Summary
Здесь мы описываем методы визуализации клеток количественно измерить миграции и вторжения стволовых клеток глиобластомы мозга опухоль со временем и при нескольких условиях лечения.
Abstract
Глиобластома (GBM) является агрессивным опухоль, которая плохо контролируется с имеющихся в настоящее время лечения. Основные особенности GBMs включают быстрое распространение и всепроникающей вторжения в нормальный мозг. Считается, что повторения в результате присутствия радио - и химиотерапии стойкие мозга опухоль стволовых клеток (BTSCs), которые вторгаются от первоначальных раковых массы и, таким образом, избежать хирургической резекции. Следовательно методы лечения, которые целевые BTSCs и их инвазивных способности может улучшить противном случае плохой прогноз заболевания. Наша группа и другие успешно установили и характеризуется BTSC культур от GBM пациентов образцов. Эти культуры BTSC продемонстрировать основные Рак стволовых клеток свойства, такие как колониеобразования самообновления, мульти линии дифференциации и опухоль начала иммунного дефицита мышей. Для того, чтобы улучшить текущий терапевтических подходов для GBM, необходимо лучше понять механизмы миграции BTSC и вторжения. В GBM изучения миграции и вторжения ограничен, отчасти, из-за ограничений существующих методов, которые не полностью в vitro роста характеристик BTSCs, выращивается как neurospheres. Здесь мы описываем быстрых и качественных клеток изображений анализов для изучения миграции и вторжения свойства BTSCs. Первый метод, описанный является пробирного миграции BTSC, который измеряет миграции к хемотаксического градиент. Второй метод, описанный является BTSC вторжения assay который изображения и количественно сотовой вторжения из neurospheres в матрицу. Анализы, описанные здесь используются для количественной оценки миграции BTSC и вторжения с течением времени и в условиях различных лечения.
Introduction
Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и агрессивной формой рака мозга и, несмотря на текущие терапии с участием хирургическая резекция следуют радиационной и химиотерапии, медиана выживаемости больных является всего лишь 15 месяцев1. GBM инвазивных, высокой лекарственной устойчивостью, и в конечном счете, неизлечимая болезнь, которая требует продолжал исследования в его имманентной биологии с целью выявления новых терапевтических направлений. Высокой смертности больных GBM в первую очередь вызвано большой сотовой вторжение в прилегающих нормальной ткани мозга и миграции вдоль кровеносных сосудов, что приводит к рецидива заболевания после лечения2,3 . Подмножество ячеек, называемых стволовых клеток (BTSCs), опухоли мозга, которые медленно Велоспорт и терапевтически устойчивы, было предположить, чтобы привести к повторению болезни. GBM BTSCs отображения свойств колониеобразования самообновлению, multipotency и опухоль инициирование потенциальных4,-5,6. BTSCs также сохранить генетический, молекулярной и фенотипические неоднородности их родительского GBM опухоли7,8,9,10. Эти свойства делают BTSCs систему чрезвычайно полезной моделью для изучения GBM и для изучения роман терапевтических стратегий. В естественных условиях, эти клетки стволовые как способны опухоли формирования, роста и вторжения, когда имплантированные в мозги новорожденных крыс11 и -ожирением диабетом/тяжелой комбинированный иммунодефицит (NOD/SCID) мышах4. BTSCs возможность неоднократно формы инвазивной опухоли в естественных условиях , пилки сотовой и гистологической характеристики их оригинальный опухолей сильно поддерживает их роль как инициирование опухоли клетки12.
Новые терапевтические подходы к целевому объекту BTSCs в настоящее время разрабатываются и помочь улучшить отдаленные исходы для пациентов GBM. В настоящее время существует ограниченное понимание клеточных процессов миграции и вторжения, которые связаны с терапевтической сопротивления и повторения. Миграция и вторжения являются различные явления; миграция — это процесс, лежащий в основе направленного движения клеток и включает в себя реорганизацию цитоскелета, молекулы адгезии и сборки/разборки координационных контактных пунктов, тогда как вторжения требует также физическое уничтожение барьеров Например, внеклеточная матрица13. Общепринятой методологии изучения миграции клеток и вторжение является Бойден палате пробирного14,15. Для этой техники двойной камеры наполнен СМИ, с СМИ в нижней камере дополнена хемотаксического. Хемотаксис инициируется с помощью конкретных факторов роста и цитокинов или плода бычьим сывороточным как неспецифический хемотаксического. После градиент хемотаксического клетки мигрируют через пористые мембраны. В конечной точке перенесенных клетки могут быть визуализирована и количественно в нижней части мембраны путем пятнать с цитологическим или флуоресцентными красителями. Бойден, пробирного миграции может быть изменено до вторжения assay путем покрытия пористых фильтр с компоненты внеклеточного матрикса, такие как тип я коллагена или базальной мембраны как матрица. Инвазивные клетки деградируют матрица, перемещаться к нижней части пористого фильтра и может быть определена количественно аналогичным образом для assay переноса. Другие часто используемые миграции анализы включают нуля раны и зоны отчуждения клеток assays13. Царапинам рану генотипирования царапин разрыв в клеточном монослоя и наблюдения миграции клеток от края раны изображений на регулярной основе до тех пор, пока закрыт нуля. В assay клетки исключения физический барьер используется для создания зоны, свободной от ячейки, до заполнения ячеек. Барьер удалены раз клетки вырожденная и миграции клеток в зону, свободную ячейку imaged регулярно16.
