Summary
Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.
Abstract
Glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral agressivo que é mal controlado com as opções de tratamento disponíveis atualmente. Principais características do GBMs incluem rápida proliferação e invasão generalizada no cérebro normal. Recorrência é pensada para resultar da presença do rádio e quimio resistentes ao cérebro tumor células-tronco (BTSCs) que invadem longe da massa cancerosa inicial e, assim, evitar a ressecção cirúrgica. Daí, terapias que se destinam a BTSCs e suas habilidades invasivas podem melhorar o contrário de mau prognóstico desta doença. O nosso grupo e outros com sucesso estabelecido e caracteriza culturas BTSC de amostras de pacientes GBM. Essas culturas BTSC demonstram Propriedades de células-tronco de câncer fundamentais como diferenciação de auto-renovação, linhagem multi clonogenic e iniciação de tumor em camundongos deficientes em imune. A fim de melhorar as abordagens terapêuticas atuais para GBM, é necessária uma melhor compreensão dos mecanismos de migração BTSC e invasão. Em GBM, o estudo da migração e invasão é restrito, em parte, devido às limitações das técnicas existentes que não plenamente em conta as características de crescimento em vitro de BTSCs crescidos como neurospheres. Aqui, descrevemos rápidos e quantitativos viver-pilha de imagem ensaios para estudar a migração e a invasão de propriedades de BTSCs. O primeiro método descrito é o ensaio de migração BTSC que mede a migração em direção a um gradiente de quimiotático. O segundo método descrito é o ensaio de invasão de BTSC que as imagens e quantifica uma invasão celular da neurospheres em uma matriz. Os ensaios aqui descritos são utilizados para a quantificação da migração BTSC e invasão ao longo do tempo e sob condições de tratamento diferentes.
Introduction
Glioblastoma (GBM) é a forma mais comum e agressiva de câncer de cérebro e, apesar da atual terapia envolver ressecção cirúrgica seguida de radiação e quimioterapia, a sobrevida média dos pacientes é um mero 15 meses1. GBM é invasivo, altamente resistentes aos medicamentos, e, finalmente, uma doença incurável que requer continuou a pesquisa em sua biologia inerente a fim de identificar novas avenidas terapêuticas. A elevada mortalidade dos pacientes GBM é causada principalmente pela extensa invasão celular no tecido cerebral normal adjacente e a migração ao longo dos vasos sanguíneos, o que leva a uma recorrência da doença após tratamento2,3 . Um subconjunto de células, denominado cérebro tumor células-tronco (BTSCs), que são lentas, ciclismo e terapeuticamente resistente, têm sido a hipótese de levar à recorrência da doença. GBM BTSCs exibir as propriedades de auto-renovação de clonogenic, multipotency e tumor-iniciando potenciais4,5,6. BTSCs, também, manter a heterogeneidade genética, fenotípica e molecular de seu pai GBM tumores7,8,9,10. Estas propriedades tornam o BTSCs um sistema de modelo extremamente útil para o estudo da GBM e para explorar novas estratégias terapêuticas. In vivo, estas células estaminais são capazes de invasão quando implantado no cérebro de ratos neonatal11 , crescimento e formação de tumor e não-obesos diabéticos/severa combinada de ratos de imunodeficiência (NOD/SCID)4. A capacidade de BTSCs repetidamente formar tumores invasivos na vivo que recapitular as características celulares e histológicas dos tumores originais fortemente suporta seu papel como células de tumor-iniciando12.
Novas abordagens terapêuticas estão sendo desenvolvidas para o alvo BTSCs e ajudam a melhorar o resultado a longo prazo para pacientes com GBM. Atualmente, há limitada compreensão dos processos de migração e invasão celulares que estão associados à resistência terapêutica e recorrência. Migração e invasão são fenômenos distintos; migração é o processo subjacente o movimento direcionado de células e envolve a reorganização do citoesqueleto, moléculas de adesão e montagem/desmontagem focais de pontos de contacto, Considerando que a invasão também requer a destruição física das barreiras como uma matriz extracelular13. Uma metodologia amplamente aceita de estudar a invasão e a migração celular é o ensaio de Boyden câmara14,15. Para esta técnica, uma câmara de dupla é preenchida com mídia, com os meios de comunicação na câmara inferior, complementada com um quimiotático. Quimiotaxia é acionada usando fatores de crescimento específicos ou citocinas ou soro fetal bovino como um específico quimiotático. Seguindo o gradiente do quimiotático, células migram através da membrana porosa. No ponto de extremidade, as células migradas podem ser visualizadas e quantificadas na parte inferior da membrana pela coloração com corantes citológicos ou fluorescentes. O ensaio de migração pode ser modificado para um ensaio de invasão revestindo o poroso Boyden filtrar com componentes da matriz extracelular, como tipo eu colagénio ou uma matriz de membrana basal, como. Células invasoras degradam a matriz, percorrer a parte inferior do filtro poroso e podem ser quantificadas de maneira semelhante para o ensaio de migração. Outros ensaios de migração comumente usados incluem o risco de ferimento e zona de exclusão de célula ensaios13. O ensaio de risco de ferimento é executado pelo coçar uma lacuna em uma monocamada celular e observando a migração das células da borda da ferida por imagens em intervalos regulares até que o zero é fechado. No ensaio de exclusão de célula, uma barreira física é usada para criar uma zona livre de célula antes da semeadura de células. A barreira é removido uma vez que as células são confluentes e a migração das células para a zona livre de célula é fotografada regularmente16.
