Summary
我们描述了一种用于培养神经元的突触囊泡 (SV) 循环的光学检测方法。将该协议与双转染相结合, 以表达突触前标记和感兴趣的蛋白质, 使我们能够定位突触前的部位, 它们的突触囊泡再生能力, 并确定感兴趣的蛋白质的作用。
Abstract
在主动突触前神经终端, 突触囊泡经历了外周和吞的循环。在回收过程中, SV 跨膜蛋白的腔域在细胞表面暴露。其中一种蛋白质是 Synaptotagmin-1 (Syt1)。对 Syt1 的腔域进行的抗体, 一旦添加到培养基中, 就会在 endocytotic 周期内被占用。这种吸收量与 SV 循环的数量成正比, 可以通过免疫荧光进行量化。在这里, 我们结合 Syt1 抗体摄取与双转染培养海马神经元。这使我们能够 (1) 根据重组突触前标记突触素的表达来本地化突触前站点, (2) 使用 Syt1 摄取确定它们的功能, (3) 描述了一种感兴趣的蛋白质的靶向性和作用, GFP-Rogdi。
Introduction
研究突触囊泡回收在确定突触前的性质如何改变, 无论是在突触可塑性或响应突触功能的扰动。研究 Synaptotagmin-1 (Syt1) 抗体摄取提供了一种测量 SV 循环量的方法。Syt1 是一种 SV 相关蛋白, 充当 Ca2 +传感器, 是 exocytotic 释放神经递质1,2的必要条件。它是一种跨膜蛋白, 具有 C 末端细胞质域外的 sv 和 n-端腔内域的 sv3。在胞吐作用过程中, Syt1 的腔域会暴露于外界介质中。对于这个外在的媒介, 我们增加抗体针对细胞质领域, 在吞期间被内部化。这些抗体可以是预共轭与显影或 immunostained 与二级抗体4,5,6,7。结果 immunosignal 的荧光强度与 SV 回收量成正比。这种方法可用于确定本构和退极化诱发 SV 循环6,8。
Syt1 摄取化验可以执行后, 病毒介导的基因转移到几乎所有的细胞在盘子里或经过稀疏转染少量的细胞。本方法将原发海马神经元的稀疏双转染法与磷酸钙9结合使用。我们使用一种已知的重组标记蛋白积累在 presynapses, 荧光标记突触素, 找到突触前终端和过度表达 tshr 我们的蛋白质的兴趣, Rogdi。这使我们可以测试是否 Rogdi 目标功能突触和影响 SV 回收。基因编码 Rogdi 最初是在屏幕上发现的果蝇突变体的特点是受损的记忆10。在人类中, Rogdi 基因突变导致一种罕见的破坏性疾病, 称为 Kohlschütter-Tönz 综合征。患者患有牙釉质畸形、pharmacoresistant 癫痫、精神运动迟缓;然而, 基因产物的亚细胞定位仍然是难以捉摸的11。因此, Syt1 摄取检测为 GFP 标记的 Rogdi 在功能突触9的定位提供了关键的证据。
这种吸收技术有几个好处。首先, 通过测量 Syt1 荧光标签的荧光强度, 可以实时观测到7、12、6、9的活度成像, 从而实现 SV 循环。此外, 还开发了几种 Syt1 抗体变种。有未加标签的变体, 可以在固定后使用标准染色协议标记为继发抗体, 并附有荧光标签的预共轭变种。最后, 抗体为基础的荧光是有利的, 因为大量选择的商业可用的二级或共轭染料, 可以使用。
当固定和染色神经元时, 也有可能染色额外的蛋白质和进行定位分析。这可以帮助确定它们的位置与回收 SVs 的关系。荧光标签的强度是 SV 回收量的直接度量。此外, 抗体有选择地标记 Syt1-containing 结构, 导致高特异性和小背景荧光4。也可以使用不同的刺激协议, 如退极化缓冲器或电刺激协议9,12,13,14。但是, 在不刺激神经元培养15的情况下, 可以测量基底 SV 循环。
我们的方法专门解决了双转染神经元的 Syt1 抗体摄取与继发抗体 immunolabeling 固定后。但是, 我们在讨论中提到了所有常规使用的方法变体, 使观众有机会根据具体需要调整该协议。
