Summary
Vi beskriver en optisk analysen for synaptic vesicle (SV) resirkulering i kulturperler neurons. Kombinere denne protokollen med dobbel transfection å uttrykke en presynaptic markør og protein rundt tillater oss å finne presynaptic steder, deres synaptic vesicle resirkulering kapasitet, og bestemme rollen protein av interesse.
Abstract
På aktive presynaptic nerve terminaler gjennom synaptic blemmer sykluser av exo- og endocytose. Under resirkulering, bli luminal domener av SV transmembrane proteiner eksponert på celleoverflaten. En av disse proteinene er Synaptotagmin-1 (Syt1). Et antistoff rettet mot luminal domenet Syt1, når lagt til kultur medium, blir tatt opp under exo-endocytotic syklus. Denne opptak er proporsjonal med mengden SV resirkulering og kan kvantifiseres gjennom immunofluorescence. Her kombineres Syt1 antistoff opptak med dobbel transfection kulturperler hippocampus neurons. Dette tillater oss å (1) lokalisere presynaptic nettsteder basert på uttrykk av rekombinant presynaptic merket Synaptophysin, (2) finne funksjonaliteten benytter Syt1 opptak og (3) karakterisere målretting og effekter av et protein av interesse, GFP-Rogdi.
Introduction
Studere synaptic vesicle resirkulering er viktig for å bestemme hvordan presynaptic egenskaper endre, under synaptiske plastisitet eller svar på forstyrrelsene av synaptiske funksjon. Antistoff opptak studere Synaptotagmin-1 (Syt1) og gir en metode for å måle hvor mye SV resirkulering. Syt1 er et SV-assosiert protein som fungerer som en Ca2 + sensor og er nødvendig for exocytotic utgivelsen av nevrotransmitter1,2. Det er en transmembrane protein med en C-terminalen cytoplasmatiske domenet utenfor SV og et N-terminal luminal domene innenfor SV3. Under exocytosis, blir luminal domenet Syt1 utsatt for eksterne medium. Til eksterne mediet, legger vi til antistoffer rettet mot cytoplasmatiske domenet, som blir internalisert under endocytose. Disse antistoffene kan være enten pre konjugert med fluorophores eller immunostained med sekundær antistoffer4,5,6,7. Fluorescens intensiteten av den resulterende immunosignal er proporsjonal med mengden SV resirkulering. Denne fremgangsmåten kan brukes til å fastsette både grunnleggende og depolarization-indusert SV resirkulering6,8.
Syt1 opptak analyser kan utføres etter virus-mediert genoverføring til nesten alle celler i retten eller sparsom transfection av et lite antall celler. Vår metode kombinerer analysen med sparsom dobbelt hva primære hippocampus neurons bruker kalsium fosfat9. Vi bruker et rekombinant markør protein kalt å samle på presynapses, fluorescently merket Synaptophysin, å finne presynaptic terminaler og overexpress våre protein av interesse, Rogdi. Dette tillater oss å teste om Rogdi mål funksjonelle synapser og påvirker SV resirkulering. Genet koding Rogdi var opprinnelig identifisert i skjermen for Drosophila mutanter preget av nedsatt minne10. Hos mennesker føre mutasjoner i genet Rogdi en sjelden og ødeleggende sykdom som kalles Kohlschütter-Tönz syndrom. Pasienter lider dental emaljen misdannelser, pharmacoresistant epilepsi og psykomotorisk forsinkelser; men vært den subcellular lokaliseringen av gene produktet unnvikende11. Dermed gitt Syt1 opptaksanalyse viktige bevis lokalisering av GFP-merket Rogdi funksjonelle synapser9.
Denne opptak teknikken har flere fordeler. Først kan SV gjenvinning observeres både i sanntid ved å utføre live bildebehandling7,12, og etter fiksering6,9 ved å måle fluorescens intensiteten av Syt1 fluorescens etiketten. I tillegg har flere Syt1 antistoff varianter blitt utviklet. Det er ukodede varianter som kan merkes med en sekundær antistoff etter en standard immunostai-protokoll etter fiksering og pre konjugert varianter med en fluorescens etikett allerede vedlagt. Endelig er antistoff-baserte fluorescens fordelaktig på grunn av det store utvalget av tilgjengelige sekundær eller konjugert fargestoffer som kan brukes.