Эти ранее установлено, что анализы часто используются для изучения миграции или вторжения сторонником и однородной клеточных популяций, но создают значительные недостатки при изучении GBM BTSCs или других клеточных популяций гетерогенной рака. Можно создавать только Пробирная палата Бойден конечной точки измерения против кинетической оценки клеточного движения. Наблюдение с течением времени имеет большое значение для измерения миграции BTSC, учитывая, что клетки из разных культур часто мигрируют по различным ставкам. Таким образом условий и сроков анализа должны быть оптимизированы для каждого типа культуры и требует время интенсивного труда адекватной выборки и количественной оценки. Нуля и ячейки изоляции, которую анализов, не подходят для BTSC культур, как, даже когда BTSCs культивировали в условиях монослоя на пластины с покрытием Ламинин, мы заметили, что BTSCs, как представляется, противостоять движения в открытый космос и предпочитают оставаться в тесном близость к другим ячейкам. Кроме того они установлены, анализов миграции не позволяют для визуализации и мониторинга отдельных клеток на протяжении всего эксперимента. Мониторинг отдельных ячеек со временем ценной для оценки миграции в гетерогенных клеточных популяций, такие как BTSCs. Дополнительные недостатки Бойден камеры, нуля и клеток изоляции зоны анализов BTSC культур, что они требуют относительно числа высокой клеток, может занять много времени для установки, и либо быстро макроэкономическую или не имеют хемотаксического градиент. Таким образом эти анализы не являются идеальными для использования для редких или медленно растущих клеточных популяций или для скрининга наркотиков. Кроме того эти анализы не подходят для измерения вторжение в формате трехмерных (3D), что особенно важно для BTSCs, выращенных в условиях нейросферы.
Здесь мы описываем анализов, специально модифицированные для наблюдения и количественной оценки миграции для индивидуальных BTSCs и для вторжения GBM BTSCs культивировали как neurospheres. Первая проба описывает адаптация Пробирной палаты Бойден, используя клеток промежуток времени обработки изображений и хемотаксис миграции пластины для измерения эозинофилов клеток миграции13. Жить клеточной изображения в формате несколькими хорошо позволяет для визуализации и количественной оценки миграции клеток при нескольких условиях лечения. Вторая проба, описанные здесь является сфероида вторжения пробирного13,17, какие меры инвазивные свойства BTSCs культивировали нейросферы условиях и встроен в 3D внеклеточного матрикса под различные лечения условий. В целом эти анализы являются гораздо более совместимыми, чем ранее описанные методики изучения мигрирующих и инвазивные свойства гетерогенных BTSC культур. Они также предлагают более широкие возможности для расследования новых терапевтических стратегий миграции и вторжения, которые значительно способствуют рецидива и летальность.
Protocol
1. культивирования стволовых клеток мозга опухоль ранее производным от образцов человеческой глиобластомы
Примечание: BTSC культур были ранее созданы от человека GBM пациентов образцов6,,78,9,10.
- Оттепель флакон криогенно сохранились BTSCs в стакан, содержащие 70% этанол, помещен на водяной бане при температуре 37 ° C, только до тех пор, пока последний лед растаяло. Разбавить талой клетки в 10 мл средства массовой информации в 15 мл Конические трубки и центрифуги клетки на 150 относительная центробежная сила (РРС) для 7 мин.
Примечание: Во всем эти протоколы, полный СМИ ссылается на стандартные носители для культуры BTSCs (ранее описанных, Келли и др.) 6, как правило, с нынешних факторов роста. СМИ без роста факторов относится к базы СМИ со всеми компонентами, но без каких-либо факторов роста дополнить. - Аспирационная СМИ, Ресуспензируйте клетки в 8 мл полной средств массовой информации и передать T25 колбу клетки и СМИ.
- После 1 недели культивирования условиях не сторонник ежедневно контролировать колбу и дополнить содержимое с 1-2 мл полной СМИ, при необходимости, если средства массовой информации начинает разрушать или начинает становиться кислой как указано изменение оранжево желтого цвета. Проход клетки когда neurospheres достигают в диаметре приблизительно 250 мкм, как правило, между 10-14 d (рис. 1).
