Summary
هنا، نحن تصف خلية يعيش تقنيات التصوير لقياس كمي الهجرة وغزو جليوبلاستوما الدماغ ورم الخلايا الجذعية على مر الزمن وظروف العلاج متعددة.
Abstract
جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ عدوانية التي تسيطر سيئة مع خيارات العلاج المتاحة حاليا. وتشمل الملامح الرئيسية جبمس الانتشار السريع وغزو منتشرة في الدماغ العادي. ويعتقد تكرار نتيجة لوجود مقاومة الإذاعة والكيماوي الدماغ ورم الخلايا الجذعية (بتسكس) التي تغزو بعيداً عن الكتلة السرطانية الأولية، وهكذا، التهرب من الاستئصال الجراحي. ومن ثم فقد تحسين العلاجات التي تستهدف بتسكس وقدراتهم الغازية خلاف ذلك سوء التشخيص لهذا المرض. مجموعتنا وغيرها نجحت في المنشأة وتتميز الثقافات بتسك من عينات المرضى GBM. وتبين هذه الثقافات بتسك خصائص الخلية الجذعية السرطان الأساسية مثل التمايز الذاتي تجديد، ونسب متعددة كلونوجينيك، وبدء الورم في الفئران التي تفتقر إلى المناعة. من أجل تحسين النهج العلاجية الحالية للخليج للحاسبات الآلية، من الضروري فهم أفضل لآليات الهجرة بتسك وغزو. في الخليج للحاسبات الآلية، مقيد دراسة الهجرة والغزو، جزئيا، بسبب القيود المفروضة على التقنيات الموجودة التي لا تراعي خصائص النمو في المختبر من بتسكس نمت نيوروسفيريس تماما. هنا، نحن تصف السريع والكمية خلية يعيش فحوصات التصوير لدراسة خصائص كل من الهجرة والغزو من بتسكس. الطريقة الأولى الموصوفة هي المقايسة الهجرة بتسك الذي يقيس الهجرة نحو تدرج تشيمواتراكتانت. الأسلوب الثاني هو موضح المقايسة غزو بتسك الصور التي ويوضحها غزو خلوية من نيوروسفيريس في مصفوفة. وتستخدم الاختبارات الموصوفة هنا للتحديد الكمي للهجرة بتسك والغزو على مر الزمن وفي ظل ظروف معاملة مختلفة.
Introduction
جليوبلاستوما (GBM) هو الشكل الأكثر شيوعاً وعدوانية من سرطان الدماغ، وعلى الرغم من العلاج الحالي تشمل الاستئصال الجراحي متبوعاً بالإشعاع والعلاج الكيميائي، متوسط بقاء المرضى هي مجرد 15 شهرا1. الخليج للحاسبات الآلية الغازية، شديدة المقاومة للأدوية، وفي نهاية المطاف، واصل مرض عضال يتطلب البحث في البيولوجيا الملازمة لها بغية تحديد السبل العلاجية رواية. ارتفاع معدل وفيات مرضى الخليج للحاسبات الآلية هو أساسا بسبب الغزو الخلوية واسعة النطاق في أنسجة المخ الطبيعية المجاورة والهجرة على طول الأوعية الدموية، الأمر الذي يؤدي إلى تكرار المرض بعد العلاج2،3 . مجموعة فرعية خلايا، ووصف الدماغ ورم الخلايا الجذعية (بتسكس)، التي بطيئة مقاومة علاجية، وركوب الدراجات قد تم الافتراض بأن يؤدي إلى تكرار المرض. الخليج للحاسبات الآلية بتسكس عرض خصائص التجديد الذاتي كلونوجينيك، مولتيبوتينسي، وبدء الورم المحتملة4،،من56. كما تحتفظ بتسكس التغايرية الوراثية والجزيئية والمظهرية للوالدين GBM الأورام7،،من89،10. هذه الخصائص تجعل بتسكس نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة الخليج للحاسبات الآلية واستكشاف استراتيجيات علاجية جديدة. في فيفو، هذه الخلايا الجذعية مثل قادرة على تشكيل الورم والنمو وغزو عند زرعها في أدمغة الفئران حديثي الولادة11 والسكري غير السمنة/شديدة مجتمعة الفئران المناعة (موافقة/مشمولان)4. قدرة بتسكس مرارا تشكيل الأورام الغازية في فيفو بإيجاز خصائص الهاتف الخلوي والنسيجي الأورام الأصلي بقوة تدعم دورها كالشروع في ورم الخلايا12.
يجري استهداف بتسكس رواية النهج العلاجية والمساعدة في تحسين نتائج طويلة الأمد لمرضى الخليج للحاسبات الآلية. حاليا، هناك محدودية فهم عمليات الهجرة وغزو الخلوية المرتبطة بالمقاومة العلاجية والتكرار. الهجرة وغزو ظواهر متميزة؛ الهجرة هي العملية الأساسية لتوجيه حركة الخلايا وينطوي على إعادة تنظيم سيتوسكيليتون وجزيئات الالتصاق، والتجميع/التفكيك لمراكز الاتصال، بينما يتطلب الغزو أيضا التدمير المادي للحواجز مثل مصفوفة خارج الخلية13. منهجية مقبولة على نطاق واسع لدراسة الهجرة الخلية والغزو هو ال14،الإنزيم Boyden الدائرة15. لهذا الأسلوب، يتم ملء غرفة مزدوجة مع وسائل الإعلام، مع وسائل الإعلام في الدائرة السفلي وتستكمل مع تشيمواتراكتانت. يتم تشغيل إنزيمية استخدام عوامل النمو محددة أو السيتوكينات، أو الجنين المصل البقري تشيمواتراكتانت غير محددة. وبعد التدرج تشيمواتراكتانت، تهاجر الخلايا عبر غشاء المسامية. في النهاية، يمكن تصور الخلايا التي تم ترحيلها وكمياً في الجزء السفلي من الغشاء بالتلوين بالأصباغ الخلوية أو الفلورسنت. Boyden يمكن تعديل المقايسة الهجرة مقايسة غزو بطلاء مسامية تصفية مع مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل نوع أنا الكولاجين أو مصفوفة شبيهة بغشاء الطابق السفلي. الخلايا الغازية تتحلل المصفوفة والتحرك من خلال الجزء السفلي من عامل التصفية المسامية، ويمكن قياسها كمياً بطريقة مماثلة لفحص الهجرة. فحوصات الهجرة شائعة أخرى تشمل الصفر الجرح ومنطقة الاستبعاد خلية فحوصات13. فحص الجرح الصفر يؤديها الخدش فجوة في أحادي الطبقة خلوية ومراقبة هجرة الخلايا من حافة الجرح بالتصوير على فترات منتظمة حتى يتم إغلاق الصفر. في مقايسة الاستبعاد الخلية، يتم استخدام حاجز مادي لإنشاء منطقة خالية من الخلية قبل البذر للخلايا. أن الحاجز هو إزالة مرة واحدة الخلايا المتلاقية وهجرة الخلايا إلى منطقة خالية من الخلية تصويرها بانتظام16.
