содержащих структур, что приводит к высокой специфичности и мало фона флуоресценции4. Может также использоваться протоколы различные стимуляции, например деполяризации буферов или электрической стимуляции протоколы9,12,,1314. Однако базальный SV рециркуляции могут быть измерены без стимулирования нейрональных культур15.
Наш метод конкретно рассматриваются Syt1 антитела поглощения в двойной transfected нейронов с immunolabeling вторичное антитело после фиксации. Однако мы ссылаемся на всех применяемых вариантов анализа в нашей дискуссии, чтобы дать зрителям возможность адаптировать протокол к конкретным потребностям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Были проведены исследования не с живых животных. Эксперименты с участием Усыпленных животных для получения клеток, которые культур были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения номер T10/30. Были проведены эксперименты с использованием утвержденных протоколов.
1. Первичные гиппокампа клеточной культуры
- Подготовьте культуре диссоциированных клеток гиппокампа крысы на эмбриональных день 1916,17. Пластины на coverslips 12 мм, покрытые полиэтиленимина (PEI) в 24-ну блюда на плотности 50 000-60 000 клеток/хорошо ячейки. Проверка плотности, с использованием клеток подсчета оптика камеры и фазы контраст.
- Культуры нейронов для 3 дней (день в пробирке (DIV) 3) в 24-ну пластины в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2.
- Оцените coverslips по показателям здоровья клеток с помощью передаваемых световой микроскопии (например, этап контраст оптика с увеличением 10-20 x). Проверьте следующие показатели хорошего здоровья: четкие фазы контраст гало, невритов без бисера структур и не Сома кластеризации или neurite планшеты.
2. transfection
Примечание: Следующий протокол относится к двойной трансфекции для 3 скважины. Однако протокол работает лучше, когда готовятся количествах, достаточных для 4 скважин.
- Подготовка 500 мл трансфекции буфера (274 мм NaCl, 10 KCl, 1,4 мм Na2HPO4, 15 мм глюкозы, 42 мм HEPES) в колбу Эрленмейера.
- Растворите 8,0 г NaCl, 0,37 г KCl, 0,095 g Na2HPO4, 1,35 г глюкозы и 5,0 г HEPES в 400 мл дистиллированной воды в колбу Эрленмейера.
- Отрегулируйте пэ-аш на 6,95 с 1 M NaOH с помощью рН метр.
- Отрегулируйте громкость с дистиллированной водой до 500 мл и проверьте pH с помощью рН метр.
- Сделать 20-30 мл аликвоты трансфекции буфера со следующими значениями рН дозирования 1 M NaOH в трансфекции буфер: 6,96 6,97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
Примечание: pH буфера трансфекции имеет решающее значение для эффективности transfection. - Чтобы проверить, что трансфекции буфера приводит к наибольшим числом transfected клеток, испытания каждого значения рН от 6.96 7.11. Используйте метод трансфекции, описанный в 2.2-2.11 и проверенных плазмида, выражая GFP. Определите количество transfected клеток на coverslip для каждого значения рН трансфекции буфера, для оценки которых буфер работает лучше всего.
- Аликвота буфер с наивысшую эффективность трансфекции в 2 мл пробирок microcentrifuge заморозить и хранить трубы при-20 ° C.
- Предварительно теплый сокращение сыворотке среднего, среднего культуры клеток и дистиллированной воды до 37 ° C в водяной бане.
- Подготовьте трансфекции микс в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Работа под капотом ламинарного потока для обеспечения стерильных условий труда.
- Mix 7,5 мкл рабочего раствора хлорида кальция 2 М с 4 мкг каждой свободной эндотоксина ДНК (Synaptophysin-mOrange и mGFP/GFP-Rogdi). Добавьте воды, чтобы достичь суммарный объем 60 мл в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Добавьте 60 мл трансфекции буфера к смеси. Чтобы получить наилучшие результаты, добавьте буфер трансфекции каплям при встряхивании ДНК смесь осторожно на vortex.
- Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (RT). Избегайте тряски инкубация трубы во время инкубации, поставив трубку рядом с Ламинарный шкаф.
- Под капотом ламинарного потока удалите средство культуры клеток («условных среднем») из скважин с помощью пипетки 1000 мл и хранить его в отдельный контейнер в инкубаторе.
- Добавьте 500 мл сокращение сыворотке среды в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 до 20 минут инкубационного периода (шаг 2.3.3).