Примечание: Время удвоения различных культур BTSC варьируется в широких пределах. Нейросферы размер может быть измерена с помощью окуляр микрометр. - Для прохода BTSCs, соберите средства массовой информации и neurospheres, закупорить СМИ вниз на поверхности колбы для того, чтобы собрать все neurospheres и перенести их в 15 мл Конические трубки и центрифуги трубки для 7 минут при 150 РПРС.
Примечание: Колбы может быть проверена под микроскопом, чтобы обеспечить, что все neurospheres были собраны. Дополнительные мыть с 5 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) или средства массовой информации могут быть выполнены для сбора любых оставшихся neurospheres при необходимости. - Чтобы отделить BTSC neurospheres в отдельные клетки, аспирационная средства массовой информации и добавить 1 мл раствора отряд подогретым клеток и инкубировать и что при 37 ° C для 7 min. нарезанных BTSC подвеска 40 x с P1, 000 микропипеткой на 800 мкл.
Примечание: Клетки может быть инкубирован больше при 37 ° C Если neurospheres не разъединять. - Добавьте 5 мл PBS (с антибиотики пенициллина и стрептомицина) диссоциированных BTSCs и центрифуги клетки на 150 РРС за 7 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте BTSCs в 1-4 мл полной СМИ, в зависимости от размера ячейки Пелле.
Примечание: Суспензию клеток необходимо дополнительно разрежается, если концентрация пределы точного обнаружения для подсчета точной клеток. - Использованием красителя, который исключает мертвые клетки, такие как Трипановый синий, подсчитать количество жизнеспособных клеток и семян BTSCs в колбу или пластины интерес — как правило, 200000-300000 клетки в 8 мл полной СМИ в колбе T25.
2. мозг стволовых клеток опухоли миграции Assay
- Семя 200000 клетки в колбе T25 8 мл полной СМИ 1-2 недели до планирования для выполнения миграции пробирного.
Примечание: Время между покрытием и выполнение анализа будет варьироваться в зависимости от темпов роста культуры BTSC используется.- Чтобы проверить эффект лечения от наркозависимости на миграции, предварительной обработки клетки с соответствующего транспортного средства, например ДМСО и наркотиков интереса, добавив применимых томов акций транспортное средство или наркотиков непосредственно в отдельных скважинах средств массовой информации, содержащие клетки.
- Подготовьте хемотаксис миграции пластины (рисунок 2A), покрытия его тонким слоем коллагена.
- Рассчитайте количество скважин 96-луночных хемотаксис пластины, которые должны быть покрыты с коллагеном. Включают по меньшей мере три реплицировать скважин для каждого условия.
- Разбавить 5 мг/мл акций типа коллаген до 0,2 мг/мл в чистой уксусной кислоты, разбавляют до 0,14% в воде класса культуры.
- Пипетка 0,2 мг/мл коллагена мембрана Вставка скважин и скважин нижней водохранилища, которые используются.
Примечание: Водоемов нижней пластины требуют 225 мкл и скважин вставки мембраны требуют 75 мкл коллагена для надлежащего покрытия. - Место пластину миграции в инкубаторе при 37 ° C за 1 ч. аспирационная коллагена раствор из скважин без царапин покрытие коллагена.
- Промыть лунки 2 x с стерильных ПБС. Если плита не используется сразу, аспирационная PBS и хранить его на 4 ° C на срок до 2 недель. Перед использованием теплый пластину хемотаксис миграции до комнатной температуры.
- Подготовьте водохранилище нижней плиты миграции хемотаксис.
- Пипетка 225 мкл СМИ (без факторы роста), дополнены 10% FBS как хемотаксического, лунки водохранилище нижней плиты миграции хемотаксис.
- Осторожно поместите вставки мембраны в нижней водохранилище под углом, чтобы избежать создания пузыри.
- Плита в мембрану клетки вставить хемотаксис миграции пластины.
- Ресуспензируйте отделить BTSCs в средствах массовой информации (без факторы роста) на плотность клеток 50 000 клеток/мл. Добавьте наркотиков для средств массовой информации, если оценки миграции во время различных лекарств. Попеременно семян равное количество предварительно обработанные клетки и клетки управления, сохраняя при этом концентрация окончательный наркотиков когда покрытие.
- Пластина 50 мкл BTSCs от шага 2.4.1 в каждой скважине пластину миграции в условиях желаемого лечения.
- Изображение хемотаксис миграции.
- Место пластину миграции хемотаксис в тепловизионной системы клеток и установите автоматизированный изображений программное обеспечение для приобретения микроскопических изображений пластины каждые 1-2 ч до 72 ч. Использование коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы), щелкните правой кнопкой мыши на Временная шкала и набор интервал сканирования каждые 2 ч за 24 ч.