وهذه المنشأة سابقا كثيرا ما تستخدم معبراً لدراسة الهجرة أو الغزو من السكان خلية ملتصقة ومتجانسة ولكن عيوب كبيرة تشكل عند دراسة بتسكس GBM أو غيرهم من السكان خلية السرطان غير متجانسة. إلا يمكن أن تولد المقايسة الدائرة Boyden نقطة النهاية القياسات مقابل إجراء تقييم حركية لحركة الخلية. ملاحظة على مر الزمن من أهمية عالية بالنسبة لقياس الهجرة بتسك، نظراً لأن خلايا من ثقافات مختلفة وعادة ما تهاجر بمعدلات مختلفة. على هذا النحو، شروط وتوقيت الفحص يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الثقافة ويتطلب عمالة كثيفة الوقت لأخذ العينات كافية والتحديد الكمي. إغلاق استبعاد الصفر وخلية فحوصات ليست مناسبة تماما للثقافات بتسك كما، حتى عندما تستزرع بتسكس تحت ظروف أحادي الطبقة على لوحات laminin المغلفة، لاحظنا أن بتسكس تظهر مقاومة الحركة في الفضاء المفتوح ويفضل البقاء قرب إلى خلايا أخرى. وعلاوة على ذلك، أنشأت هذه فحوصات الهجرة لا تسمح للتصور ورصد الخلايا الفردية في جميع أنحاء تجربة. رصد الخلايا الفردية على مر الزمن قيماً للتقييم للهجرة في الخلية غير المتجانسة السكان مثل بتسكس. عيوب إضافية Boyden الدائرة والصفر، والخلية-استبعاد المنطقة معبراً للثقافات بتسك التي كانت تتطلب نسبيا أرقام الخلية عالية، يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً لإعداد، وأما سرعة حجته أو ليس لديهم تدرج تشيمواتراكتانت. على هذا النحو، هذه الاختبارات ليست مثالية للاستخدام للسكان خلية نادرة أو بطيئة النمو أو لفحص المخدرات. وعلاوة على ذلك، لا تناسب هذه الاختبارات لقياس غزو في شكل (3D) ثلاثي الأبعاد، وأهمية خاصة بالنسبة بتسكس نمت تحت ظروف نيوروسفيري.
وهنا يصف لنا فحوصات معدلة خصيصا للمراقبة والقياس الكمي للهجرة بتسكس الفردية، وغزو بتسكس GBM مثقف نيوروسفيريس. يصف التحليل الأولى لتكيف من مقايسة الدائرة Boyden استخدام خلية يعيش الوقت الفاصل بين التصوير ولوحة هجرة إنزيمية لقياس الهجرة الخلية تشيموتاكتيك13. تصوير الخلية تعيش في شكل جيد متعدد يسمح للتصور والتقدير الكمي للهجرة الخلية تحت شروط معاملة متعددة. المقايسة الثانية الموصوفة هنا هو كروي غزو مقايسة13،17، ما هي التدابير خصائص بتسكس الغازية مثقف تحت ظروف نيوروسفيري وجزءاً لا يتجزأ في مصفوفة خارج الخلية 3D تحت العلاج المختلفة شروط. عموما، هذه فحوصات متوافقة أكثر بكثير مما سبق وصفها منهجيات دراسة خصائص متغايرة بتسك الثقافات المهاجرة والغازية. كما أنها توفر فرصاً أفضل للتحري عن رواية الاستراتيجيات العلاجية لاستهداف كل من الهجرة والغزو، التي تسهم إلى حد كبير في تكرار المرض والفتك.
Protocol
1-استزراع الخلايا الجذعية ورم الدماغ سابقا المستمدة من عينات جليوبلاستوما البشرية
ملاحظة: وضعت الثقافات بتسك سابقا من البشرية GBM عينات المريض6،،من78،9،10.
- ذوبان الجليد قنينة من الحفاظ على جثمان بتسكس في كوب يحتوي على الإيثانول 70%، وضعها داخل حمام مائي عند 37 درجة مئوية، حتى مجرد آخر الجليد قد تحسنت. تمييع الخلايا المذابة في 10 مل من وسائل الإعلام في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي الخلايا في قوة الطرد المركزي 150 النسبي (التعاون الإقليمي) لمدة 7 دقائق.
ملاحظة: في جميع أنحاء هذه البروتوكولات، وسائط كاملة تشير إلى الوسائط القياسية المستخدمة للثقافة بتسكس (سبق وصفها كيلي et al.) 6, عادة مع عوامل النمو الحالي. وسائل الإعلام دون عوامل النمو يشير إلى قاعدة الوسائط مع كافة المكونات ولكن دون أي عوامل النمو تستكمل. - نضح وسائط الإعلام، ريسوسبيند الخلايا في 8 مل من وسائل الإعلام كاملة، ونقل الخلايا ووسائل الإعلام إلى قارورة T25.
- بعد أسبوع واحد من استزراع تحت ظروف غير ملتصقة، رصد في قارورة يوميا واستكمال المحتويات مع 1-2 مل من وسائل الإعلام كاملة حسب الحاجة، وإذا بدأ أن تستنفد وسائل الإعلام أو يبدأ لتصبح حمضية كما أشار إلى ذلك تغيير لون البرتقالي والأصفر. مرور الخلايا عندما تصل إلى نيوروسفيريس يبلغ قطرها حوالي 250 ميكرومتر، عادة ما بين 10-14 د (الشكل 1).