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Protocol
没有研究与活动物进行。有关安乐死动物获得细胞培养的实验得到了当地动物保护当局 (Tierschutzkommission Universitätsmedizin) 的批准, T10/30 批准号。这些实验是通过批准的协议进行的。
1. 初级海马细胞培养
- 制备大鼠海马的离解细胞培养在胚胎天 1916,17。将12毫米盖玻片上的细胞涂上聚乙烯亚胺 (裴), 在24井的菜肴中, 密度为 5万-6万细胞/井。使用细胞计数室和相位对比光学检查密度。
- 培养神经元3天 (天在体外(DIV) 3) 在24井板材在孵化器在37°c 与 5% CO2。
- 使用透射光显微镜 (例如,相位对比光学放大 10-20X) 评估细胞健康指标的盖玻片。检查以下健康状况指标: 清晰的相衬晕, 无串珠结构的突起, 无躯体聚类或突起捆绑。
2. 转染
注: 以下协议是指对3口井进行双转染。然而, 当准备足够的4口水井时, 该议定书的效果最好。
- 在锥形瓶中准备500毫升转染缓冲器 (274 毫米氯化钠, 10 毫米氯化钾, 1.4 毫米 Na2HPO4, 15 毫米葡萄糖, 42 毫米 HEPES)。
- 溶出8.0 克氯化钠, 0.37 克氯化钾, 0.095 克钠2HPO4, 葡萄糖1.35 克, HEPES 5.0 毫升的锥形瓶中的蒸馏水。
- 使用 ph 计将 ph 值调整为6.95 和1米氢氧化钠。
- 用蒸馏水将容积调整到500毫升, 用 ph 计检查 ph 值。
- 使 20-30 毫升整除数的转染缓冲器具有以下 pH 值由吹打1米氢氧化钠到转染缓冲器: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06。
注: 转染缓冲液的 pH 值对转染效果至关重要。 - 要测试哪个转染缓冲器会导致最大数量的被染细胞, 请从6.96 到7.11 测试每个 pH 值。使用 2.2-2.11 中描述的转染方法和一种表达 GFP 的验证质粒。确定每盖玻片转染的缓冲液 pH 值, 以评估哪个缓冲器工作最好。
- 整除最高转染效率为2毫升的缓冲离心管冷冻和存储管在-20 摄氏度。
- 预暖的减少血清培养基, 细胞培养培养基, 蒸馏水到37°c 在水浴。
- 在1.5 毫升离心管中准备转染组合。在层流罩下工作, 确保无菌工作条件。
- 混合7.5 µL 2 米氯化钙与4µg 每个无内毒素的 DNA (突触素 mOrange 和 mGFP/GFP-Rogdi)。在1.5 毫升的离心管中加入水, 达到60毫升的总容积。
- 将60毫升的转染缓冲器添加到混合中。为了获得最好的结果, 添加转染缓冲滴, 同时摇动 DNA 混合轻轻地在漩涡。
- 室温 (RT) 孵育20分钟。在孵化时间内, 在层流罩旁边放置管, 避免摇晃孵化管。
- 在层流罩下, 用1000毫升吸管从油井中取出细胞培养介质 ("条件介质"), 并将其存储在孵化器的单独容器中。
- 每井加500毫升的血清培养基。孵化细胞在37°c 和 5% CO2 , 直到20分钟潜伏期 (步骤 2.3.3) 结束。
- 通过吹打几滴, 加入30毫升的转染混合。丢弃管子底部的残渣。
- 在所有的水井都提供了转染混合, 轻轻摇动24井板, 以确保分配的转染混合在介质中。
- 在37摄氏度和 5% CO2上孵化水井60分钟。
- 去除并丢弃转染混合, 用细胞培养培养基清洗三次。在每一个井中添加1毫升细胞培养培养基, 并在 RT 中孵化30秒. 除去750毫升培养基, 加入相同数量的新鲜培养基。重复这三次。