- Добавьте 30 мл трансфекции смеси для каждой скважины, закупорить несколько капель. Отбросить остаток в нижней части трубки.
- После того, как все скважины были поставлены с трансфекции микс, осторожно встряхните 24-ну пластины для обеспечения распределения трансфекции смеси в среде.
- Инкубируйте скважин для 60 минут при 37 ° C и 5% CO2.
- Удаление и отменить микс transfection и промойте его три раза клеток питательной среды. Добавить 1 мл среды культуры клеток в каждой скважине и Инкубируйте 30 секунд на RT. удалить 750 мл среды и добавить такое же количество свежей среды. Повторите это три раза.
Примечание: Стиральная шаг очень важен. Сохранить время, каждый хорошо имеет не средний минимум (т.е., удалить и заменить скважины) и добавить средство Стиральная осторожно. - Удалите и отбросить клеток питательной среды и добавьте 450 мл с кондиционерами средних-к скважины.
- Пусть нейроны Зрелые в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 в DIV 10.
3. стимулирование и Syt1 поглощения
Примечание: Следующий протокол применяется поглощение к 3 скважины. Для деполяризации любое количество скважин соответствующим образом скорректировать суммы.
- Подготовка 50 мл 10 x деполяризации буфера (640 мм NaCl, 700 KCl, 20 мм CaCl2, глюкозы 300 мм, 200 мм HEPES, рН 7,4 мм MgCl2, 10) в колбу Эрленмейера.
Примечание: Деполяризации буфер может храниться при температуре 4 ° C на несколько недель. Если решение не расшатывания также используется, подготовить 10 x Tyrode в раствор, состоящий из 1290 мм NaCl, 50 мм KCl, MgCl 10 мм2, 20 мм CaCl2, 300 мм глюкозы, 200 мм HEPES рН 7,4 для того чтобы сравнить стимуляции индуцированного рециркуляции с самопроизвольно утилизации. После разбавления до 1 x добавьте 1 мкм Тетродотоксин перед использованием, чтобы блокировать поколения потенциал действия.- Растворите 1,87 г NaCl, 2,61 г хлористого калия, 0,1 г MgCl2-6 H20, 0,15 g CaCl2-2 H2O и 3,0 г, глюкозы-1 H2O и 2,38 г HEPES в 50 мл дистиллированной воды в колбу Эрленмейера. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH и стерильным фильтром решение. Разбавьте буфер 1:10 в дистиллированной воде для достижения 1 x концентрации.
- Подготовьте параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС (рН 7,4) для фиксации после стимуляции.
- Для 500 мл 4% ПФА в однократном ПБС, растворяют 20 g параформальдегида в 450 мл дистиллированной H2O.
Примечание: Отопление решение может ускорить растворение, но не нагревайте решение свыше 70 ° C, как PFA может распасться.
Предупреждение: PFA токсичных и потенциально канцерогенных тератогенное. Надевайте перчатки при работе с PFA, работать под зонт и избегать употребления. - Остудите раствор для RT и добавьте 50 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Отрегулируйте рН 7,4 с NaOH/HCl с помощью рН метр.
- Для 500 мл 4% ПФА в однократном ПБС, растворяют 20 g параформальдегида в 450 мл дистиллированной H2O.
- Предварительно теплой 600 мл 1 x деполяризации буфера и 10 мл среды культуры клеток до 37 ° C в водяной бане.
- Добавьте 1 mL антитела анти Syt1 мыши (клон 604.2) 1 x деполяризации буфера и вихревые для 10 секунд.
- Снимите и выбросьте среднего культуры клеток из клеток. Добавьте 200 мл смеси деполяризации антитела к каждой хорошо и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе.
- Удаление и отменить микс деполяризации антитела и промойте его три раза средний культуры клеток. Добавить 1 мл среды культуры клеток в каждой скважине и Инкубируйте 30 секунд на RT. удалить 750 мл среды и добавить такое же количество свежей среды. Повторите три раза.
- Удалить и отказаться от среднего культуры клеток и добавить 300 мл 4% ПФА в однократном ПБС. Инкубировать в течение 20 минут при 4 ° C.
- Мойте три раза по 5 минут с ПБС.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
4. Immunocytochemistry
- Подготовка 50 мл блокировки буфера.