ملاحظة: يختلف الوقت مضاعفة بتسك الثقافات المختلفة على نطاق واسع. ويمكن قياس حجم نيوروسفيري استخدام ميكرومتر العين. - إلى ممر بتسكس، جمع وسائل الإعلام وأسفل سطح قارورة من أجل جمع جميع نيوروسفيريس وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل نيوروسفيريس التي بيبيتينج وسائل الإعلام والطرد المركزي في أنبوب لمدة 7 دقائق في 150 إطار التعاون الإقليمي.
ملاحظة: يمكن التحقق من قوارير تحت مجهر للتأكد من أنه تم جمع جميع نيوروسفيريس. غسل إضافية مع 5 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو وسائل الإعلام يمكن أن يؤديها لجمع أي نيوروسفيريس المتبقية حسب الضرورة. - أن تنأى نيوروسفيريس بتسك إلى الخلايا المفردة، نضح وسائط الإعلام وإضافة 1 مل من محلول مفرزة مسبقاً حرارة الخلية واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 7 تريتوراتي x بتسك 40 تعليق مع P1، 000 ميكروبيبيتي في ميكروليتر 800.
ملاحظة: الخلايا يمكن أن تكون المحتضنة أطول عند 37 درجة مئوية إذا لا ننأى نيوروسفيريس. - إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني (مع البنسلين المضادات الحيوية وستربتوميسين) إلى بتسكس منفصلان والطرد المركزي الخلايا في 150 إطار التعاون الإقليمي لمدة 7 دقائق.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند في بتسكس في 1-4 مل من وسائل الإعلام كاملة، تبعاً لحجم الخلية بيليه.
ملاحظة: تعليق خلية يحتاج إلى زيادة إضعاف إذا كان التركيز خارج حدود كشف دقيق لعد خلية دقيقة. - استخدام صبغة باستثناء الخلايا الميتة، مثل تريبان الأزرق، حساب عدد خلايا قابلة للحياة والبذور بتسكس في قارورة أو لوحة من الفائدة – عادة، 200,000-300,000 الخلايا في 8 مل وسائط كاملة في قارورة T25.
2-الدماغ ورم الخلايا الجذعية الهجرة الإنزيم
- خلايا البذور 200,000 في قارورة T25 في 8 مل وسائط كاملة 1-2 أسابيع قبل التخطيط للقيام فحص هجرة.
ملاحظة: الوقت بين الطلاء والقيام الفحص سوف تختلف تبعاً لمعدل نمو الثقافة بتسك المستخدمة.- لاختبار تأثير العلاج من تعاطي المخدرات في الهجرة، بريتريت الخلايا مع الوسيلة الملائمة، مثل [دمس]، والمخدرات من الفائدة عن طريق إضافة وحدات التخزين المطبقة من رصيد المركبات أو المخدرات مباشرة في آبار منفصلة من الوسائط التي تحتوي على الخلايا.
- إعداد لوحة الهجرة إنزيمية (الشكل 2A) بطلاء أنه مع طبقة رقيقة من الكولاجين.
- حساب العدد الآبار للوحة إنزيمية 96-جيدا أنه سيكون من الضروري أن تكون مغطاة بطبقة الكولاجين. وتشمل على الأقل ثلاثة آبار نسخ متماثل لكل حالة.
- تمييع 5 ملغ/مل من المخزون من النوع الأول من الكولاجين إلى 0.2 مغ/مل في حامض الخليك النقي المخفف إلى 0.14 في المائة في ثقافة الصف المياه.
- "الماصة؛" 0.2 ملغ/مل الكولاجين إلى إدراج غشاء الآبار وخزان أسفل الآبار التي يتم استخدامها.
ملاحظة: تتطلب الخزانات السفلي من اللوحة ميليلتر 225 والآبار إدراج غشاء تتطلب 75 ميليلتر من الكولاجين لطلاء مناسب. - مكان لوحة الهجرة في حاضنة في 37 درجة مئوية حاء 1 نضح الحل الكولاجين من الآبار دون خدش الطلاء الكولاجين.
- غسل الآبار 2 x مع PBS العقيمة x 1. إذا كان لا يتم استخدام اللوحة الحق بعيداً، نضح في برنامج تلفزيوني وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قبل الشروع في الاستخدام، الحارة لوحة الهجرة إنزيمية لدرجة حرارة الغرفة.
- إعداد الخزان السفلي من لوحة الهجرة إنزيمية.
- "الماصة؛" ميليلتر 225 من وسائل الإعلام (دون عوامل النمو)، وتستكمل مع 10% FBS ك chemoattractant، إلى الآبار خزان أسفل اللوحة الهجرة إنزيمية.
- بلطف مكان إدراج غشاء إلى الخزان السفلي بزاوية تجنب خلق الفقاعات.
- لوحة إدراج الخلايا في الغشاء لصفيحة الهجرة إنزيمية.
- نات ريسوسبيند بتسكس في وسائل الإعلام (بدون عوامل النمو) في كثافة خلية من خلايا/مل 50,000. إضافة الأدوية إلى وسائل الإعلام إذا كان تقييم الهجرة خلال العلاج بالعقاقير المختلفة. بدلاً من ذلك، البذور أعدادا متساوية من الخلايا ما قبل المعالجة ومراقبة الخلايا، مع الحفاظ على تركيز المخدرات النهائي عند الطلاء.
- لوحة 50 ميليلتر من بتسكس من الخطوة 2.4.1 في كل بئر من لوحة الهجرة ظروف العلاج المطلوب.
- صورة الهجرة إنزيمية.
- ضع لوحة الهجرة إنزيمية في نظام التصوير خلية يعيش ومجموعة برامج التصوير الآلي الحصول على الصور المجهرية لصفيحة كل ح 1-2 ليصل إلى 72 h. استخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد)، انقر بالزر الأيمن على الجدول الزمني وتعيين الفاصل الزمني تفحص بكل ح 2 ح 24.