Примечание: Интервал времени и общее затраченное время будет варьироваться между культурами BTSC используется; Начните с интервалами 2 h за 72 ч до тех пор, пока с отдельными культурами BTSC был накоплен опыт. Если автоматизированная система визуализации недоступна, то изображения же поле зрения могут быть приобретены вручную с помощью микроскопа и камеры подключены к визуализации программного обеспечения. - После завершения загрузки изображений получить изображения для всего эксперимента и создать определение обработки, с помощью программного обеспечения для анализа, который отличает клетки от фона мембраны и миграции поры (Рисунок 2Б, красная маска) . Использование коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы), выберите Новое определение обработки и настройки обработки определения для BTSCs семян порог из 52, растут порог 85, корректировок размера (пикселей), -1 и Минимальная площадь 200 мкм2. Применить это определение обработки к нижней стороне мембраны. Измените этот анализ, если он не точно отличить клетки от фона мембраны.
- Сбор данных как площадь поверхности клетки на нижней стороне мембраны для каждого из трех реплицировать скважин, которые только подсчитывает количество ячеек, которые мигрировали через поры. Диаграмма миграции клеток в мкм2 (площадь клеток мигрировали) во времени (рис. 2 C, рис. 3).
Примечание: Убедитесь, что относительное количество клеток покрытием и рассчитывает на верхней поверхности мембраны на первом этапе похожи (менее 20% вариации на всех скважинах) между всеми условий лечения, чтобы избежать каких-либо эффектов неравномерным напылением. Данные коллекции с использованием коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы) может быть выполнен путем запуска обработки определения, созданный на шаге 2.5.2, нажав на метрики, а затем на график и экспорта, а затем на экспорта данных .
- Место пластину миграции хемотаксис в тепловизионной системы клеток и установите автоматизированный изображений программное обеспечение для приобретения микроскопических изображений пластины каждые 1-2 ч до 72 ч. Использование коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы), щелкните правой кнопкой мыши на Временная шкала и набор интервал сканирования каждые 2 ч за 24 ч.
3. мозг стволовых клеток опухоли нейросферы вторжения Assay
- Семя 200000 клетки в 8 мл полной СМИ в колбе T25 1-2 недели до планирования выполнения assay вторжения.
Примечание: Время от обшивки для выполнения анализа будет зависеть уровень распространения культуры BTSC используется.- Для предварительно обработанные клетки добавьте соединение интерес колбу в нужной концентрации на заданное время курс перед neurospheres готовы быть покрытием для вторжения.
- Подождите до тех пор, пока средняя нейросферы размер составляет примерно 150-200 мкм; как правило это занимает 7-14 d, в зависимости от культуры BTSC используется.
Примечание: Это типичный соблюдать распределение размеров области в колбу. - Совет и осторожно смешать настой с пипетки и перемещать 500 мкл BTSC neurospheres 1,5 мл Конические трубки для каждого условия лечения; Это будет использоваться для пластины три реплицировать скважин.
Примечание: Шаги 3.3.1 - 3.3.2 необязательно, но рекомендуется для первого эксперимента вторжения на новой культуры BTSC.- Для определения плотности neurospheres, которая будет в конечном итоге в колодец, подготовьте 1,5 мл как шаг 3.3. Осторожно смешать neurospheres и переместить в отдельную тарелку 96-луночных 100 мкл и позволяют neurospheres урегулировать самотеком за 5 мин.
- Проверить количество neurospheres под микроскопом, чтобы обеспечить несколько neurospheres находятся в регионе хорошо, что будет отражаться без его переполненностью.
Примечание: Вторжение neurospheres требуют достаточно места для тройной в диаметре без взаимодействия с соседними neurospheres. Количество neurospheres в хорошо может корректироваться, подсчитывая количество neurospheres в колодец и добавляя больше или меньше neurospheres из T25 колбу 1,5 мл конические трубы на шаге 3.3.
- Место 1,5 мл Конические трубки с клетками из шага 3.3 на льду и выполните шаги 3,5-3,7 на льду.
- Пусть neurospheres урегулировать самотеком в нижней части 1,5 мл Конические трубки на 5 мин и prechill помечены 96-луночных пластины на льду.
- Ресуспензируйте neurospheres в белков внеклеточного матрикса.
- Подготовка 500 мкл 0,4 мг/мл тип I коллагена раствор на льду для каждого условия лечения: добавить 459 мкл СМИ (без факторы роста), 40 мкл коллагена раствор 5 мг/мл и 0,92 мкл стерильных 1Н NaOH (Таблица 1).