Примечание: Блокирование буфера может храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких месяцев.- 2,5 г, сахарозы и 1 g бычьим сывороточным альбумином (БСА) растворяют в 5 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Добавьте 1,5 мл 10% раствора моющего средства фонда. Перемешайте раствор, пока все компоненты правильно развели и добавить дистиллированной H2O до достижения окончательный объем 50 мл. Алиготе решение и заморозить аликвоты для хранения.
- Разбавленных вторичных, Флюорофор сочетании антитела (направленные против основных видов Syt1-антитела) в 200 мл блокировки буфера в каждой скважине в разведении 1: 1000.
- Снимите и выбросьте ПБС от каждой хорошо содержащие coverslip.
- Добавить 200 мл блокировки буфера антитела смеси для каждой скважины и проинкубируйте 60 минут на RT.
Предупреждение: Ведь светочувствительные, вторичные антитела двигаться вперед все шаги должны выполняться в темноте. - После инкубации Вымойте клетки три раза по 5 минут с 1 мл раствора 1 x PBS.
- Внедрить coverslips на скольжениях микроскопа с внедрения среды.
- Добавление 7 мл капли встраивания среднего на слайд микроскопа. Удалите coverslip от 24-ну пластины, подняв его с помощью шприца и захвата его с щипцами.
Предупреждение: Клетки на поверхности coverslip легко повреждены, поэтому щипцами должны быть обработаны с осторожностью. - Падение coverslip в дистиллированную воду, чтобы удалить PBS и тщательно сушить прикоснувшись один край для мягких тканей.
- Флип coverslip на встраивание средних капелька, так, чтобы поверхность, перевозящих клетки микроскопа, тем самым встраивание клетки в средство вложения.
- Добавление 7 мл капли встраивания среднего на слайд микроскопа. Удалите coverslip от 24-ну пластины, подняв его с помощью шприца и захвата его с щипцами.
- Оставьте слайды сушиться под капот для 1-2 ч (покрыть их, чтобы избежать воздействия света) и хранить их в коробке слайд микроскопа при 4 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
5. микроскопический анализ
- После того, как сухой coverslips, разместите их под микроскопом с объективной и камеры.
- Отрегулируйте время экспозиции для каждого канала, таким образом, чтобы несколько пикселей переэкспонированных для обеспечения максимального распределения серого значений.
Примечание: Хотя время экспозиции может варьироваться между каналами, она должна быть постоянной на один канал для обеспечения сопоставимости между coverslips. - Приобрести многоканальных изображений для 10 регионов интерес (ROI) в coverslip. Проверьте, что ROI содержит аксональное процессов из transfected нейрона, проверяя GFP-флуоресценции, который должен быть пунктата.
6. Статистический анализ
- Экспортируйте изображения в формате TIF. Загрузить изображения в OpenView18 , нажав файл | Загрузить файл образа.
- Выберите Synaptophysin-mOrange изображение как канал 1, Rogdi-GFP/mGFP изображение как канал 2 и Alexa647 флуоресценции изображение как канала 3.
- Порог ROIs.
- Нажмите кнопку анализ | Место области над puncta. Выбор значения порога и Дельта интенсивности , так что после визуального осмотра, исключается диффузных флуоресценции, оставив только пунктата сигналов в изображении канала 1 (представляющих флуоресценции Synaptophysin-mOrange). Держите тот же самый порог для всех изображений.
- Передача этих ROIs на соответствующий канал 2 (флуоресценции GFP-Rogdi/mGFP) и 3 (Syt1-флуоресцентным) каждой coverslip области, нажав кнопку выполнить сейчас.
Примечание: ROIs должен рассматриваться только если ячейка является двойной transfected. В этом методе mOrange - и GFP-флуоресценции должна быть отчетливо видна. - Сохраните данные в редактор журнала анализа, нажав кнопку данные журнала.
- Откройте редактор журнала анализа на вкладке Windows и скопировать значения для каждого канала. Вставьте значения для отдельных каналов в электронную таблицу.
- Определите интенсивность средняя флуоресценции Syt1-канала в ROIs в обоих условиях трансфекции (GFP-Rogdi и mGFP).