Når fikse og immunostai-neurons, det er også mulig å flekk for ekstra proteiner og utføre colocalization analyse. Dette kan hjelpe bestemme hvor de befinner seg i forhold til resirkulering SVs. Intensiteten av fluorescens måles direkte i mengden av SV resirkulering. I tillegg etiketten antistoffer selektivt Syt1 inneholder strukturer, som resulterer i høy spesifisitet og liten bakgrunn fluorescens4. Forskjellige stimulering protokoller kan også brukes som depolarization buffere eller elektrisk stimulering, protokoller,9,,12,,13,,14. Men kan basale SV gjenvinning måles uten å stimulere neuronal kulturer15.
Vår metode omhandler spesifikt Syt1 antistoff opptak i double-transfekterte neurons med sekundær antistoff immunolabeling etter fiksering. Men referere vi til alle rutinemessig brukes varianter av analysen i vår diskusjon å gi seerne muligheten til å tilpasse protokollen behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ingen studier med levende dyr ble utført. Eksperimenter som involverer euthanized dyr for å få celle kulturer ble godkjent av lokale Dyrevern myndigheter (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under godkjenning nummer T10/30. Forsøkene ble utført med godkjente protokoller.
1. primære hippocampus cellekultur
- Forberede dissosiert cellekultur rotte hippocampus på embryonale dag 1916,17. Plate cellene i 12 mm coverslips belagt med polyethyleneimine (PEI) i 24-og retter på en tetthet på 50.000-60.000 celler/godt. Finne tettheten at en celle teller chamber og fase kontrast optikk.
- Kultur neurons i 3 dager (dag i vitro (DIV) 3) på en 24-vel plate i kuvøse på 37 ° C med 5% CO2.
- Vurdere coverslips for indikatorer på cell helse bruker overført * lys (f.eks fase kontrast optikk ved en forstørrelse av 10-20 X). Se etter følgende indikatorer for god helse: en klar fase kontrast halo, neurites uten beaded strukturer, og ingen soma klynger eller neurite bunting.
2. hva
Merk: Følgende protokollen refererer til en dobbel-hva 3 brønner. Imidlertid fungerer protokollen best når beløpene nok 4 brønner er forberedt.
- Forberede 500 mL transfection buffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4: 15 mM glukose, 42 mM HEPES) i en Erlenmeyer kolbe.
- Oppløse 8.0 g NaCl, 0.37 g KCl, 0.095 g Na2HPO4, 1.35 g av glukose og 5.0 g HEPES i 400 mL destillert vann i en Erlenmeyer kolbe.
- Justere pH til 6.95 med 1 M NaOH med en pH-meter.
- Juster volumet med destillert vann til 500 mL og sjekke pH bruker en pH-meter.
- Gjøre 20-30 mL dele transfection buffer med følgende pH verdier av pipettering 1 M NaOH til transfection bufferen: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7,00, 7.01, 7.02, 7,03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7,08, 7.09, 7.11.
Merk: pH i bufferen som hva er avgjørende for hva effekten. - For å teste hva som buffer fører til det høyeste antallet transfekterte celler, teste hver pH-verdi fra 6.96 til 7.11. Bruk hva metoden beskrevet i 2.2-2.11 og et valideres plasmider uttrykke GFP. Bestemme antallet transfekterte celler per dekkglassvæske for hver transfection buffer pH-verdi å vurdere hvilke buffer fungerer best.
- Aliquot buffer med høyeste transfection effektiviteten til 2 mL microcentrifuge rør fryse og lagre rør på 20 ° C.
- Forvarm til redusert serum medium, celle kultur medium og destillert vann til 37 ° C i vannbad.
- Klargjør transfection blandingen i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Arbeid under laminær strømning panseret å sikre sterilt arbeidsforhold.
- Mix 7.5 µL av 2 M veisalt med 4 µg hver endotoxin-gratis DNA (Synaptophysin-mOrange og mGFP/GFP-Rogdi). Legge til vann for å nå et samlet volum på 60 mL i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Legg til 60 mL transfection bufferen til mix. For å oppnå de beste resultatene, legge transfection bufferen dropwise mens risting DNA-blandingen forsiktig på virvelen.
- Inkuber ved romtemperatur (RT) i 20 minutter. Unngå risting inkubasjon røret under inkubasjon tid ved å plassere røret ved laminær strømning panseret.
- Under laminær strømning panseret, fjerne celle kultur medium ("betinget medium") fra brønnene bruker en 1000 mL Pipetter og lagre det i en egen beholder i inkubator.