Примечание: 500 мкл раствора коллагена требуется за лечение условие: 100 мкл для каждого из трех реплицировать скважин и 200 мкл избыток. Медикаментозного лечения должны быть добавлены здесь на желаемой конечной концентрации, вычитается из средств массовой информации компонента решения. Этот протокол описывает использование типа коллагена как белков внеклеточного матрикса; Однако может быть проверена любой белков внеклеточного матрикса. Кроме того для BTSC культур, которые имеют более медленные темпы вторжения, факторы роста или FBS может быть дополнена в средствах массовой информации, чтобы увеличить скорость вторжения. - После того, как neurospheres от шаг 3.5 поселились, аспирационная столько средств массовой информации как можно скорее без потери нейросферы Пелле, которая осела на дне. Нежно ресуспензируйте neurospheres в 500 мкл коллагена раствор, приготовленный на шаге 3.6.1.
- Подготовка 500 мкл 0,4 мг/мл тип I коллагена раствор на льду для каждого условия лечения: добавить 459 мкл СМИ (без факторы роста), 40 мкл коллагена раствор 5 мг/мл и 0,92 мкл стерильных 1Н NaOH (Таблица 1).
- Добавьте 100 мкл смеси коллагена и нейросферы три реплицировать скважин 96-луночных пластины на льду. Разрешить neurospheres соглашаться на льду на 5 мин.
- Передать пластину 96-луночных инкубатора 37 ° C за 5 мин для полимеризации коллагена.
- Немедленно Подготовьте изображение 96-луночных пластины.
- Место пластину 96-луночных в лоток тепловизионные системы клеток или на сцене микроскопом приобрести изображение как ссылку для размера нейросферы во время покрытия, до начала вторжения.
- Получение изображений каждый час до тех пор, пока уровень вторжения перестала расти; как правило это происходит в течение 24 ч.
Примечание: Изображения интервал может быть изменен в зависимости от используемого оборудования. Визуализации интервал и общее затраченное время также могут быть изменены для BTSC культур, которые имеют разные ставки вторжения.
- Определите увеличение площади поверхности BTSCs как они вторгнуться матрица с течением времени.
Примечание: Площадь поверхности клетки в то время обшивки, рассчитывается как среднее трех реплицировать скважин, должны быть одинаковые (менее 20% вариации на всех скважинах) между различными лечения условия для обеспечения различия в BTSC вторжения, не сильно влияет на количество или размер neurospheres покрытием.- Для анализа клеток системы использовать объектив 10 X для захвата изображений и приобрести четыре изображения на хорошо для трех реплицировать скважин. Чтобы определить относительную площадь поверхности клетки, представлены как процент слияния колодец, настроить определение обработки, которое конкретно подчеркивается клетки на фоне хорошо. Использование коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы), выберите новое определение обработки и задайте настройки сегментации 0,8, минимум 300 мкм2и эксцентриситет области максимально до 0,99. Измените этот анализ, если он не точно отличить клетки от фона.
Примечание: При использовании других способов изображения нейросферы вторжения с течением времени, рекомендуется для получения нескольких полей зрения для трех реплицировать скважин с течением времени. Однако не изображений точно же поле зрения на каждом интервале увеличит стандартная ошибка собранных данных. Компьютерное программное обеспечение может использоваться для измерения площади поверхности вторжение клеток в каждом изображении. - Сбор данных в ячейке площади поверхности (относительный или абсолютный) для каждой скважины в каждый момент времени и определить среднее трех реплицировать скважин. Граф вторжения BTSCs путем построения области рост клеток с течением времени.
Примечание: Сбор данных с использованием коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы) может быть выполнен путем запуска обработки определения, созданный на шаге 3.10.1, нажав на метрики, то на графике и экспорта, а затем на экспорта данных .
- Для анализа клеток системы использовать объектив 10 X для захвата изображений и приобрести четыре изображения на хорошо для трех реплицировать скважин. Чтобы определить относительную площадь поверхности клетки, представлены как процент слияния колодец, настроить определение обработки, которое конкретно подчеркивается клетки на фоне хорошо. Использование коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы), выберите новое определение обработки и задайте настройки сегментации 0,8, минимум 300 мкм2и эксцентриситет области максимально до 0,99. Измените этот анализ, если он не точно отличить клетки от фона.
Representative Results
Здесь мы описываем примеры данных, которые могут быть получены с использованием клеток изображений анализов для изучения миграции BTSC и вторжения. BTSCs покрытие как отдельные клетки и можно выращивать как свободно плавающего neurospheres (рис. 1). Мы покажем, что BTSCs можно отделить и покрытием в скважинах вставки мембраны в хемотаксис миграции пластина, которая покрыта тонким слоем типа я коллагена (рисунок 2A). Отдельные BTSCs равномерно рассеяны на вершине вставки мембраны в начале assay. В течение 24-72 ч клетки придерживаться мембраны, двигаться вдоль поверхности с покрытием коллагена и мигрируют через один из 96 мелкие поры на нижней стороне мембраны, к хемотаксического в водохранилище хорошо. После выделения ячейки на вершине мембрану в желтый, поры в голубой и клетки на нижней части мембраны в красном, клетки можно увидеть ввода в поры на верхней (желтая ячейка приближается к голубой поры) и выход из поры на дне (красная ячейка выход ING синий поры) (рис. 3). Важно отметить, что клетки могут быть обработаны наркотиков и покрытием в пластину же хемотаксис миграции как клетки лечение транспортного средства управления для изучения влияния терапевтических вмешательств на BTSC миграции (рис. 2B). Хемотаксис миграции пластина позволяет для визуализации ячеек как на верхней, так и в нижней части вставки мембраны. Таким образом количественная оценка миграции клеток со временем возможна путем подсчета клеток, которые мигрировали на нижней стороне мембраны (рис. 2 c).