ملاحظة: سوف تختلف الفاصل الزمني وإجمالي الوقت المنقضي بين الثقافات بتسك المستخدمة؛ بدء تشغيل مع فترات ح 2 عن ح 72 حتى اكتسبت خبرة مع فرادى بتسك الثقافات. إذا كان نظام تصوير الآلي غير متوفر، ثم صور لنفس الحقل للعرض يمكن الحصول عليها يدوياً مجهر وكاميرا متصلة ببرامج التصوير. - بمجرد الحصول على الصورة كاملة، الحصول على الصور من أجل التجربة كاملة وإنشاء تعريف معالجة باستخدام برمجيات التحليل الذي يميز الخلايا من خلفية الغشاء والمسام الهجرة (الشكل 2B، القناع الأحمر) . استخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد)، حدد وضع تعريف جديد لمعالجة وتعيين إعدادات تعريف المعالجة بتسكس إلى عتبة البذور من 52، تنمو عتبة التعديلات 85، من الحجم (بكسل)-1، وهي منطقة الحد الأدنى من 200 ميكرومتر2. تطبيق هذا التعريف المعالجة على الجانب السفلي للغشاء. قم بتعديل هذا التحليل إذا أنه لا يميز بدقة الخلايا من غشاء الخلفية.
- جمع البيانات كمساحة الخلية على الجانب السفلي للغشاء لكل من ثلاثة آبار نسخ متماثل، وفقط بحساب الخلايا التي تم ترحيلها من خلال المسام. الرسم البياني هجرة الخلايا في ميكرو2 (ترحيل مجال الخلايا) على مر الزمن (الشكل 2 ج، الشكل 3).
ملاحظة: تأكد من أن عدد الخلايا مطلي ويعول على السطح العلوي للغشاء عند أول نقطة الوقت النسبي متشابهة (أقل من 20% تباين عبر جميع الآبار) بين جميع شروط العلاج لتجنب أية آثار لطلاء غير متكافئ. جمع البيانات باستخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد) يمكن تنفيذها قبل البدء في تعريف المعالجة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.5.2، النقر فوق المقاييس، ثم تصدير البيانات في الرسم البياني والتصدير، ومن ثم على .
- ضع لوحة الهجرة إنزيمية في نظام التصوير خلية يعيش ومجموعة برامج التصوير الآلي الحصول على الصور المجهرية لصفيحة كل ح 1-2 ليصل إلى 72 h. استخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد)، انقر بالزر الأيمن على الجدول الزمني وتعيين الفاصل الزمني تفحص بكل ح 2 ح 24.
3-الدماغ ورم الخلايا الجذعية نيوروسفيري غزو الإنزيم
- خلايا البذور 200,000 في 8 مل وسائط كاملة في قارورة T25 1-2 أسابيع قبل التخطيط للقيام مقايسة غزو.
ملاحظة: التوقيت من الطلاء للقيام التحليل يعتمد على معدل انتشار الثقافة بتسك المستخدمة.- للخلايا pretreated، إضافة مجمع الفائدة إلى قارورة في التركيز المطلوب لفترة زمنية محددة مسبقاً قبل نيوروسفيريس على استعداد ليكون مطلي للغزو.
- انتظر حتى يتم نيوروسفيري متوسط الحجم حوالي 150-200 ميكرومتر؛ عادة ما يأخذ هذا د 7-14، تبعاً لثقافة بتسك قيد الاستخدام.
ملاحظة: ونموذجي لمراقبة توزيع أحجام المجال في قارورة. - تلميح ولطف المزيج في قارورة مع ماصة ونقل 500 ميكروليتر من نيوروسفيريس بتسك إلى أنبوب مخروطي 1.5 مل لكل شرط المعاملة؛ سيتم استخدام هذا لوحة ثلاثة آبار نسخ متماثل.
ملاحظة: الخطوات 3.3.1-3.3.2 اختيارية ولكن الموصى بها للتجربة الأولى للغزو في ثقافة بتسك جديدة.- لتحديد كثافة نيوروسفيريس التي سوف ينتهي في البئر، إعداد أنبوب 1.5 مل كما في الخطوة 3، 3. بلطف المزيج في نيوروسفيريس ونقل 100 ميكروليتر إلى لوحة 96-بئر منفصلة والسماح نيوروسفيريس بتسوية بالجاذبية لمدة 5 دقائق.
- تحقق عدد نيوروسفيريس تحت المجهر التأكد من نيوروسفيريس متعددة في منطقة البئر التي سيتم تصويرها دون اكتظاظ أنه.
ملاحظة: تتطلب نيوروسفيريس الغازية مجالاً كافياً لثلاثية في القطر دون التفاعل مع المجاورة نيوروسفيريس. ويمكن تعديل عدد نيوروسفيريس الواحدة وكذلك بإحصاء عدد نيوروسفيريس كل بئر وإضافة نيوروسفيريس أكثر أو أقل من قارورة T25 بأنبوب 1.5 مل مخروطية الشكل في الخطوة 3، 3.
- وضع أنبوب مخروطي 1.5 مل مع الخلايا من الخطوة 3، 3 على الجليد ونفذ الخطوات 3.5-3.7 على الجليد.
- واسمحوا نيوروسفيريس تسوية بالجاذبية إلى أسفل الأنبوبة المخروطية 1.5 مل لمدة 5 دقائق وبريتشيل لوحة 96-بئر مسماة على الجليد.
- ريسوسبيند نيوروسفيريس في البروتين المصفوفة خارج الخلية.
- إعداد 500 ميكروليتر 0.4 ملغ/مل النوع الأول من الكولاجين الحل على الجليد لكل شرط المعاملة: إضافة ميكروليتر 459 من وسائل الإعلام (دون عوامل النمو) و 40 ميكروليتر من الكولاجين 5 ملغ/مل الحل الأسهم 0.92 ميكروليتر من 1N العقيمة هيدروكسيد الصوديوم (الجدول 1).
ملاحظة: مطلوب 500 ميكروليتر من الحل الكولاجين كل شرط المعاملة: 100 ميكروليتر لكل من ثلاثة آبار نسخ متماثل و 200 ميكروليتر من الفائض. العلاج بالعقاقير تحتاج إلى إضافتها هنا في تركيز النهائية المرجوة، مطروحاً من عنصر الوسائط في الحل. ويصف هذا البروتوكول الاستخدام النوع الأول من الكولاجين كالبروتين المصفوفة خارج الخلية؛ ومع ذلك، يمكن اختبار أي البروتين المصفوفة خارج الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، بتسك يمكن استكمال الثقافات التي لديها معدلات أبطأ من الغزو، وعوامل النمو أو FBS في وسائل الإعلام لزيادة معدل الغزو. - بعد أن استقرت نيوروسفيريس من الخطوة 3، 5، نضح كجزء كبير من وسائل الإعلام قدر الإمكان دون أن تفقد بيليه نيوروسفيري التي استقرت في الجزء السفلي. بلطف ريسوسبيند نيوروسفيريس في 500 ميكروليتر من الكولاجين الحل أعد الخطوة 3.6.1.