注意: 洗涤步骤至关重要。保持每一个井的时间至少没有介质 (i., 拆卸和更换好), 并轻轻地添加洗涤介质。 - 去除和丢弃细胞培养培养基, 再加450毫升的条件培养基。
- 让神经细胞成熟在孵化器在37°c 和 5% CO2到 DIV 10。
3. 刺激和 Syt1 吸收
注: 以下协议适用于3口井的吸收。对于任何其他数量的井的退极化, 相应地调整金额。
- 在锥形瓶中准备50毫升的10x 退极化缓冲器 (640 毫米氯化钠, 700 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁2, 20 毫米 CaCl2, 300 毫米葡萄糖, 200 毫米 HEPES, pH 7.4)。
注意: 退极化缓冲可以保持在4摄氏度, 几个星期。如果还使用非去极化型解决方案, 请准备一个 10x Tyrode 的解决方案, 包括 1290年 mM 氯化钠, 50 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁2, 20 毫米 CaCl2, 300 毫米葡萄糖, 200 毫米 HEPES pH 7.4, 以比较刺激诱导循环与自发回收。稀释至1x 后, 在使用前添加1µM 的河豚毒素以阻止动作电位的产生。- 溶解1.87 克氯化钠, 2.61 克氯化钾, 0.1 克氯化镁2-6H20, 0.15 克 CaCl2-2H2o 和3.0 克 glucose-1 H2o 和 2.38 g HEPES 在50毫升蒸馏水在锥形瓶。用氢氧化钠和无菌过滤溶液来调节 pH 值。稀释1:10 的冷凝水中的缓冲液, 达到1x 浓度。
- 在 1x PBS (pH 7.4) 中准备4% 多聚甲醛 (粉煤灰), 用于刺激后的固定。
- 在 1x PBS 中, 500 毫升4% 粉煤灰, 溶解20克多聚甲醛在450毫升蒸馏 H2O。
注: 加热溶液可能加速溶解, 但不加热溶液超过70摄氏度, 因为煤灰可能会解体。
注意: 粉煤灰是有毒的, 潜在的致癌性和致畸。与煤灰一起工作时戴上手套, 在通风罩下干活, 避免进食。 - 让解决方案冷却 RT 和添加50毫升的 10x PBS 股票解决方案。使用 ph 计, 用氢氧化钠/HCl 将 ph 值调整为7.4。
- 在 1x PBS 中, 500 毫升4% 粉煤灰, 溶解20克多聚甲醛在450毫升蒸馏 H2O。
- 预热600毫升的1x 退极化缓冲器和10毫升的细胞培养培养基到37°c 在水浴。
- 添加1毫升的小鼠 anti-Syt1 抗体 (克隆 604.2) 到1x 退极化缓冲和漩涡10秒。
- 从单元格中移除和丢弃单元格培养基。添加200毫升的退极化抗体混合到每个井和孵化5分钟37摄氏度和 5% CO2在孵化器。
- 去除和丢弃去极化抗体混合, 用细胞培养培养基清洗三次。在每一个井中加入1毫升细胞培养培养基, 在 RT 中孵育30秒. 除去750毫升培养基, 加入相同数量的新鲜培养基。重复三次。
- 去除和丢弃细胞培养基, 在 1x PBS 中加入300毫升4% 的粉煤灰。孵育20分钟, 在4摄氏度。
- 每5分钟洗三次, 每个 1x PBS。
注意: 协议可以在这里暂停。
4. 免疫细胞化学
- 准备50毫升的阻塞缓冲器。
注: 阻塞缓冲器可保持在-20 摄氏度, 数月。- 将2.5 克蔗糖和1克牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在5毫升的 10x PBS 溶液中。添加1.5 毫升10% 洗涤剂库存解决方案。搅拌解决方案, 直到所有的组件已正确溶解, 并添加蒸馏 H2O, 直到达到最终的体积50毫升。整除解决方案并冻结存储整除数。
- 稀释二次, 荧光偶联抗体 (针对主要 Syt1-antibody 种) 在每井200毫升的阻塞缓冲液稀释1:1000。