- Legg til 500 mL redusert serum medium i hver brønn. Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2 før inkubasjonstiden 20 minutters (trinn 2.3.3) er over.
- Legge til 30 mL av hva hver brønn ved pipettering flere drops. Kast resten på bunnen av røret.
- Etter at alle brønnene har levert med hva miks, forsiktig risting 24-vel platen slik distribusjon av transfection blandingen i medium.
- Inkuber brønnene i 60 minutter på 37 ° C og 5% CO2.
- Fjerne og forkaste transfection mix og vask det tre ganger med celle kultur medium. Tilsett 1 mL av celle kultur medium hver brønn og ruge dem i 30 sekunder på rett fjerne 750 mL av middels og legge samme mengde frisk medium. Gjenta denne tre timene.
Merk: Vask trinnet er avgjørende. Holde klokkeslettet hver vel har ingen medium minst (dvs., fjerne og erstatte godt-av-godt) og legge til vask mediet forsiktig. - Fjerne og forkaste celle kultur medium og Legg 450 mL betinget middels godt-av-brønnen.
- La neurons modne i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 DIV 10.
3. stimulering og Syt1 opptak
Merk: Følgende protokollen gjelder opptaket 3 brønner. Depolarization av andre rekke brønner, justere beløpene tilsvarende.
- Forberede 50 mL av 10 x depolarization buffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2300 mM glukose, 200 mM HEPES, pH 7.4) i en Erlenmeyer kolbe.
Merk: Depolarization buffer kan holdes på 4 ° C i flere uker. Hvis en ikke-depolarizing løsning brukes også, forberede en 10 x Tyrode's løsning 1290 mm NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2300 mM glukose, 200 mM HEPES pH 7.4 for å sammenligne stimulering-indusert resirkulering med spontan resirkulering. Etter fortynning til 1 x, Legg 1 µM av Tetrodotoxin før bruk for å blokkere handling potensial generasjon.- Oppløse 1.87 g NaCl, 2,61 g KCl, 0.1 g av MgCl2-6 H20, 0.15 g av CaCl2-2 H2O og 3.0 g av glukose-1 H2O og 2,38 g HEPES i 50 mL destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. Justere pH med NaOH og sterile-filter løsningen. Fortynne buffer 1:10 i destillert vann å oppnå en 1 x konsentrasjon.
- Forberede 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS (pH 7.4) fiksering etter stimulering.
- For 500 mL 4% PFA i 1 x PBS, oppløse 20 g paraformaldehyde i 450 mL destillert H2O.
Merk: Oppvarming løsningen kan fremskynde oppløsning, men varme ikke løsningen over 70 ° C, som PFA kan oppløses.
Forsiktig: PFA er giftig, potensielt kreftfremkallende og teratogene. Bruk hansker når du arbeider med PFA arbeide under avtrekksvifte og unngå inntak. - Avkjøl løsning å RT og legge 50 mL av 10 x PBS lagerløsning. Justere pH 7,4 med NaOH/HCl med en pH-meter.
- For 500 mL 4% PFA i 1 x PBS, oppløse 20 g paraformaldehyde i 450 mL destillert H2O.
- Forvarm 600 mL 1 x depolarization buffer og 10 mL celle kultur medium til 37 ° C i vannbad.
- Legge til 1 mL av musen anti-Syt1 antistoff (klone 604.2) 1 x depolarization buffer og vortex i 10 sekunder.
- Fjerne og slette cellen kultur mediet cellene. Legge til 200 mL depolarization-antistoff mix hver vel og ruge i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 i inkubator.
- Fjerne og forkaste depolarization-antistoff mix og vask det tre ganger med celle kultur medium. Tilsett 1 mL av celle kultur medium hver brønn og ruge 30 sekunder på rett fjerne 750 mL av middels og legge samme mengde frisk medium. Repeter tre ganger.
- Fjerne og forkaste celle kultur medium og legge til 300 mL 4% PFA i 1 x PBS. Inkuber i 20 minutter på 4 ° C.
- Vask tre ganger i 5 minutter hver med 1 x PBS.
Merk: Protokollen kan pauses her.
4. Immunocytochemistry
- Forberede 50 mL av blokkering buffer.
Merk: Blokkerer bufferen kan holdes på 20 ° C i flere måneder.- Løses 2.5 g av sukrose og 1 g av bovin serum albumin (BSA) i 5 mL 10 x PBS lagerløsning. Legge til 1,5 mL 10% lager såpevann. Rør løsningen til alle komponentene har riktig oppløst og legge til destillert H2O fram et endelig antall 50 mL. Aliquot løsningen og fryse dele for lagring.