Мы обнаружили, что если BTSCs не являются полностью отделить, то клетки не мигрируют через поры и остаются небольшие neurospheres (рис. 4A). Важно также не пластины более чем 2500 BTSCs/а как этот результат в ячейке слипания, а не в миграции к нижней стороне мембраны (рис. 4B). И наконец важно, чтобы избежать пузырей в мембране вставить скважин, когда покрытие клетки и когда размещение мембраны вставить внизу водохранилища, поскольку это препятствует точной визуализации и количественной оценки (рис. 4 c).
Далее мы показывают, что BTSC вторжения, от neurospheres в окружающих матрицу, может отражаться и количественно со временем в формате 96-луночных пластины (Рисунок 5A). Вторжение может измеряться путем количественной оценки площади поверхности клетки, как они вторгнуться матрица с течением времени. С помощью программного обеспечения для анализа изображений, обработки определение применяется что оверлеи маску на ячейку, площадь, которая позволяет для автоматического количественной оценки со временем (Рисунок 5B). Покадровой видео BTSC вторжений также могут создаваться, легко наблюдать за общий процесс BTSC вторжения (рис. 6). Кроме того флуоресцентной микроскопии может использоваться для изображения BTSCs, которые выражают флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или красный флуоресцирующий белок (ППП). Здесь мы создали покадровой видео BTSCs, выражая цитозольной форма GFP для отслеживания отдельных BTSCs как они вторгнуться базальной мембраны как матрицы (рис. 7). Этот assay вторжения нейросферы BTSC также позволяет для лекарств будут добавлены в реплицировать скважины непосредственно оценить их влияние на BTSC вторжения из neurospheres в матрицу (Рисунок 8A). Количественная оценка нескольких neurospheres в реплицировать скважин могут быть рассчитаны и графике со временем оценить влияние препаратов на нескольких концентрации (Рисунок 8B).
Отказ присоединиться к протоколу, описанные выше может привести к невозможности получения надежных и точных данных. Встраивание BTSC neurospheres, которые являются слишком большими, с диаметром более 200 мкм, приводит к плоскости фокуса, который является слишком большим для точного количественного определения всех сфер в поле зрения (Рисунок 8 c). Аналогичным образом неспособность поддерживать матрица на 4 ° C при внедрении neurospheres может также привести к сфер, которые не находятся в одной плоскости фокуса и внеклеточного матрикса, который равномерно, не затвердевшим, который предотвращает сбор точных данных (Рисунок 8 d ).
Рисунок 1: выращивание BTSCs. Эти панели являются репрезентативного примера BTSCs, выращенных из одной клетки в neurospheres в течение 14-d в культуре. Соответствующего размера для пассированый neurospheres, показанный здесь, на 14 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Live Клеточная томография BTSC миграции. (A) это пример миграции плиты 96-луночных хемотаксис покрытием с тонким слоем типа коллаген до выполнения миграции проба с BTSCs. На снимках i) плита с все три части (крышка, вставки мембраны и водохранилище) помещены вместе, разделены, ii) все три части iii) крупным планом изображение сверху вставки мембраны, iv) крупным планом изображение в нижнем представлении вставки мембраны и v) крупным планом изображение внизу водохранилища. (B) это представитель изображения, BTSC миграции в начале эксперимента (0 h) и в 24 ч. Фокус изображения находится на вершине вставки мембраны, где клетки были первоначально покрытием. Клетки, которые мигрировали в нижней части пластины миграции хемотаксис, выделены красным цветом. В 0 ч несколько клеток мигрировали на нижней стороне мембраны. После 24 часов резко возросло количество перенесенных клеток. Сравнение изображений на 24 ч для клеток, лечение препаратом транспортное средство против X показывает, что медикаментозное лечение уменьшает BTSC миграции. Масштаб бары представляют 600 мкм. (C) Эта группа показывает количественная оценка BTSC миграции после предварительной обработки с транспортного средства или наркотиков X. На графике показано, что медикаментозное лечение имеет сильное влияние на миграцию BTSCs. Точки данных среднее трех технических скважин реплицировать, и погрешностей представляют стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Анимированный рисунок 3: BTSC миграции покадровой видео. Это видео показывает миграции BTSCs с использованием типа я коллагена покрытием хемотаксис миграции пластины. Клетки на вершине вставки мембраны, выделены желтым цветом, клетки, которые мигрировали в нижней части вставки мембраны, выделены красным цветом и поры в мембране, выделены синим цветом. Плоскость фокуса устанавливается изображение клетки на нижней стороне мембраны. Видео было создано с использованием изображений покадровой принятых каждый час для 51 h и компилируются на 4 кадров в секунду. Линейки шкалы представляет 200 