- إعداد 500 ميكروليتر 0.4 ملغ/مل النوع الأول من الكولاجين الحل على الجليد لكل شرط المعاملة: إضافة ميكروليتر 459 من وسائل الإعلام (دون عوامل النمو) و 40 ميكروليتر من الكولاجين 5 ملغ/مل الحل الأسهم 0.92 ميكروليتر من 1N العقيمة هيدروكسيد الصوديوم (الجدول 1).
- إضافة 100 ميكروليتر من خليط الكولاجين ونيوروسفيري إلى ثلاثة آبار نسخ متماثل من لوحة 96-جيدا على الجليد. السماح نيوروسفيريس ليستقر على الجليد لمدة 5 دقائق.
- نقل لوحة 96-جيدا لحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للكولاجين البلمرة.
- فورا بإعداد الصورة في لوحة 96-جيدا.
- ضع لوحة 96-جيدا في علبة نظام التصوير خلية يعيش أو المرحلة من المجهر للحصول على صورة كمرجع لحجم نيوروسفيري في وقت الطلاء، قبل بدء الغزو.
- الحصول على الصور كل ساعة حتى قد استقرت معدل الغزو؛ عادة ما يحدث هذا خلال 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن تعديل الفاصل الزمني التصوير اعتماداً على المعدات المستخدمة. يمكن أيضا تعديل الفاصل الزمني وإجمالي الوقت المنقضي التصوير للثقافات بتسك التي لديها معدلات مختلفة من الغزو.
- تحديد مساحة متزايدة من بتسكس كما أنها تغزو المصفوفة على مر الزمن.
ملاحظة: المساحة السطحية للخلايا في وقت الطلاء، تحسب كمتوسط ثلاثة آبار نسخ متماثل، يجب أن تكون مماثلة (أقل من 20% تباين عبر جميع الآبار) بين شروط معاملة مختلفة التأكد من الفروق في الغزو بتسك ليست بقوة تتأثر بعدد أو حجم نيوروسفيريس مطلي.- لنظام تحليل خلية يعيش، استخدم هدفا X 10 للحصول على صورة والحصول على أربع صور كل بئر لتكرار الثلاثة آبار. لتحديد الخلية النسبي المساحة، ممثلة بالتقاء النسبة المئوية من البئر، إعداد تعريف معالجة على وجه التحديد يسلط الضوء على الخلايا على خلفية البئر. استخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد)، حدد "تعريف جديد لمعالجة" وتعيين التكيف تجزئة إلى 0.8، منطقة الحد الأدنى إلى 300 ميكرو2، والانحراف في الحد الأقصى إلى 0.99. قم بتعديل هذا التحليل إذا أنه لا يميز بدقة الخلايا من الخلفية.
ملاحظة: إذا كان استخدام أساليب أخرى لغزو نيوروسفيري الصورة مع مرور الوقت، من المستحسن للحصول على طريقة عرض لحقول متعددة لتكرار الثلاثة آبار على مر الزمن. ومع ذلك، عدم التصوير الدقيق نفس الحقل للعرض في كل فاصل زمني ستزيد الخطأ القياسي للبيانات التي تم جمعها. يمكن استخدام برامج الكمبيوتر للمساعدة على قياس المساحة السطحية للخلايا الغازية في كل صورة. - جمع البيانات كخلية إجمالي المساحة (نسبية أو مطلقة) لكل بئر في كل وقت نقطة وتحديد متوسط ثلاثة آبار نسخ متماثل. الرسم البياني غزو بتسكس برسم منطقة الخلية المتزايد مع مرور الوقت.
ملاحظة: جمع البيانات باستخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد) التي يمكن تنفيذها قبل البدء في تعريف المعالجة التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.10.1، النقر على المقاييس، ثم على الرسم البياني والتصدير، وثم تصدير البيانات على .
- لنظام تحليل خلية يعيش، استخدم هدفا X 10 للحصول على صورة والحصول على أربع صور كل بئر لتكرار الثلاثة آبار. لتحديد الخلية النسبي المساحة، ممثلة بالتقاء النسبة المئوية من البئر، إعداد تعريف معالجة على وجه التحديد يسلط الضوء على الخلايا على خلفية البئر. استخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد)، حدد "تعريف جديد لمعالجة" وتعيين التكيف تجزئة إلى 0.8، منطقة الحد الأدنى إلى 300 ميكرو2، والانحراف في الحد الأقصى إلى 0.99. قم بتعديل هذا التحليل إذا أنه لا يميز بدقة الخلايا من الخلفية.
Representative Results
وهنا يصف لنا أمثلة من البيانات التي يمكن الحصول عليها باستخدام خلية يعيش فحوصات التصوير لدراسة الهجرة بتسك وغزو. بتسكس هي مطلي كخلايا مفردة ويمكن زراعتها كالتعويم الحر نيوروسفيريس (الشكل 1). ونحن تبين أن بتسكس يمكن فصلها ومطلي في الآبار لإدراج غشاء في صفيحة هجرة إنزيمية التي هي مغلفة بطبقة رقيقة من نوع الكولاجين (الشكل 2A). بتسكس الفردية موزعة بالتساوي على رأس إدراج غشاء في بداية المقايسة. على مدى فترة 24-72 ساعة، التمسك الغشاء الخلايا وتتحرك على سطح معدني مغلف بالكولاجين وتهاجر من خلال واحدة من المسام الصغيرة 96 إلى الجانب السفلي للغشاء، اتجاه تشيمواتراكتانت في الخزان جيدا. وبعد تسليط الضوء على الخلايا أعلى الغشاء باللون الأصفر والمسام باللون الأزرق، والخلايا الموجودة على الجزء السفلي من الغشاء باللون الأحمر، يمكن رؤية خلايا يدخل في المسام على الجزء العلوي (الخلية الصفراء تقترب مسام أزرق) وتغادرها المسام في الجزء السفلي (خروج الخلية الحمراء جي المسام الأزرق) (الشكل 3). الأهم من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا المعالجة بالعقاقير ومطلي في نفس لوحة الهجرة إنزيمية كخلايا مراقبة معاملة مركبة لدراسة تأثير التدخلات العلاجية على الهجرة بتسك (الشكل 2). تسمح لوحة الهجرة إنزيمية لتصوير الخلايا على الأعلى وأسفل إدراج غشاء. ولذلك، التحديد الكمي للهجرة الخلية مع مرور الوقت الممكن طريق عد الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجانب السفلي للغشاء (الشكل 2).