- 卸下并丢弃包含盖玻片的每个井中的 1x PBS。
- 在每一个井中加入200毫升的阻断缓冲抗体混合物, 在 RT 中孵化60分钟。
注意: 由于次级抗体是光敏的, 所有前进的步骤必须在黑暗中执行。 - 孵化后, 用1毫升 1x PBS 冲洗细胞三次, 5 分钟。
- 用嵌入介质将盖玻片嵌入显微镜幻灯片中。
- 在显微镜滑梯上添加7毫升的嵌入介质。用注射器把盖玻片从24井板上取出, 然后用镊子抓。
注意: 盖玻片表面的细胞容易受损, 因此必须小心处理镊子。 - 将盖玻片浸入蒸馏水中, 去除 PBS, 并通过触摸一个边缘到软组织来仔细干燥。
- 将盖玻片翻转到嵌入介质滴上, 使带细胞的表面面对显微镜滑动, 从而将细胞嵌入到嵌入介质中。
- 在显微镜滑梯上添加7毫升的嵌入介质。用注射器把盖玻片从24井板上取出, 然后用镊子抓。
- 将幻灯片放在引擎盖下面晾干 1-2 小时 (覆盖它们以避免曝光), 并将它们存储在显微镜下的滑动盒中, 温度为4摄氏度。
注意: 协议可以在这里暂停。
5. 微观分析
- 盖玻片干燥后, 将其置于显微镜下, 目标和摄像头。
- 调整每个通道的曝光时间, 使少量像素过度曝光, 以确保灰度值的最大分布。
注意: 虽然通道之间的曝光时间可能不同, 但一个通道应保持恒定, 以确保盖玻片之间的可比性。 - 获取每盖玻片10个感兴趣区域 (ROIs) 的多通道图像。检查 ROI 是否包含经转染的神经元的轴突过程, 检查 GFP 荧光, 这应该是有点的。
6. 统计分析
- 将图像导出为. tif 文件。通过单击 "文件", 将图像加载到 OpenView18中 |加载图像文件。
- 选择突触素 mOrange 图像作为通道 1, Rogdi GFP/mGFP 图像作为通道 2, Alexa647 荧光图像作为通道3。
- ROIs 的门槛。
- 点击分析|把面积超过 puncta。选择阈值和增量强度值, 以便在目视检查时, 排除漫射荧光, 只留下通道 1 (代表突触素-mOrange 荧光) 图像中的点状信号。对所有图像保持相同的阈值。
- 通过单击 "立即执行", 将这些 ROIs 转移到相应的通道 2 (GFP-Rogdi/mGFP 荧光) 和每个盖玻片区域的 3 (Syt1-fluorescence)。
注意: 只有当单元格被双向转染时, 才应考虑 ROIs。在这种方法中, mOrange 和 GFP 荧光应该是清晰可见的。 - 通过单击 "日志数据" 将数据保存到分析日志编辑器中。
- 在 " Windows " 选项卡下打开分析日志编辑器, 并复制每个通道的值。将单独通道的值粘贴到电子表格中。
- 确定 Syt1-channel 在 ROIs 转染条件下的平均荧光强度 (GFP-Rogdi 和 mGFP)。
- 应用适当的统计测试, 如学生的t 检验, 以确定显著的差异。
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Representative Results
这种方法的预期结果是每盖玻片大约有50个双转染神经元, 每一个密度为5万个神经元。每个神经元的轴突将显示荧光标记的突触素堆积的多个热点, 表明簇 ofSVs。在功能突触前部位, 重组突触素信号 colocalizes 有点 Syt1 荧光。使用双转染, 无论是 GFP-Rogdi 作为感兴趣的蛋白质 (图 1) 或 mGFP, 因为该控制与重组突触素共同表达。
在本实验中, 我们分析了 Rogdi 或 mGFP 神经元中突触前点的 SV 循环。如果控制蛋白, mGFP, 是均匀分布在整个细胞, 但它在突触部位的影响仍然需要研究, 那么有必要共同染的第二种蛋白质 presynaptically 丰富, 荧光标记突触素.