- Fortynne det sekundære, fluorophore-kombinert antistoffet (rettet mot den primære Syt1-antistoff arten) i 200 mL blokkerer buffer i hver brønn ved en fortynning av 1:1000.
- Fjerne og slette 1 x PBS fra hver også inneholder en dekkglassvæske.
- Legge til 200 mL blokkerer buffer-antistoff blanding i hver brønn og ruge på 60 minutter om RT.
Advarsel: Fordi sekundære antistoffer er lys-sensitive, alle skritt fremover må utføres i mørket. - Inkubasjon vaskes cellene tre ganger i 5 minutter med 1 mL 1 x PBS.
- Legge til coverslips på objektglass med innebygging medium.
- Legg en dråpe 7 mL bygge middels til mikroskopet lysbildet. Fjerne dekkglassvæske fra 24-vel platen ved å løfte det med en sprøyte og flytte det med tang.
Forsiktig: Celler på overflaten av dekkglassvæske er lett skadet, så tang må håndteres med forsiktighet. - Dukkert i dekkglassvæske i destillert vann fjerne PBS og tørk den nøye ved å berøre en kant til en myk vev.
- Vende dekkglassvæske på innebygging middels slippverktøyet, slik at overflaten bærer cellene ansikter mikroskop lysbildet og dermed bygge cellene til innebygging medium.
- Legg en dråpe 7 mL bygge middels til mikroskopet lysbildet. Fjerne dekkglassvæske fra 24-vel platen ved å løfte det med en sprøyte og flytte det med tang.
- La lysbildene tørke under panseret på 1-2 h (dekker dem for å unngå eksponering) og lagre dem i en mikroskop lysbildet boks 4 ° C.
Merk: Protokollen kan pauses her.
5. microscopic analyse
- Etter coverslips tørt, plass dem under mikroskopet med mål og kameraet.
- Juster eksponeringstid for hver kanal slik at par piksler er overeksponert for å sikre maksimal distribusjonen av grå verdier.
Merk: Mens eksponeringstid kan variere mellom kanalene, bør det være konstant for en kanal å sikre sammenlignbarheten mellom coverslips. - Hente flerkanals bilder for 10 områder av interesse (ROIs) per dekkglassvæske. Kontroller at Avkastningen inneholder axonal prosesser fra en transfekterte Nevron ved å sjekke GFP-fluorescens, som skal vises punctate.
6. statistisk analyse
- Eksportere bilder som TIF-filer. Laste inn bilder i ÅpneVisning18 ved å klikke fil | Last bildefil.
- Velg Synaptophysin-mOrange bildet som kanal 1, Rogdi-GFP/mGFP bildet som channel 2 og Alexa647 fluorescens bildet som kanal 3.
- Terskelen til ROIs.
- Klikk analyse | Sted området over puncta. Velg verdiene for grenseverdi og Delta intensitet slik at ved visuell inspeksjon, diffus fluorescens er ekskludert, forlater bare vises punctate signaler i bildet av kanal 1 (representerer Synaptophysin-mOrange fluorescens). Holde samme terskelen for alle bilder.
- Overføre disse ROIs på tilsvarende kanal 2 (GFP-Rogdi/mGFP fluorescens) og 3 (Syt1-fluorescens) av hver dekkglassvæske ved å klikke Kjør nå.
Merk: ROIs bør bare bli vurdert hvis cellen er dobbelt-transfekterte. I denne metoden, bør mOrange - og GFP-fluorescens være synlig. - Lagre dataene i redigeringsprogrammet for analyse av loggen loggdata.
- Åpne redigeringsprogrammet analyse Logg under kategorien Windows og kopiere verdiene for hver kanal. Lim inn verdiene for de separate kanalene i et regneark.
- Bestemme gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av Syt1-kanalen på ROIs i begge transfection betingelsene (GFP-Rogdi og mGFP).
- Bruk passende statistiske tester som Student t-test for å fastslå betydelige forskjeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et forventet resultat med denne tilnærmingen er å finne ca 50 dobbel-transfekterte neurons per dekkglassvæske på en tetthet av 50.000 neurons per brønn. Axon av hver Nevron forventes å vise flere hotspots av fluorescently-merket Synaptophysin opphopning, indikerer klynger ofSVs. På funksjonell presynaptic områder colocalizes rekombinant Synaptophysin signalet med vises punctate Syt1 fluorescens. Bruke dobbel transfection, er enten GFP-Rogdi som protein av interesse (figur 1) eller mGFP som kontrollen co uttrykt med rekombinant Synaptophysin.