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Рисунок 4: примеры ошибок в настройке миграции пробирного. (A) этой панели показан пример BTSCs, которые не были полностью отделить перед покрытием на верхней мембраны вставьте пластину миграции хемотаксис. Из-за большого размера сфер и небольшой размер поры мембраны клетки не могут мигрировать на дно водоема. (B) Эта группа показывает пример миграции пробирного где слишком много клеток были покрытием. Глыба ячеек препятствует миграции клеток и препятствует количественной оценки. (C) Эта группа показывает пример формирования пузыря на вставки мембраны, где были покрытием BTSCs. Пузыри результат плохого изображения качества и предотвратить точной количественной оценки миграции. Масштаб бары представляют 600 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: BTSC нейросферы вторжения пробирного. Эти панели показывают пример BTSCs вторжение от нейросферы в 0,4 мг/мл тип коллагеновой матрицы в течение 6 ч. Здесь (A) фаза контрастность изображения на каждом этапе показаны (B) с представитель количественных маска накладывается, как подробно описывается в протокол шаг 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: коллаген I типа BTSC нейросферы вторжения покадровой видео в. Это видео показывает на вторжение BTSCs от нейросферы в 0,4 мг/мл типа коллагеновой матрицы (также показано как неподвижные изображения в Рисунок 5A). Изображения были приобретены с использованием 10 X цели каждый час для 12 h и компилируются на 4 кадров в секунду. Линейки шкалы представляет собой 300 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Рисунок 7: BTSC нейросферы вторжения покадровой видео в базальной мембраны как матрице. Это видео показывает вторжение BTSCs, что Ускоренная цитозольной GFP, от нейросферы в базальной мембраны как матрицу. Изображения были приобретены с помощью 4 X цели каждые 30 мин в течение 48 часов и были составлены на 8 кадров в секунду. Линейки шкалы представляет 800 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Рисунок 8: BTSC нейросферы вторжения пробирного с лечения. (A) BTSC neurospheres были внедрены в матрице базальной мембраны как приготовленные транспортное средство или указанные концентрации наркотиков, X. изображения были приобретены каждый час; показанный здесь изображения принимаются в то время обшивки и после 16 ч. Линейки шкалы представляет 200 µm. (B) вторжение BTSCs из neurospheres в окружающие матрица была количественно каждый час, как описано в шаге 3 протокола. Точки данных среднее трех технических скважин реплицировать, и погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). (C) Эта панель показывает, BTSC neurospheres встроенный с сферу, которая слишком велика для количественного определения типа коллагена. Линейки шкалы представляет 300 µm. (D) этой группы показывает, BTSC neurospheres встроенный в типе коллагена, что полностью не задан. Линейки шкалы представляет 300 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Коллагена раствор подготовка | |
| Фондовая [коллаген] (мг/мл) | 5 |
| Финал [коллаген] (мг/мл) | 0.4 |
| Количество скважин необходимо: | 5 |
| Общий объем (мкл) | 500 |
| Объем запасов коллагена (мкл) | 40 |
| Объем 1Н NaOH (мкл) | 0.92 |
| Объем средств (мкл) | 459 |
Таблица 1: подготовка по 0,4 мг/мл тип I решение коллаген. Перечислены известные начиная и желаемого окончательный концентрации типа я коллагена раствор. Тома в списке достаточно для neurospheres пластину в три реплицировать скважин, плюс два за превышение и может включать условие единственного метода лечения, как описано в деталях в протокол шаг 3.
Discussion
Учитывая, что раковые клетки активно пролиферирующих, это создает потенциальные техническую проблему для изучения миграции клеток. Для assay переноса, описанных здесь BTSCs покрыты без факторы роста, который ограничивает распространение, и градиент хемотаксического хемотаксис пластины не полностью сбалансировать более 72 часов. Кроме того как клетки находятся под наблюдением с помощью клеток изображений с течением времени, клетки можно визуально контролировать обеспечить широкое разделение клетки не происходит. Для успеха assay переноса важно отделить neurospheres полностью в отдельные ячейки и точно подсчитать число клеток до покрытия. Покрытие сферах или покрытие слишком много клеток, что приводит слипания, можно предотвратить клетки мигрируют через малые поры (Рисунок 4A и 4B). Важно также избежать создания пузыри, когда покрытие клетки в пластину хемотаксис миграции или размещение вставки мембраны на дно водоема. Пузыри могут изменить плоскость фокуса и предотвратить точной количественной (рис. 4 c). Вся плита должна быть покрыты тонким слоем коллагена, потому что это дает клетки поверхность для перехода на поры в пластине, как этот assay требует клетки придерживаться и затем мигрируют по биологически отношение поверхности к хемотаксического.