如前所述, 细胞接受退极化诱导的发射机释放。因此, 功能性突触将 Syt1 抗体添加到培养基中。immunolabeling 后, Syt1 抗体与荧光标记的继发抗体, Syt1 摄取的程度最终量化使用 immunosignal (图 2)。
图1。双转染细胞.视野显示一个双转染细胞, 表达 GFP-Rogdi (a) 和突触素-mCherry (B)。突触素是一种丰富的突触囊泡蛋白。它的重组变种可用于标记突触 boutons。GFP-Rogdi 的定位模式类似于突触素-mCherry (C)。刻度条 = 10 微米。框显示2.5X 放大倍数。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。GFP-Rogdi 在功能性突触.在双转染细胞中进行活 Syt1 吸收, 表达 mGFP (绿色) 和突触素-mOrange (红色;A D) 或 GFP-Rogdi (绿色) 和突触素-mOrange (红色;E H)。用小鼠单克隆抗体对 Syt1 的腔域进行 Syt1 抗体摄取。在粉煤灰固定后, 细胞与兔抗 GFP 抗体染色。第二抗体 (抗兔 alexa 488 和抗鼠 alexa 647) 被添加到检测 gfp 或 gfp-Rogdi 和 Syt1, 分别。用突触素-mOrange 的自体荧光检测突触前终端 (B 和 F)。点 Syt1 免疫荧光指示囊泡回收部位 (蓝色;C 和 G)。请注意, 大多数 Syt1-labeled 突触都被定位到未转染的神经元。GFP-Rogdi 是针对主动突触, 并没有改变突触囊泡回收 (I)。进行了3项独立的文化实验 (N = 3)。从每种文化中至少3盖玻片 (共 10) 用于分析。最后, 对每盖玻片3个区域进行了分析 (n=30)。Student´s t 检验结果无显著性差异。刻度条 = 10 微米。误差线表示平均值 (S.E.M.) 的标准误差。"生理盐水" 表示没有意义。这个数字已被修改从黎曼等。9请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
有三项常规用于研究突触囊泡 (SV) 回收。前两项包括使用 a) 荧光苯乙烯染料, 如 FM1-43 (纳入膜, 在吞期间被纳入细胞器, 并在胞吐作用后释放);和 b) 荧光标记重组 SV 蛋白 (在过度表达后, 纳入蛋白质回收机械)。如果附加的显影根据 pH 值改变荧光, 它们可以用来监测 SV 酸性内部和胞外培养基 ph 值的变化。用 GFP 的 pH 敏感变种标记的重组蛋白称为 Phluorins。所讨论的两种分析方法都有以前19、20的特点, 每项研究的利弊也被审查了21。
在这里, 我们描述了第三个, 建立良好的方法4,5,6,7,9,14。为了测试 SV 循环, 我们利用了囊泡相关蛋白 Synaptotagmin-1 (Syt1) 的腔域在胞吐作用上暴露于细胞表面的事实。首先, 我们添加一个抗体针对腔域的培养基, 然后由囊泡在 SV 回收。这种抗体摄取是可视化和量化的免疫荧光。或者, 可以使用直接标记的 Syt1-antibody。该标签可以是 ph 无关, 报告 Syt1-antibody 的内部和外部表面的 SVs, 或 pH 依赖性, 报告本地化基于荧光的变化。我们还描述了这种 SV 循环检测与双转染培养神经元的结合, 以测试是否有兴趣的蛋白质, GFP-Rogdi, 目标功能性突触和影响 SV 回收。GFP-Rogdi 是具体的这种方法;然而, 同样的问题可以解决任何感兴趣的蛋白质。
这项检测是在1992年首次引入监测 SVs4的自发循环, 并由同一组进一步开发, 以监测诱发 SV 回收12。他们的实验表明, Syt1 摄取对梭毒素敏感, 阻断 SV 胞吐作用12。他们还表明, 通过37摄氏度的退极化来刺激文化增强了 Syt1 抗体的内化性, 而在冰上保持的是1种, 它阻止了大多数吞和 2) 培养在37摄氏度没有刺激的文化, 这允许自发回收, 但不唤起回收12,22。该方法可以很容易地比较两个条件之间的 SV 循环, 如有和没有一个感兴趣的分子。特别是, 本议定书的重点是比较 Syt1 抗体摄取在存在与缺乏某种抗原蛋白。如果需要评估表面结合、自发循环和诱发回收的相对贡献, 则可以扩大该议定书。例如, 在没有刺激的冰上孵化神经元可以防止吞, 揭示 Syt1 抗体的任何表面结合。用河豚毒素在基底溶液中孵化37摄氏度的神经元, 防止动作电位的传播, 揭示任何自发循环。因此, 在刺激条件下孵化神经元的37°c 可以揭示诱发 SV 循环的程度。