I dette eksperimentet analysere vi SV resirkulering på presynaptic steder i neurons uttrykke GFP-Rogdi eller mGFP. Hvis kontrollen protein, mGFP, distribueres homogent gjennom hele cellen, men dens innflytelse på synaptic nettsteder trenger fortsatt å bli studert, er det nødvendig å co transfect en andre protein som berikes presynaptically, merket fluorescently Synaptophysin.
Som beskrevet tidligere, gjennomgå celler depolarization-indusert senderen utgivelsen. Som et resultat, tar funksjonelle synapser Syt1 antistoffer til mediet. Etter immunolabeling Syt1 antistoff med et fluorescently merket sekundære antistoff, er omfanget av Syt1 opptak endelig kvantifisert bruker immunosignal (figur 2).
Figur 1. Dobbel-transfekterte celle. Synsfelt viser en dobbel-transfekterte celle uttrykke GFP-Rogdi (A) og Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin er en rikelig synaptic vesicle protein. Dens rekombinant variant kan brukes til merking synaptic boutons. Lokalisering mønster av GFP-Rogdi ligner som Synaptophysin-mCherry (C). Skalere barer = 10 μm. Boksene viser 2,5 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. GFP-Rogdi på funksjonell synapser. Live Syt1 opptak ble utført i double-transfekterte celler uttrykke enten mGFP (grønn) og Synaptophysin-mOrange (rød; A-D) eller GFP-Rogdi (grønn) og Synaptophysin-mOrange (rød; E-H). Syt1 antistoffer opptaket ble utført ved hjelp av en mus monoklonalt antistoff rettet mot luminal domenet Syt1. Etter PFA fiksering, var celler farget med kanin anti-GFP antistoff. Sekundær antistoffer (anti-kanin Alexa 488 og anti-mus Alexa 647) ble lagt til oppdage GFP eller GFP-Rogdi og Syt1, henholdsvis. Autofluorescence av Synaptophysin-mOrange ble brukt til å oppdage presynaptic terminaler (B og F). Vises punctate Syt1 immunofluorescence viser steder av vesicle gjenvinning (blått. C og G). Merk at flertallet av Syt1-merket synapser er lokalisert til ikke-transfekterte neurons. GFP-Rogdi var rettet mot aktive synapser og endre ikke synaptic vesicle gjenvinning (I). 3 uavhengige kultur eksperimenter ble utført (N = 3). Minst 3 coverslips fra hver kultur (totalt 10) ble brukt for analyse. Til slutt, 3 områder per dekkglassvæske ble analysert (n = 30). Student´s t-test viste ingen vesentlig forskjell. Skalere barer = 10 μm. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (S.E.M.). "Født" angir ingen betydning. Dette tallet har blitt endret fra Riemann et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er tre analyser rutinemessig brukes til studere synaptic vesicle (SV) resirkulering. To første omfatter bruk av en) fluorescerende styryl fargestoffer som FM1-43 (som innlemme i membraner er tatt opp til organeller under endocytose og er utgitt etter exocytosis); og b) fluorescently merket rekombinant SV proteiner (som, på overuttrykte, innlemme i proteinaceous gjenvinning maskiner). Hvis de vedlagte fluorophores endrer deres fluorescens avhengig av pH, kan de brukes til å overvåke endringer mellom syreholdig interiøret en SV og pH i den ekstracellulære mediet. De rekombinante proteinene merket med en pH-sensitive variant av GFP kalles Phluorins. De to analyser diskutert har begge vært omtalt tidligere19,20, og fordeler og ulemper av hver har også vært vurdert21.