- Примените соответствующие статистические тесты, такие как студента t тест для определения существенных различий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ожидаемый результат этого подхода обнаружение примерно 50 двойной transfected нейронов в coverslip на плотности 50 000 нейронов в колодец. Ожидается, что аксон каждый нейрон показать несколько горячих точек дневно тегами накопления Synaptophysin, указав ofSVs кластеров. На пресинаптическом функциональные сайты рекомбинантных сигнала Synaptophysin colocalizes с пунктата Syt1 флуоресценции. С помощью двойной трансфекции, GFP-Rogdi как протеин интереса (рис. 1) либо mGFP как элемент управления совместно выразили с рекомбинантной Synaptophysin.
В этом эксперименте мы анализируем SV рециркуляции на пресинаптическом участках в нейронах, выражая GFP-Rogdi или mGFP. Если управления белка, mGFP, равномерно распределена по всему вся ячейка, но его влияние в синаптических сайты по-прежнему необходимо изучить, то это необходимо совместно transfect второй белок, который обогащен пресинаптически, дневно меткой Synaptophysin.
Как описано ранее, клетки претерпевают деполяризации индуцированной передатчик выпуска. В результате функциональные синапсы занимают Syt1 антител, добавлен в средство. После immunolabeling Syt1 антитела с дневно обозначенные вторичные антитела степень поглощения Syt1 наконец количественно с помощью immunosignal (рис. 2).
Рисунок 1. Двухместный transfected клеток. Поле зрения показывает двойной transfected клеток, выражая GFP-Rogdi (A) и Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin — белок обильные синаптических пузырьков. Рекомбинатные вариант может использоваться для маркировки синаптической boutons. Модель локализации GFP-Rogdi напоминает Synaptophysin-mCherry (C). Масштаб баров = 10 мкм. Прямоугольники показывают 2,5 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. GFP-Rogdi в функциональных синапсов. Живой Syt1 поглощения была исполнена в двойной transfected клеток, выражая mGFP (зеленый) и Synaptophysin-mOrange (красный; A-D) или GFP-Rogdi (зеленый) и Synaptophysin-mOrange (красный; E-H). Syt1 антитела поглощения была выполнена с помощью мыши моноклональные антитела, направленные против Люминал домен Syt1. После фиксации PFA клетки окрашивали антитела анти GFP кролика. Вторичные антитела (Alexa 488 анти кролика и анти мыши Alexa 647) были добавлены для обнаружения GFP или GFP-Rogdi и Syt1, соответственно. Аутофлюоресценция Synaptophysin-mOrange был использован для обнаружения Пресинаптический терминалы (B и F). Пунктата Syt1 иммунофлюоресценции указывает сайты везикул, переработка (синий; C и G). Обратите внимание, что большинство Syt1-меченых синапсы локализованы для не transfected нейронов. GFP-Rogdi, была предназначена для активных синапсов и не менять синаптических пузырьков, переработка (I). 3 независимых культуры были эксперименты (N = 3). Для анализа использовались по крайней мере 3 coverslips от каждой культуры (всего 10). Наконец, были проанализированы 3 области за coverslip (n = 30). Student´s t тест показал статистически значимого различия. Масштаб баров = 10 мкм. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (S.E.M.). «Н.с.» означает не имеет значения. Эта цифра была изменена от Римана и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует три анализов, обычно используются для изучения синаптических пузырьков (SV) утилизации. Первые два включают в себя использование) флуоресцентных стириловых красителей например FM1-43, (который инкорпорировать в мембраны, учитываются органеллы во время эндоцитоза и освобожден после экзоцитоз); и b) дневно меткой рекомбинантных белков SV (которые, после гиперэкспрессия, включить в белковых утилизации машин). Если прилагаемый флуорофоров изменить их флуоресценции в зависимости от рН, они могут использоваться для отслеживания изменений между кислой интерьер SV и рН внеклеточной среды. Рекомбинатные протеины, отмеченных рН чувствительных вариант GFP, называются Phluorins. Двух анализов обсудили оба были ранее популярные19,20, и плюсы и минусы каждого из них были также рассмотрены21.
Здесь мы описываем третьего, устоявшихся метод4,5,6,7,9,14. Чтобы проверить SV рециркуляции, мы воспользоваться тот факт, что Люминал домена связанные везикул белка Синаптотагмин-1 (Syt1) становится подвергаются на поверхности клеток после экзоцитоз. Во-первых мы добавляем антитела, направленные против Люминал домен питательной среды, который затем поглощается везикул в процессе рециркуляции SV. Это антитело поглощение визуализируется и количественно иммунофлюоресценции. В качестве альтернативы может использоваться непосредственно помечены Syt1-антитела. Метка может быть рН независимый, отчетности локализации Syt1-антитела как внутри, так и на внешней поверхности СВС, или рН зависимых, отчетности, локализации на основе флуоресценции изменений. Мы также описывают комбинацию этот assay SV рециркуляции с двойной трансфекции культивированный нейронов для тестирования ли протеин интереса, GFP-Rogdi, целевых функциональных синапсов и влияет на SV рециркуляции. GFP-Rogdi для этого подхода; Однако те же вопросы могут быть решены для любого протеина интереса.