وقد وجدنا أنه إذا كان لا يتم فصل بتسكس تماما، ثم خلايا لا تهاجر من خلال المسام وتبقى بصفة نيوروسفيريس الصغيرة (الشكل 4 أ). من المهم أيضا لا لوحة أكثر من 2,500 بتسكس/جيدا كهذه النتائج في الخلية التثاقل بدلاً من الهجرة إلى الجانب السفلي للغشاء (الشكل 4 باء). وأخيراً، من الضروري تجنب جعل فقاعات في الغشاء إدراج الآبار عند طلاء الخلايا، وعندما وضع الغشاء إدراجه في الخزان السفلي، كما يمنع هذا التصوير الدقيق والقياس الكمي (الشكل 4).
وبعد ذلك، نعرض أن غزو بتسك، من نيوروسفيريس إلى المصفوفة المحيطة بها، يمكن تصويرها وكمياً على مر الزمن في شكل لوحة 96-جيدا (الشكل 5A). ويمكن قياس الغزو بتحديد مقدار المساحة السطحية للخلايا كما أنها تغزو المصفوفة على مر الزمن. استخدام برنامج تحليل الصور، تم تطبيق تعريف معالجة أن تراكبات قناع على الخلية سطح المنطقة، مما يسمح للقياس الكمي التلقائي على مر الزمن (الشكل 5 (ب)). كما يمكن إنشاء أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين غزوات بتسك، لسهولة مراقبة العملية الشاملة لغزو بتسك (الشكل 6). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مجهر فلوري للصورة بتسكس التي تعبر عن البروتينات الفلورية، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو البروتين الأحمر نيون (RFP). وهنا، قمنا بإنشاء فيديو الوقت الفاصل بين بتسكس معربا عن نموذج سيتوسوليك للتجارة والنقل للمساعدة في تعقب بتسكس الفردية كما أنها تغزو الغشاء مثل مصفوفة (الشكل 7). كما يسمح هذا الفحص غزو نيوروسفيري بتسك للعلاج بالعقاقير التي ستضاف في الآبار نسخ متماثل تقييم آثارها على غزو بتسك من نيوروسفيريس في مصفوفة (الشكل 8 أ) مباشرة. يمكن حساب التقدير الكمي نيوروسفيريس متعددة في الآبار نسخ متماثل ورسوم بيانية مع مرور الوقت لتقييم تأثير الأدوية بتركيزات متعددة (الرقم 8B).
عدم التقيد بالبروتوكول، المذكورة أعلاه يمكن أن يؤدي إلى عدم قدرة على الحصول على بيانات موثوقة ودقيقة. التضمين نيوروسفيريس بتسك التي تكون كبيرة جداً، يبلغ قطرها أكبر من 200 ميكرومتر، يؤدي إلى طائرة لتركيز كبير جداً لقياس دقة جميع المجالات في مجال رؤية (الشكل 8). وبالمثل، عدم المحافظة على المصفوفة عند 4 درجة مئوية بينما التضمين في نيوروسفيريس يمكن أن يؤدي أيضا إلى المجالات التي ليست على نفس الطائرة من التركيز ومصفوفة خارج الخلية التي لا قد وطدت بالتساوي، مما يحول دون جمع بيانات دقيقة (الرقم 8 ).
رقم 1: استزراع بتسكس. هذه اللوحات مثال ممثل بتسكس تزرع من خلايا مفردة إلى نيوروسفيريس على مدى فترة 14-د في الثقافة. نيوروسفيريس هو موضح هنا في يوم 14 بحجم المناسب باساجينج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تصوير الخلية تعيش الهجرة بتسك. (أ) هذا مثال على لوحة الهجرة إنزيمية 96-جيدا المغلفة بطبقة رقيقة من نوع أنا الكولاجين قبل إجراء فحص الهجرة مع بتسكس. إظهار الصور ط) صفيحة مع كل ثلاثة أجزاء (غطاء وإدراج غشاء المكامن) توضع معا، ثانيا) كل ثلاثة أجزاء مفصولة، ثالثا) صورة عن قرب لعرض أعلى من إدراج غشاء، رابعا) صورة عن قرب لأسفل ويرى إدراج الغشاء ، والخامس) صورة عن قرب للخزان السفلي. (ب) وهذه هي الصور التمثيلية الهجرة بتسك في بداية التجربة (ح 0) وفي ح 24. صورة ينصب على رأس إدراج الغشاء حيث كانت أصلاً مطلي الخلايا. يتم تمييز الخلايا التي هاجرت إلى الجزء السفلي من لوحة الهجرة إنزيمية باللون الأحمر. في ح 0، هاجر بعض الخلايا على الجانب السفلي للغشاء. بعد 24 ساعة، ازداد عدد الخلايا التي تم ترحيلها جذريا. المقارنة بين الصور في 24 ساعة للخلايا تعامل مع مركبة مقابل مخدرات العاشر يوضح أن العلاج من تعاطي المخدرات يقلل من الهجرة بتسك. مقياس أشرطة تمثل 600 ميكرون. (ج) هذا الفريق يظهر التحديد الكمي لترحيل بتسك عقب ما قبل المعالجة بالمركبات أو المخدرات X. يبين الرسم البياني أن معاملة المخدرات له تأثير قوي على هجرة بتسكس. نقاط البيانات متوسط ثلاثة آبار تكرار التقنية، وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرسوم المتحركة 3 الشكل: فيديو الوقت الفاصل بين الهجرة بتسك. يوضح هذا الفيديو هجرة بتسكس نوع أنا الكولاجين المغلفة باستخدام لوحة الهجرة إنزيمية. يتم تمييز الخلايا على رأس إدراج الغشاء باللون الأصفر ويتم تمييز الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجزء السفلي من إدراج غشاء باللون الأحمر، وهي أبرز المسام في الغشاء باللون الأزرق. يتم تعيين الطائرة من التركيز إلى خلايا الصورة على الجانب السفلي للغشاء. الفيديو تم إنشاؤه باستخدام الصور الوقت الفاصل بين اتخاذ كل ساعة ح 51، وجمعت في 4 إطارات في الثانية الواحدة. شريط مقياس يمثل 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