Her beskriver vi en tredje, veletablerte metode4,5,6,7,9,14. For å teste SV resirkulering, tar vi nytte av det faktum at luminal domenet vesicle-assosiert protein Synaptotagmin-1 (Syt1) blir utsatt til celleoverflaten på exocytosis. Først legger vi til et antistoff rettet mot kultur medium, som er så tatt opp av vesicle under SV gjenvinning luminal domenet. Denne antistoff opptak er visualisert og kvantifisert ved immunofluorescence. Alternativt kan en direkte merket Syt1-antistoff brukes. Etiketten kan være pH-uavhengig, rapportering lokalisering av Syt1-antistoffer både innenfor og på den ytre overflaten av SVs eller pH-avhengig, rapportering lokalisering basert på fluorescens endringer. Vi beskriver også kombinasjonen av denne SV resirkulering analysen med dobbel transfection kulturperler neurons å test hvorvidt et protein av interesse, GFP-Rogdi, mål funksjonelle synapser og påvirker SV resirkulering. GFP-Rogdi gjelder denne tilnærmingen; Imidlertid kan de samme spørsmålene tas for noen protein av interesse.
Denne analysen ble først introdusert i 1992 overvåke spontan resirkulering av SVs4 og ble videreutviklet av samme gruppe å overvåke vakte SV resirkulering12. Sine eksperimenter etablert at Syt1 opptak er følsom for clostridial nervegifter, som blokkerer SV exocytosis12. De viste også at stimulering av kulturer av depolarization på 37 ° C forbedrer internalization Syt1 antistoffer forhold 1) kulturer som holdes på is, hvilke forhindrer de fleste endocytose, og 2) kulturer ruges på 37 ° C uten stimulering, som tillater spontan resirkulering men fremkalle ikke resirkulering12,22. Analysen kan lett sammenligne SV resirkulering mellom to forhold, slik som med og uten et molekyl av interesse. Spesielt fokuserer denne protokollen på å sammenlikne Syt1 antistoff opptak i nærvær versus fravær av et bestemt overexpressed protein. Protokollen kan utvides hvis den relative bidrag av overflaten-bindende, spontane resirkulering og vakte gjenvinning må vurderes. Rugende neurons på is uten stimulering forhindrer for eksempel endocytose, avsløre alle overflate binding av Syt1 antistoffer. Rugende neurons på 37 ° C i basale løsning med Tetrodotoxin forhindrer handlingen potensial forplantning, avsløre noen spontan resirkulering. Dermed avsløre rugende neurons på 37 ° C under stimulerende forhold kan omfanget av evoked SV resirkulering.
Lever celler er følsomme for ideelle fysiologiske forhold; vedlikehold og hva depolarization buffere bør derfor alltid testes for fysiologiske parametere inkludert pH og temperatur. Mens depolarization buffere kan sendes gjennom sterilt filtre etter pH er justert, er hva buffere følsomme for sterilt filtrering. Derfor vi justere sine pH, holde det frosne til bruk og spinne det i en bord sentrifuge til pellets eventuelle bakterier. For hva er det viktig å blande bufferen tilstrekkelig slik tilknytning av plasmider kalsium fosfat krystaller. Kalsium fosfat transfection fungerer best i dag i vitro (DIV) 2-4. Vi bruker merket Synaptophysin, en SV transmembrane protein, som en markør for å identifisere presynaptic terminaler i transfekterte neurons. Merket versjoner av andre SV proteiner som SV2, Synapsin, og VAMP/Synaptobrevin eller aktive sonen molekyler som fagott, RIM, Munc13-1 og kastet kan også brukes.
Både mCherry og mOrange avgir røde fluorescens. Selv om mCherry er lysere enn mOrange, har større utslipp på lange bølgelengder enn mOrange. Derfor for trippel fluorescens bildebehandling med GFP, en rød farge og en dye emitting i 700 nm området, er mOrange et bedre alternativ enn mCherry. For dobbel fluorescens med GFP og en rød farge være mCherry gunstig siden det er lysere fargestoff. For å garantere sparsom hva, bør hva mix ikke være ruges i mer enn 60 minutter. Det er også viktig at inkubasjon i en depolarizing buffer av å sikre exocytosis av alle blemmer. Men må utvidet eksponering depolarizing bufferen unngås. Under bildeopptak er det også viktig å bruke samme eksponeringstider og lys intensiteter å sikre kvantifiserbare sammenligning mellom ulike sett av eksperimenter.
Til slutt, under bildeanalyse, våre protokollen inneholder flere hensyn. Ett område av interesse viser rekombinant Synaptophysin puncta, er lavere intensitet terskelen satt slik at diffus fluorescens er utelukket. Deretter er denne terskelen testet på andre områder og coverslips å observere lignende inkludering av vises punctate signaler og utelukkelse av diffus fluorescens. Når en riktig terskelen identifiseres, brukes den på alle bilder, produsere vises punctate regioner av interesse (ROIs) i rekombinant Synaptophysin (merket med mCherry eller mOrange) kanalen. Til slutt, bestemmes Syt1 intensitet for ROIs9.