Этот assay был впервые представлен в 1992 году для мониторинга, спонтанное рециркуляции СВС4 и получила дальнейшее развитие той же группы для мониторинга вызвала SV рециркуляции12. Их эксперименты установлено, что поглощение Syt1 чувствителен к клостридий нейротоксины, которые блокируют SV экзоцитоз12. Они также показали, что стимуляция культур путем деполяризации при 37 ° C способствует интернализации Syt1 антител, по сравнению с 1) культур, которые хранятся на льду, который предотвращает большинство эндоцитоза и 2) культур, инкубировали при 37 ° C без стимуляции, который позволяет самопроизвольно рециркуляции, но не вызывают утилизации12,22. Assay можно легко сравнить SV рециркуляции между двумя условиями, такие как с и без молекула интерес. В частности этот протокол посвящен сравнения поглощения Syt1 антител в присутствии против отсутствия определенных гиперэкспрессия белка. Протокол может быть расширен, если относительный вклад поверхности привязки, спонтанное рециркуляции и вызвала рециркуляции должны быть оценены. Например инкубации нейронов на льду без стимуляции предотвращает эндоцитоза, выявление любой поверхности привязки Syt1 антитела. Инкубации нейронов при 37 ° C в базальной раствор с Тетродотоксин предотвращает потенциал действия и распространения, раскрывая спонтанное рециркуляции. Таким образом инкубирования нейронов при 37 ° C под стимулирующим условиям могут выявить степень переработки вызвала SV.
Живые клетки чувствительны к идеальной физиологических условиях; Таким образом техническое обслуживание, transfection и деполяризации буферов всегда должны испытываться физиологических параметров, включая рН и температуры. В то время как деполяризации буферов может передаваться через стерильные фильтры после того, как была скорректирована pH, transfection буферы чувствительны к стерильной фильтрации. Таким образом мы настроить его рН, держите его заморожены до использования и спина его в настольные центрифуги для пеллет любых бактерий. Для transfection жизненно важно смешать в буфер адекватно обеспечить объединение плазмида с кристаллов кальция фосфат. Кальция фосфат трансфекции работает лучше всего на день в пробирке (DIV) 2-4. Мы используем теги Synaptophysin, SV трансмембранным белком, как маркер для выявления Пресинаптический терминалов в transfected нейронов. Меткой версии других белков SV SV2, Synapsin, и VAMP/Синаптобревин или активной зоны молекул, таких как Фагот, ОПРАВА, Munc13-1 и литой могут также использоваться.
MCherry и mOrange выделяют красной флуоресценцией. Хотя mCherry ярче, чем mOrange, он имеет больше выбросов на долго длин волн, чем mOrange. Таким образом для тройной флуоресценции изображений с GFP, красный краситель и краситель, излучающих в диапазоне 700 Нм, mOrange является лучшим вариантом, чем mCherry. Для двойной флуоресценции с GFP и красный краситель mCherry может быть благоприятным, поскольку это яркие краски. Чтобы гарантировать разреженных трансфекции, transfection смесь следует не инкубировали дольше чем 60 минут. Важно также, что инкубации в буфер деполяризующий является право продолжительность времени для обеспечения экзоцитоз все пузырьки. Однако следует избегать длительного воздействия деполяризующий буфер. Во время захвата изображений важно также применять же времени экспозиции и интенсивности света для обеспечения количественной сравнение между разными наборами экспериментов.
Наконец в ходе анализа изображений, наш протокол включает в себя несколько соображений. Для одной области интереса, показаны рекомбинантных Synaptophysin puncta Нижняя интенсивности порог устанавливается таким образом, что исключается диффузных флуоресценции. Далее этот порог проверяется на другие районы и coverslips соблюдать аналогичные включения пунктата сигналов и исключения диффузных флуоресценции. После того, как определен соответствующий порог, он применяется ко всем изображениям, производство пунктата регионы интереса (ROI) в рекомбинантной канал Synaptophysin (отмеченных mCherry или mOrange). И наконец Syt1 интенсивности определяется для трансформирования9.