رقم 4: أمثلة لأخطاء في التشكيل المقايسة الهجرة- (أ) هذا الفريق يظهر مثال من بتسكس التي لا تم فصل تماما قبل الطلاء على إدراج غشاء أعلى اللوحة الهجرة إنزيمية. نظراً للحجم الكبير للمجالات وصغر حجم مسام الغشاء، الخلايا غير قادر على ترحيل إلى الخزان السفلي. (ب) يظهر هذا الفريق مثالاً لفحص الهجرة حيث كانت مطلي بعدد كبير جداً من الخلايا. التثاقل الخلايا يتداخل مع الهجرة الخلية ويخل بالقياس الكمي. (ج) يبين هذا الفريق مثالاً لتشكيل فقاعة في إدراج الغشاء حيث كانت مطلية بتسكس. فقاعات ينتج في جودة الصورة رديئة ومنع الكمي دقيق للهجرة. تمثل أشرطة مقياس 600 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: بتسك نيوروسفيري غزو المقايسة. هذه اللوحات إظهار مثال بتسكس الغازية من نيوروسفيري إلى نوع 0.4 ملغ/مل أنا مصفوفة الكولاجين على مدى فترة ح 6. هنا، تظهر الصور على النقيض المرحلة (A) في كل مرة نقطة (ب) مع قناع الكمية الممثلة مضافين، كما هو موضح بالتفصيل في الخطوة 3 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: بتسك نيوروسفيري الفيديو الوقت الفاصل بين الغزو في النوع الأول من الكولاجين- هذا الفيديو يظهر الغزو بتسكس من نيوروسفيري إلى 0.4 ملغ/مل النوع الأول من الكولاجين مصفوفة (كما هو موضح أيضا الصور الثابتة في الشكل 5A). الصور تم الحصول عليها استخدام كل ساعة هدفا X 10 ح 12، ويتم تجميعها في 4 إطارات في الثانية الواحدة. شريط مقياس يمثل 300 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
رقم 7: بتسك نيوروسفيري الفيديو الوقت الفاصل بين الغزو في مصفوفة مثل الغشاء. يوضح هذا الفيديو غزو بتسكس، أن بروتينات فلورية خضراء إكسبريس سيتوسوليك، من نيوروسفيري في مصفوفة شبيهة بغشاء الطابق السفلي. الصور تم الحصول عليها باستخدام هدفا X 4 كل 30 دقيقة ح 48، وجمعت في 8 إطارات في الثانية الواحدة. شريط مقياس يمثل 800 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الشكل 8: بتسك نيوروسفيري غزو المقايسة مع العلاج. (أ) بتسك نيوروسفيريس كانت جزءا لا يتجزأ من مصفوفة مثل الغشاء أعد مع السيارة أو تركيزات المشار إليه من المخدرات "عاشرا الصور" تم الحصول عليها كل ساعة؛ تظهر هنا صور تتخذ في الوقت للطلاء وبعد ح 16. شريط مقياس يمثل 200 ميكرومتر. (ب) كان غزو بتسكس من نيوروسفيريس إلى المصفوفة المحيطة كمياً كل ساعة، كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول. نقاط البيانات متوسط ثلاثة آبار تكرار التقنية، وتمثل مجالات الخطأ الخطأ المعياري للوسط (SEM). (ج) هذا الفريق يظهر نيوروسفيريس بتسك جزءا لا يتجزأ من نوع أنا الكولاجين مع مجال كبير جداً للقياس الكمي. شريط مقياس يمثل 300 ميكرون. (د) يظهر هذا الفريق نيوروسفيريس بتسك المضمنة في نوع أنا الكولاجين التي لم تحدد تماما. يمثل الشريط مقياس 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| إعداد الحل الكولاجين | |
| الأسهم [الكولاجين] (mg/ml) | 5 |
| النهائي [الكولاجين] (mg/ml) | 0.4 |
| عدد الآبار اللازمة: | 5 |
| إجمالي الحجم (ميكروليتر) | 500 |
| حجم المخزون الكولاجين (ميكروليتر) | 40 |
| حجم هيدروكسيد الصوديوم 1N (ميكروليتر) | 0.92 |
| حجم الوسائط (ميكروليتر) | 459 |
الجدول 1: إعداد 0.4 ملغ/مل في النوع الأول من الحل الكولاجين. المذكورة هي البداية المعروفة والتركيزات النهائية المرجوة من النوع أنا الحل الكولاجين. سرد وحدات التخزين كافية للوحة نيوروسفيريس إلى ثلاثة آبار نسخ متماثل، بالإضافة إلى اثنين لفائض، ويمكن أن تتضمن شرط معاملة واحدة، كما هو موضح بالتفصيل في الخطوة 3 من البروتوكول.
Discussion
نظراً لأن الخلايا السرطانية تنتشر بنشاط، وهذا يشكل تحديا تقنية محتملة لدراسة الهجرة الخلية. مقايسة الهجرة المذكورة هنا، هي مطلي بتسكس دون عوامل النمو، مما يحد من الانتشار، والتدرج chemoattractant بليت به لا حجته تماما أكثر من 72 ساعة. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يجري رصد الخلايا باستخدام التصوير خلية يعيش مع مرور الوقت، خلايا يمكن بصريا رصد لضمان عدم حدوث انقسام الخلية على نطاق واسع. لنجاح الفحص الهجرة، من المهم أن ننأى نيوروسفيريس تماما للخلايا المفردة ودقة عد الأرقام الخلية قبل الطلاء. تصفيح المجالات أو تصفيح الكثير من الخلايا، مما يؤدي إلى نتائج في التثاقل، منع الخلايا من الهجرة عن طريق المسام الصغيرة (الشكل 4A و 4B). من المهم أيضا تجنب خلق فقاعات عند طلاء الخلايا الموجودة في لوحة الهجرة إنزيمية أو عند وضع إدراج غشاء على قاع الخزان. فقاعات يمكن تغيير الطائرة من التركيز ومنع القياس الكمي الدقيق (الشكل 4). لوحة كاملة يجب أن تكون مغلفة بطبقة رقيقة من الكولاجين لأن هذا يعطي خلايا سطح للتنقل إلى المسام في اللوحة، كما يتطلب هذا الفحص الخلايا على التمسك وثم ترحيل عبر سطح بيولوجيا ذات صلة نحو تشيمواتراكتانت.