Протокол миграции BTSC, описанный здесь позволяет для кинетической оценки миграции отдельных клеток, требующие меньше клеток для лечения различных условиях по сравнению с существующими протоколами испытаний. Это имеет важное значение для культуры, которые растут очень медленно, как это может быть трудно собрать большое количество клеток для экспериментов. Низкая поры плотность плиты хемотаксис миграции позволяет медленнее уравновешивания хемотаксического градиента, больше чем 72 часа и более эффективно имитирует процесс биологического эозинофилов миграции в течение более длительного периода времени. Протокол был оптимизирован для имеют очень тонкий слой коллагена покрытия на пластину миграции хемотаксис чтобы пробирного меры миграции и не вторжения. Она также облегчает изображений и количественная оценка одиночных клеток, как они придерживаться покрытие мембраны пластины коллагеновой матрицы. Однако, одно ограничение техники, что количественная оценка миграции через несколько скважин со временем значительно упрощенной и ускоренной с использованием коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалы). Заметным преимуществом assay переноса как описано здесь является широкий адаптируемость протокола к другие типы клеток. Это будет особенно полезно для количественной оценки эозинофилов миграции клеточных линий, которые либо медленно растут, трудно присоединиться, или мигрировать медленно.
Для обеспечения успеха пробирного вторжения BTSC, необходимо собрать neurospheres, прежде чем они станут больше, чем 200 µm. крупных сфер плоскости фокуса, который является слишком большим, чтобы последовательно изображения и количественно (рис. 5 c). Кроме того neurospheres может начать комок и объединять с другими neurospheres. Это влияет на получение точных и согласованных данных. Кроме того важно, что neurospheres могут осесть на дно колодца в то время как коллагена находится все еще на льду, чтобы neurospheres к записи образа в одной плоскости фокуса (рис. 5 d). Аналогичным образом важно, чтобы коллагена полностью установить без перемещения пластины, как это может нарушить формирования даже матрицу, которая может отрицательно сказаться на качестве изображения (рис. 5 d). Для assay вторжения BTSC, описанных здесь одним из основных преимуществ является, что BTSCs культивировали как neurospheres можно оценить для вторжения напрямую, без необходимости быть выращено adherently. Кроме того BTSC neurospheres может быть встроен в любой внеклеточного матрикса, либо с помощью отдельных компонентов внеклеточного матрикса из конкретной ткани или смесью коммерчески доступных базальной мембраны. Указание внеклеточная матрица может помочь идентифицировать или тестирования конкретных механизмов вторжения. Например этот протокол, можно оценить эффект ориентации на отдельных членов семьи metallopeptidase матрица генов, которые известны к разложению матрицы конкретных компонентов. Кроме того хотя этот протокол для BTSC neurospheres, аналогичным образом может использоваться любой клетки, выращивается как сферы. Примеры включают груди раковые клетки культивировали как mammospheres или первичной колоректальные раковые клетки культивировали как tumorspheres; Однако это ограничивает технику для типов клеток, которые могут расти как сферы культуры. Другие преимущества миграции и вторжения анализов, что они легко настроить, они работают в формате 96-луночных, и данные количественной оценке с течением времени.
В целом в целях предотвращения повторения GBM после лечения, важно для разработки методологий, способствующих расследование BTSC миграции и вторжения. Протокол миграции, описанных здесь предлагает много преимуществ по сравнению с ранее установленным миграции анализов, особенно для изучения GBM BTSCs. Этот протокол улучшение миграции включает в себя отделения BTSCs культивировали нейросферы условиях и покрытие одной клетки в 96-луночных коллаген покрытием хемотаксис миграции пластине. С помощью тепловизионной системы клеток, миграция BTSCs может контролироваться и количественно со временем. Assay вторжения, описанные здесь позволяет для мониторинга BTSC вторжений из neurospheres в матрицу. Этот assay предполагает встраивание neurospheres в коллагеновой матрицы, или другой богатых белком внеклеточного матрикса, в 96-луночных пластине. Изображения пластины с покадровой изображений системы клеток позволяет для анализа BTSC вторжений в условиях различных лечения со временем. Эти анализы, следовательно, обеспечивают ценный инструмент для ученых, надеясь, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе миграции BTSC и вторжения.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Розина Хассам и Оршойя Чех за их техническую поддержку. Этот исследовательский проект частично поддержали гранты от Фонда Канады для инноваций (H. Artee Luchman и Самуэль Вайс) и стволовых клеток сети Канады (также ч. Artee Luchman и Самуэль Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