Наш подход оптимизирован для разреженных transfection. Мы анализируем Пресинаптический функции в сложной обстановке там, где SV рециркуляции в аксоны нейронов transfected в окружении untransfected нейронов. В этой настройке двойной трансфекции позволяет нам манипулировать нейрональных функции и найдите Пресинаптический терминалы transfected нейронов. Transfected Пресинаптический нейронов, которые связаться с untransfected постсинаптических нейронов является важным фактором в оценке воздействия Пресинаптический нейрон SV рециркуляции. Параметр также может быть легко адаптирована для тестирования ли постсинаптических манипуляции вызывает Пресинаптический изменения. В этом случае разреженных трансфекции нейронов с белком, которая ориентирована на постсинаптических сайты будут локализовать постсинаптических сайты transfected нейронов, и Syt1 поглощение может быть определена в синаптической boutons untransfected нейронов.
При необходимости разреженные трансфекции могут применяться различные трансфекции протоколы. К примеру transfection с Lipofectamine на DIV 7 - 8 результатов в трансфекции ставок, но это также влечет за собой сильные выражения в каждом transfected клеток9. Кроме того вирусный трансдукции может привести выражение в почти 100% культивируемых нейронов14,23,24. В экспериментах, направленных на мониторинг SV рециркуляции transfection может быть выполнена для одного белка или полностью ушел. Например когда в целом синаптических рециркуляции сравнивается между нейронами с wildtype и генетически модифицированные мышей, маркировки отдельных нейронов, transfection не является необходимым. Кроме того это позволяет immunolabeling эндогенных белков. Если не трансфекции, важно для тестирования трансфекции буфер с проверенного плазмида или использовать буфер с различных рН (см. Подготовка трансфекции буфера). С помощью эндотоксина бесплатные ДНК препаратов представляется также иметь решающее значение. Иммуноокрашивания внутреннюю Syt1 антитела работ в пробах как PFA-исправлена и метанол исправлена. Следует также отметить, что GFP и ППП аутофлюоресценция теряется после фиксации метанола. Если GFP или RFP необходимо локализовать в метанол Исправлена клеток, эти белки должны быть полученных. Если Syt1 поглощение не удается, следует соответствующим образом изменить время деполяризации и концентрация K+ в буфере деполяризации. Многие вариации протокола были опубликованы, с деполяризации раз начиная от 90 s25 до 60 мин12и 45 мм, 50 мм, 70 мм и 110 мм6,25,26 концентрации K+ ,27. При периодических деятельности должно быть предотвращено, блокаторы рецепторов глутамата также могут быть добавлены во время деполяризации. Наконец в то время как высокий K+ деполяризации считается сильнейшим стимулом, потенциалы действия могут вызвать SV рециркуляции через более физиологические стимулы22,28. Различия в эффективности поглощения Syt1 антител может произойти в крысы и мыши культур. В нашем методе моноклональные мыши анти Syt1 клон 604.2 (RRID:AB_993036) производит сильнее пятнать в культурах крыса чем в культурах мыши, в то время как кролика polyclonal антитела анти Syt1 (RRID:AB_11042457) производит сильнее пятнать в культурах мыши, но Ниже рассматриваются несколько нот предостережения.