Vår tilnærming er optimalisert for sparsom transfection. Vi analyserer presynaptic funksjon i komplekse omgivelser hvor det er SV resirkulering i axons av transfekterte neurons omgitt av untransfected neurons. I dette oppsettet tillater dobbel-hva oss å manipulere neuronal funksjon og finne presynaptic terminalene på transfekterte neurons. Transfekterte presynaptic nevroner som kontakt untransfected postsynaptic neurons er en viktig faktor i å vurdere en presynaptic Nevron effekter på SV resirkulering. Innstillingen kan også lett tilpasses test hvorvidt en postsynaptic manipulasjon fører til presynaptic endringer. I dette tilfellet sparsom transfection av neurons med et protein som er rettet mot postsynaptic nettsteder vil lokalisere postsynaptic områdene av transfekterte neurons, og Syt1 opptak bestemmes ved synaptic boutons untransfected neurons.
Når sparsom transfection ikke er nødvendig, kan forskjellige hva protokoller brukes. For eksempel, innebærer hva med Lipofectamine på DIV 7 - 8 resultater i høyere transfection priser, men det også sterkere uttrykk i hver transfekterte celle9. Viral signaltransduksjon kan videre føre til uttrykk i nesten 100% for helstøpt neurons14,23,24. Eksperimenter sikte på overvåking SV resirkulering, kan hva utføres for en enkelt protein eller utelatt fullstendig. For eksempel når samlet synaptic resirkulering forhold mellom neurons fra wildtype og genmodifiserte er mus, merking individuelle neurons av hva ikke nødvendig. I tillegg kan dette immunolabeling av endogene proteiner. Hvis transfection mislykkes, er det viktig å teste hva buffer med et valideres plasmider eller bruke en buffer med forskjellige pH (se forberedelse av transfection buffer). Bruker endotoxin gratis DNA forberedelser synes også å være avgjørende. Immunostaining internalisert Syt1 antistoffer fungerer i både PFA-fast og metanol-fast. Det bør også bemerkes at GFP og RFP autofluorescence er tapt etter metanol fiksering. Hvis GFP eller RFP vil være lokalisert i metanol-fast celler, må disse proteinene immunolabeled. Hvis Syt1 opptak mislykkes, bør depolarization tid og K+ konsentrasjon i depolarization buffer endres tilsvarende. Mange protokollen varianter har blitt publisert, depolarization ganger fra 90 s25 -60 min12, og med K+ konsentrasjoner av 45 mM, 50 mM, 70 mM og 110 mM6,25,26 ,27. Når tilbakevendende aktivitet må unngås, kan du også legge glutamat reseptor blokkere under depolarization. Til slutt, mens høy K+ depolarization antas å være den sterkeste stimulans, action potensialer kan indusere SV resirkulering gjennom flere fysiologiske stimuli22,28. Forskjeller i Syt1 antistoff opptak effekt kan oppstå i rotte og mus kulturer. I vår metode, produserer monoklonale musen anti-Syt1 klone 604.2 (RRID:AB_993036) sterkere flekker i rotte kulturer enn i musen kulturer, mens polyklonale kanin anti-Syt1 antistoffer (RRID:AB_11042457) gir sterkere farging i musen kulturer, men flere notater av forsiktighet er omtalt nedenfor.