活细胞对理想的生理条件敏感;因此, 维护、转染和退极化缓冲器应始终测试包括 pH 值和温度在内的生理参数。当 pH 值调整后, 可以通过无菌过滤器传递退极化缓冲器, 转染缓冲器对无菌过滤非常敏感。因此, 我们调整其 pH 值, 保持它冻结, 直到使用, 并旋转它在一个台式离心机, 以颗粒的任何细菌。对于转染, 必须充分混合缓冲, 以确保质粒与磷酸钙晶体的关联。磷酸钙转染工作最好在天体外(DIV) 2-4。我们使用标记突触素 (SV 跨膜蛋白) 作为识别转染神经元突触前终端的标记。其他 SV 蛋白的标记版本, 如 SV2, 突触素, 和鞋面/Synaptobrevin 或活跃区域分子, 如巴松管, RIM, Munc13-1, 和铸件也可以使用。
mCherry 和 mOrange 都发出红色荧光。虽然 mCherry 比 mOrange 亮, 但它在长波长的发射量比 mOrange 大。因此, 对于三荧光成像与 GFP, 红色染料和染料发射在 700 nm 范围内, mOrange 是一个更好的选择比 mCherry。对于双荧光与 GFP 和红色染料, mCherry 可能是有利的, 因为它是更明亮的染料。为了保证稀疏转染, 转染组合不应孵化超过60分钟。同样重要的是, 在去极化型缓冲中孵化是确保所有囊泡胞吐作用的适当时间长度。但是, 必须避免对去极化型缓冲区的扩展暴露。在图像采集过程中, 同样重要的是应用相同的曝光时间和光照强度, 以确保不同实验组之间的量化比较。
最后, 在图像分析中, 我们的协议包含了一些考虑因素。对于显示重组突触素 puncta 的一个感兴趣区域, 设置了低强度阈值, 从而排除了漫射荧光。接下来, 在其他区域和盖玻片上测试这个阈值, 观察类似的包含点信号和排除漫射荧光。一旦确定了适当的阈值, 就会将其应用于所有图像, 在重组突触素 (标记为 mCherry 或 mOrange) 通道中产生有点的感兴趣区域 (ROIs)。最后, 确定了 ROIs9的 Syt1 强度。
我们的方法是优化的稀疏转染。我们分析突触前功能在一个复杂的环境中, 有 SV 循环的神经轴的转染神经元包围的 untransfected 神经元。在这个设置中, 双转染使我们能够操纵神经元功能, 并找到转染神经元的突触前终端。转染突触前神经元接触 untransfected 突触后神经元是评估突触前神经元对 SV 循环的影响的一个重要因素。该设置还可以很容易地适应, 以测试突触后操作是否导致突触前更改。在这种情况下, 以蛋白为靶向突触的神经元的稀疏转染将会定位被转染神经元的突触部位, Syt1 吸收可以在 untransfected 神经元突触 boutons 中确定。
当不需要稀疏转染时, 可以应用不同的转染协议。例如, 在 DIV 7-8 上转染脂质体会产生更高的转染速率, 但它也需要在每一个细胞9中更强的表达。此外, 病毒传导可以导致近100% 的培养神经元的表达14,23,24。在对 SV 循环进行监测的实验中, 转染可用于单个蛋白质或完全排除。例如, 当对 wildtype 和转基因小鼠的神经元进行整体突触循环比较时, 不需要通过转染标记单个神经元。此外, 这使得 immunolabeling 内源蛋白。如果转染失败, 重要的是测试转染缓冲与验证质粒或使用一个不同 pH 值的缓冲 (参见准备转染缓冲)。使用内毒素游离 DNA 制剂也显得至关重要。染色内化 Syt1 抗体在粉煤灰固定和甲醇固定样品中工作。还应注意的是, 在甲醇固定后, GFP 和 RFP 自发荧光消失。如果 GFP 或 RFP 需要在甲醇固定细胞中进行定位, 这些蛋白质必须 immunolabeled。如果 Syt1 吸收失败, 则应相应地改变去极化缓冲中的退极化时间和 K+浓度。许多协议变体已经发布, 从九十年代25到60分钟12, 并与 K+浓度45毫米, 50mM, 70 毫米, 110 毫米6,25,26 ,27。当复发活动必须防止, 谷氨酸受体阻滞剂也可以添加在退极化。最后, 虽然高 K+去极化被认为是最强的刺激, 动作电位可以诱发 SV 循环通过更多的生理刺激22,28。Syt1 抗体摄取效果的差异可能发生在鼠和小鼠的文化。在我们的方法中, 单克隆小鼠 anti-Syt1 克隆 604.2 (RRID:AB_993036) 在大鼠培养中比在小鼠培养中产生更强的染色, 而多克隆兔 anti-Syt1 抗体 (RRID:AB_11042457) 在小鼠培养中产生较强的染色, 但下文将讨论几点谨慎的注意事项。