Несколько предостережений относительно использования антител анти Синаптотагмин для поглощения в СВС должны рассматриваться. Во-первых N-гликозилирования аспарагин 24 Syt1 способствует endocytotic поглощения белков29,30. Аспарагин 24 является частью Люминал домена Syt1. Мыши и кролик антитела, которые мы используем направлены против аминокислоты 1-12 и 1-8, соответственно, Syt1. Хотя их epitopes не перекрываются с сайта N-гликозилирования, нельзя исключать их пространственной помех или, наоборот, индукции поглощения антитела связывая. Мутация сайта N-гликозилирования в Syt1 не изменяет кинетика эндоцитоза и ориентации Syt1 для СВС. Это увеличивает долю Syt1 оставшиеся на поверхности наружной мембраны плазмы, когда эндоцитоза индуцируется слабые раздражители. Когда применяются сильные стимулы, например, высокий K+ деполяризации, без снижения Syt1-поглощения наблюдается30. В целом, если антитела вмешался с N-гликозилирования сайт в некотором роде они могут вызвать изменения в SV эндоцитоза, по сравнению с антител свободных условиях, но эти изменения должны быть одинаковыми для эксперимента (в нашем случае Избыточная экспрессия гена GFP-Rogdi) и элемента управления (в нашем случае выражение гена GFP). Кроме того Поликлональные антитела могут быть более вероятно побудить их пространственной проблемы и сшивки чем моноклональные антитела, потому, что большее количество антител копия связывается epitope. Мы не осведомлены о систематических исследований, сравнение доступных антитела друг с другом; Однако некоторые исследования были рассмотрены действия определенных антител. Например, когда SV рециркуляции кинетики были зондируемой, используя моноклональные мыши анти Syt1 антитела клон 604.2 и Synaptophluorin флуоресценции изменения в прямом сравнении, аналогичные результаты были получены, проверка использования этой антитела28. Загрузка СВС с кролика polyclonal антитела Syt1 и записи синаптической передачи electrophysiologically показали, что загружен синапсы сократила синаптической передачи в виде напоминает функцию потерь мутантов Syt1. Таким образом эти антитела polyclonal затрагивают синаптической передачи. Фактическое потребление показали, спонтанной и вызвала рециркуляции, предполагая, что Поликлональные антитела подходит для наблюдения за один раунд SV утилизации, но следует проявлять осторожность при толковании результатов после поглощения этих антител31.
Три анализов, обычно используются для изучения SV рециркуляции, которые включают в себя мембраны маркировки с стириловых красителей, гиперэкспрессия Phluorins, и поглощение Syt1-антитела выполнены здесь. Все три анализов может использоваться для определения endocytotic и exocytotic ноги SV утилизации. Хотя все три анализов имеют мощные выгоды, каждый также имеет принцип предостережение. Красители FM ярлык всей клеточной поверхности и учитываются ячейку со всеми рециркуляции мембраны. PHluorins должен быть представлен гиперэкспрессия. Syt1-антитела этикетке эндогенного белка, но некоторые антитела могут повлиять на его функции при определенных условиях. Каждый нюанс может однако, быть надлежащим образом рассмотрены21.
В целом пробирного поглощение антитела Syt1 служил различного назначения. Во-первых он был использован для выборочно ярлык СВС, происходят спонтанные или вызвала рециркуляции, соответственно28,,3132,33. Во-вторых она была использована для определения влияния наркотиков или белка на степени переработки SV; Например, чтобы показать, что BDNF способствует спонтанным и вызвала SV рециркуляции6. В-третьих он был использован для определения числа синапсов с утилизацией СВС в процентах от общего числа морфологически определенных синапсы34,35. Это показало, что экспрессирующих postsynaptic клетки Межмицеллярная молекула нейролигины-1 увеличивает процент синапсы с утилизацией СВС25 и что сокращения, выражая AMPA-типа глутаматных рецепторов уменьшается процент синапсы с утилизацией СВС, увеличивая процент пресинаптически немого синапсы36. Кроме того assay была использована для анализа мобильности помечены СВС27 и определить локализацию Syt1 с помощью наноскопия13,22,33. Наконец этот метод по-прежнему используется для проверки или нет определенных белков локализовать функциональную синапсы9. Syt1 антитела могут также использоваться для долгосрочных исследований, где антитела остается в нейронах после поглощения37дней. Это может сочетаться с второй раунд с помощью отдельно обозначенное антитело Syt1 или антитела, направленные против Люминал домена другой SV белка поглощения. Это позволяет, тестирование которых СВС переработанных первоначально и который корзины к концу эксперимента. Было бы интересно адаптировать этот assay больше нетронутыми модели систем, как острый ломтиками и organotypic срез культур. В принципе, поглощение assay позволяет сравнение ткани от wildtype и генетически измененных животных или могут быть объединены с вирусной доставки или биолистики, т.е., пистолетом «ген», манипулировать выражение протеина в этих системах модель. В таких системах можно одновременно изучено влияние некоторых возмущений на пресинаптическом машины, контролируется поглощение пробирного и динамика сети.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Ирмгард Weiss за экспертной технической помощи. Эта работа была поддержана DFG через кластер передового опыта для микроскопии в нанометровом диапазоне и молекулярной физиологии мозга (CNMPB, B1-7, т.д.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K.
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