Flere advarsler om bruk av anti-Synaptotagmin antistoffer for opptak i SVs bør vurderes. Først fremmer N-glykosylering av asparagine 24 av Syt1 endocytotic opptaket av protein29,30. Asparagine 24 er del av luminal domenet Syt1. Mus og kanin antistoffer som vi bruker er rettet mot aminosyrer 1-12 og 1-8, henholdsvis av Syt1. Mens deres epitopes ikke overlapper med N-glykosylering området, kan ikke steric hindring eller omvendt, en induksjon av opptak av antistoff bindingen utelukkes. Mutasjon av N-glykosylering området i Syt1 endrer ikke the kinetics av endocytose og med Syt1 til SVs. Det øker brøkdel av Syt1 igjen på ytre plasma membran overflaten når endocytose er indusert av svak stimuli. Når sterk stimuli, som høy K+ depolarization, brukes, er ingen reduksjon i Syt1-opptak observert30. Samlet hvis antistoffer forstyrret N-glykosylering området på noen måte de kan forårsake en endring i SV endocytose sammenlignet antistoff-gratis forhold, men denne endringen skal ligne for eksperimentet (i vårt tilfelle overuttrykte GFP-Rogdi) og kontrollen (i vårt tilfelle uttrykk for GFP). I tillegg kan polyklonale antistoffer være mer sannsynlig å indusere steric problemer og crosslinking enn monoklonale antistoffer, fordi kopi flere Antistoffene binder seg til epitope. Vi kjenner ikke til systematiske studier sammenligne tilgjengelig antistoffer med hverandre; men har noen studier adressert gyldigheten av visse antistoffer. For eksempel da SV resirkulering kinetics ble analysert ved hjelp av monoklonale musen anti-Syt1 antistoff klone 604.2 og Synaptophluorin-fluorescens endringer i en direkte sammenligning, ble lignende resultater innhentet, godkjenner bruk av denne antistoff28. Lasting SVs polyklonale kanin Syt1 antistoffer og opptak synaptic overføring electrophysiologically avslørt at de lastet synapser hadde redusert synaptic overføring på en måte som minner om tap-av-funksjon mutanter av Syt1. Derfor påvirker disse polyklonale antistoffer synaptic overføring. Faktiske opptaket viste både spontane og vakte gjenvinning, tyder på at en polyklonale antistoffer er egnet til å overvåke en runde med SV resirkulering, men forsiktighet bør utvises ved tolke resultatene etter opptak av disse antistoffene31.
Tre analyser er rutinemessig brukes til studere SV resirkulering, som inkluderer membran merking med styryl fargestoffer, overuttrykte Phluorins, og Syt1-antistoff opptaket utføres her. Alle tre analyser kan brukes til å fastslå endocytotic og exocytotic bein av SV resirkulering. Mens alle tre analyser har kraftig fordeler, har hver også en prinsippet påminnelse. FM fargestoffer merke hele celleoverflaten og blir tatt opp i cellen med alle resirkulering membraner. Phluorins må være introdusert av overuttrykte. Syt1-antistoffer etiketten endogene protein, men noen antistoffer kan påvirke sin funksjon under visse betingelser. Hver påminnelse kan imidlertid være hensiktsmessig adressert21.
Samlet har Syt1 antistoff opptaksanalyse tjent ulike formål. Den ble først brukt selektivt merke SVs gjennomgår spontan eller vakte gjenvinning, henholdsvis28,31,32,33. Sekund, det ble brukt til å bestemme effekten av et stoff eller protein på omfanget av SV gjenvinning; for eksempel, å vise at BDNF forbedrer både spontane og vakte SV resirkulering6. Tredje, den ble brukt til å bestemme antall synapser resirkulering SVs i prosent av totalt antall morphologically definerte synapser34,35. Dette avslørt at overexpressing postsynaptic celle vedheft molekyl Neuroligin-1 øker andelen synapser resirkulering SVs25 og at å redusere uttrykke av AMPA-type glutamat reseptorer reduserer andelen synapser resirkulering SVs, øke prosentandelen av presynaptically stille synapser36. I tillegg ble analysen brukt til å analysere mobilitet av merket SVs27 og bestemme lokaliseringen av Syt1 med nanoscopy13,22,33. Denne metoden brukes til slutt fortsatt å test hvorvidt visse proteiner lokalisere til funksjonelle synapser9. Syt1 antistoffer kan også brukes for langsiktige studier, der antistoffer forblir i nervecellene for dagene etter opptak37. Dette kan kombineres med en ny runde med opptak bruker en separat merket Syt1 antistoffer eller et antistoff rettet mot luminal domenet til et annet SV protein. Dette gjør at testing SVs resirkulert først og som resirkulere ved slutten av et eksperiment. Det ville være interessant å tilpasse denne analysen til mer intakt modellsystemer, som akutt skiver og organotypic skive kulturer. I prinsippet opptaksanalyse tillater sammenligning av wildtype genetisk endret dyr og kan kombineres med viral leverings- eller biolistics, dvs., en "gene gun," manipulere protein uttrykk i disse modellsystemer. I slike systemer, kan påvirkning av visse forstyrrelser på presynaptic maskiner, overvåket av opptaksanalyse og nettverk dynamics studeres samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Irmgard Weiss for ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av DFG via klyngen kompetansesenter for mikroskopi på nanometer området og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB, B1-7 til T.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K.
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