应该考虑一些关于使用抗 Synaptotagmin 抗体来摄取 SVs 的警告。首先, n-糖基化的天门冬24的 Syt1 促进 endocytotic 摄取的蛋白质29,30。天门冬24是 Syt1 腔域的一部分。我们使用的老鼠和兔抗体是针对氨基酸 1-12 和 1-8, 分别为 Syt1。虽然它们的表位不与 n-糖基化的站点重叠, 但空间障碍或相反地, 通过抗体结合诱导吸收是不能排除的。Syt1 中 n-糖基化部位的突变不会改变吞的动力学和 Syt1 对 SVs 的靶向性。当吞由微弱刺激诱发时, 它增加了外层等离子膜表面 Syt1 残留的分数。当强烈的刺激, 如高 K+退极化, 被应用, 没有减少 Syt1-uptake 被观察30。总的来说, 如果抗体在某种程度上干扰了 n-糖基化的部位, 它们可能会导致 SV 吞的变化, 而不是抗体的条件, 但这种变化应该类似的实验 (在我们的情况下, Rogdi 的过度表达的 GFP) 和控件 (在我们的例子中是 GFP 的表达式)。另外, 多克隆抗体可能比单克隆抗体更容易诱发位点问题和交联, 因为抗体的复制数量会与表位数绑定。我们不知道有系统地研究比较现有的抗体;然而, 一些研究已经解决了某些抗体的有效性。例如, 当利用单克隆小鼠 anti-Syt1 抗体克隆604.2 和 Synaptophluorin 荧光法对 SV 循环动力学进行直接比较时, 获得了类似的结果, 验证了该抗体28的使用情况。加载 SVs 与多克隆兔 Syt1 抗体和记录突触传输 electrophysiologically 显示, 负载突触传递减少突触传播的方式, 使人联想到功能丧失的 Syt1 突变体。因此, 这些多克隆抗体确实会影响突触传播。实际摄取表明, 自发和诱发的循环再造, 表明多克隆抗体适合监测一轮 SV 回收, 但应谨慎, 当解释结果后, 吸收这些抗体31。
三种测定方法通常用于研究 SV 回收, 其中包括苯乙烯染料的膜标签、Phluorins 的过度表达以及这里所进行的 Syt1-antibody 摄取。所有三种化验都可用于确定 SV 回收 endocytotic 和 exocytotic 腿。虽然所有三种化验都有很强的益处, 但每一个都有一个原则告诫。FM 染料标签整个细胞表面并且被占去了入细胞与所有再生膜。Phluorins 必须通过过度表达来引入。Syt1-antibodies 标签内源蛋白, 但某些抗体可能影响其功能在一定条件下。但是, 每个警告都可以适当地处理21。
总体而言, Syt1 抗体摄取检测具有多种用途。首先, 它被用来选择性地标签 SVs 进行自发或诱发循环, 分别为28,31,32,33。第二, 它被用来确定药物或蛋白质对 SV 循环的影响程度;例如, 表明 BDNF 增强自发和诱发 SV 循环再造6。第三, 它被用来确定的突触的数量与回收 SVs 的百分比的总数量的形态学定义的突触34,35。这表明, overexpressing 突触后细胞黏附分子 Neuroligin-1 增加了突触的百分比与循环再造 SVs25 , 减少 AMPA 型谷氨酸受体表达降低的百分比突触与回收 SVs, 增加 presynaptically 无声突触的百分比36。此外, 该化验被用来分析标签 SVs27的流动性, 并确定 Syt1 的本地化使用 nanoscopy13,22,33。最后, 该方法仍然用于测试是否某些蛋白质定位到功能突触9。Syt1 抗体也可用于长期研究, 其中抗体在神经元中保持数天后吸收37。这可以结合第二轮吸收使用单独标记的 Syt1 抗体或抗体针对不同的 SV 蛋白的腔域。这允许测试最初回收的 SVs, 并在实验结束后进行回收。这将是有趣的, 以适应更完整的模型系统, 如急性切片和脊髓切片培养。原则上, 摄取化验允许比较 wildtype 和转基因动物的组织, 或者结合病毒传递或基因枪法, i. e., 一个 "基因枪" 来操控这些模型系统中的蛋白质表达。在这种系统中, 对突触前机械的某些扰动的影响, 通过吸收试验和网络动力学的监测, 可以同时进行研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Irmgard 维斯的专家技术援助。这项工作得到了 DFG 的支持, 通过显微镜在纳米范围和分子生理学的大脑 (CNMPB, B1-7, T.D.) 的卓越集群。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
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