يسمح البروتوكول الهجرة بتسك الموصوفة هنا لتقييم حركية الهجرة الخلية الفردية، التي تتطلب عددا أقل من الخلايا لاختبار شروط معاملة مختلفة بالمقارنة مع البروتوكولات القائمة. وهذا مهم للثقافات التي تنمو ببطء شديد، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب على جمع عدد كبير من الخلايا للتجريب. كثافة منخفضة المسامية لصفيحة الهجرة إنزيمية يسمح للموازنة أبطأ التدرج تشيمواتراكتانت، أكبر من ح 72، ويحاكي أكثر فعالية العملية البيولوجية للهجرة تشيموتاكتيك على مدى فترة أطول من الزمن. البروتوكول الأمثل أن يكون طبقة رقيقة جداً من طلاء الكولاجين على لوحة إنزيمية الهجرة كفالة أن يكون تحليل تدابير الهجرة ولا غزو. كما يسهل التصوير والتقدير الكمي للخلايا المفردة كما أنها تلتزم بالمصفوفة الكولاجين طلاء إدراج غشاء. واحد الحد من الأسلوب غير أن التحديد الكمي للهجرة عبر آبار متعددة على مر الزمن إلى حد كبير مبسطة وسريعة باستخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد). ميزة ملحوظة لفحص الهجرة كما هو موضح هنا هو قدرة على التكيف على نطاق واسع من البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى. أنه سوف يكون مفيداً بشكل خاص للتحديد الكمي للهجرة تشيموتاكتيك من خطوط الخلايا التي هي أما بطيئة النمو، صعبة للالتزام، أو ترحيل ببطء.
لضمان النجاح للمقايسة غزو بتسك، من الضروري جمع نيوروسفيريس قبل أن تصبح أكبر من مجالات 200 ميكرومتر. أكبر طائرة تركيز كبير جداً لاستمرار الصورة وتحديدها كمياً (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، يمكن أن يبدأ نيوروسفيريس أجمة وتجميعها مع نيوروسفيريس الأخرى. وهذا يؤثر على الحصول على بيانات دقيقة ومتناسقة. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري أن يسمح نيوروسفيريس ليستقر على الجزء السفلي من البئر في حين الكولاجين لا يزال على الجليد، والسماح نيوروسفيريس تصويرها في طائرة واحدة للتركيز (الشكل 5). وبالمثل، من المهم السماح للكولاجين لتعيين تماما دون تحريك اللوحة كهذه يمكن أن تعطل تشكيل مصفوفة حتى، مما قد يؤثر سلبا على جودة الصورة (الشكل 5). للمقايسة غزو بتسك الموصوفة هنا، واحد من أهم مزايا أن بتسكس مثقف نيوروسفيريس يمكن تقييمها للغزو مباشرة، دون الحاجة إلى أن تزرع أدهيرينتلي. وعلاوة على ذلك، يمكن تضمين نيوروسفيريس بتسك في أي مصفوفة خارج الخلية، أما استخدام المكونات الفردية للمصفوفة خارج الخلية من أنسجة محددة أو باستخدام خليط غشاء متاحة تجارياً. يمكن أن تساعد تحديد المصفوفة خارج الخلية لتحديد أو لاختبار آليات محددة للغزو. على سبيل المثال، من الممكن مع هذا البروتوكول، لتقييم أثر استهداف أفراد الأسرة ميتالوبيبتيداسي مصفوفة من الجينات، التي من المعروف أن تتحلل مكونات محددة المصفوفة. بدلاً من ذلك، على الرغم من أن هذا البروتوكول محددة إلى نيوروسفيريس بتسك، أي الخلايا التي نمت كمجالات يمكن استخدامها بطريقة مماثلة. وتشمل الأمثلة خلايا سرطان الثدي المزروعة ماموسفيريس أو خلايا سرطان القولون والمستقيم الابتدائي مثقف تومورسفيريس؛ ومع ذلك، يحد هذا الأسلوب لأنواع الخلايا التي يمكن أن تنمو كمجالات في ثقافة. المزايا الأخرى لفحوصات كل من الهجرة والغزو هي أن تكون سهلة لإعداد وأنها تعمل بشكل جيد 96، والبيانات قابلة للقياس مع مرور الزمن.
إجمالاً، منعا لتكرار العلاج بعد الخليج للحاسبات الآلية، من الضروري وضع منهجيات تيسير التحقيق بتسك الهجرة والغزو. بروتوكول الهجرة الموصوفة هنا يوفر مزايا عديدة أكثر فحوصات الهجرة المتبعة سابقا، لا سيما لدراسة بتسكس GBM. ينطوي هذا البروتوكول الهجرة تحسين الناي بتسكس مثقف تحت ظروف نيوروسفيري وطلاء الخلايا المفردة في صفيحة هجرة إنزيمية المغلفة بالكولاجين 96-جيدا. باستخدام نظام تصوير خلية يعيش، يمكن رصد هجرة بتسكس وكمياً على مر الزمن. والرزن غزو الموصوفة هنا يسمح للرصد لغزوات بتسك من نيوروسفيريس في مصفوفة. هذا التحليل ينطوي على تضمين نيوروسفيريس في مصفوفة الكولاجين، أو آخر المصفوفة خارج الخلية الغنية بالبروتين، في لوحة 96-جيدا. تصوير اللوحة مع خلية يعيش الوقت الفاصل بين نظام تصوير يسمح للتحليل لغزوات بتسك تحت ظروف معاملة مختلفة على مر الزمن. وبالتالي، توفر هذه الاختبارات، أداة قيمة للعلماء أملا في تحسين فهم الآليات الكامنة وراء الهجرة بتسك والغزو.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون روزينا حسام وفواز ثاني لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد المنح من "مؤسسة كندا" هذا المشروع البحثي في جزء منه للابتكار (بحاء أرت لاشمان وصمويل فايس) وشبكات الخلايا الجذعية من كندا (أيضا إلى H. أرت لاشمان وصمويل فايس).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