Estas previamente estabeleceram ensaios são frequentemente usados para estudar a migração ou invasão da populações de células aderentes e homogénea, mas pose de desvantagens consideráveis quando estudando GBM BTSCs ou outras populações de células de câncer heterogêneos. O ensaio de Boyden câmara pode gerar apenas de ponto de extremidade medidas contra uma avaliação cinética do movimento da célula. Uma observação ao longo do tempo é de alta relevância para a medição de migração BTSC, dado que as células de diferentes culturas muitas vezes migram em taxas diferentes. Como tal, as condições e o tempo do ensaio deve ser otimizada para cada tipo de cultura e requer mão de obra demorada de amostragem adequada e de quantificação. A exclusão de zero e a célula ensaios não são well-suited para culturas BTSC como, mesmo quando BTSCs são cultivadas sob condições de monocamada em placas com revestimento em laminina, temos observado que BTSCs parecem resistir o movimento para o espaço aberto e preferem ficar em fechar proximidade a outras células. Além disso, estes estabeleceram ensaios de migração não permitem a visualização e monitoramento de células individuais ao longo de um experimento. O monitoramento de células individuais ao longo do tempo é valioso para a avaliação de migração de populações de células heterogêneas, tais como BTSCs. desvantagens adicionais dos Boyden câmara, zero e a célula-exclusão zona ensaios para culturas BTSC que são eles exigem relativamente alta de celulares, pode ser demorado para configurar, e também equilibrar rapidamente ou não têm um gradiente quimiotático. Como tal, estes ensaios não são ideais para usar para populações de células raras ou crescimento lento ou de despistagem de drogas. Além disso, estes ensaios não são adequados para medir uma invasão em formato tridimensional (3D), que é especialmente importante para BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere.
Aqui, descrevemos os ensaios especificamente modificados para observação e quantificação da migração para BTSCs individuais e para a invasão da GBM BTSCs cultivadas como neurospheres. O primeiro ensaio descreve uma adaptação do ensaio câmara Boyden usando a imagem latente de lapso de tempo de viver-pilha e um prato de migração de quimiotaxia para medir célula Quimiotáticos migração13. Imagem latente da viver-pilha em um formato bem multi permite a visualização e quantificação da migração celular sob várias condições de tratamento. O segundo ensaio descrito aqui é um esferoide invasão ensaio13,17, que mede as propriedades invasivas de BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere e incorporado em uma matriz extracelular 3D sob vários tratamentos condições. Em geral, estes ensaios são muito mais compatíveis do que metodologias descritas anteriormente para estudar as propriedades migratórias e invasoras de culturas BTSC heterogêneas. Eles também oferecem melhores oportunidades para a investigação de novas estratégias terapêuticas para o alvo, migração e invasão, que contribuem significativamente para a recorrência da doença e letalidade.
Protocol
1. cultivo de células-tronco cérebro Tumor anteriormente derivada de espécimes de Glioblastoma humano
Nota: Culturas BTSC foram estabelecidas previamente de humano GBM amostras6,7,8,9,10.
- Descongele um frasco de BTSCs criogenicamente preservados em um béquer contendo álcool etílico 70%, colocado dentro de um banho de água a 37 ° C, apenas até a última do gelo esteja derretido. Diluir as células descongeladas em 10 mL de mídia em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar as células em força 150 em centrífuga relativa (RCF) para 7 min.
Nota: Ao longo destes protocolos, mídia completa refere-se a mídia padrão usada para cultura BTSCs (anteriormente descritas por Kelly et al) 6, normalmente com fatores de crescimento presentes. Mídia sem fatores de crescimento refere-se a mídia de base com todos os componentes, mas sem quaisquer fatores de crescimento completados. - Aspire a mídia, Ressuspender as células em 8 mL de mídia completa e transferir as células e os meios de comunicação para um balão de T25.
- Após 1 semana de cultivo sob condições não-aderente, monitorar o balão diariamente e complementar o conteúdo com 1 a 2 mL de mídia completa, conforme necessário, se a mídia começa a esgotar ou começa a se tornar ácida como indicada por uma mudança de cor amarelo-alaranjado. Células de passagem quando os neurospheres chegar a um diâmetro de aproximadamente 250 μm, geralmente entre 10-14 d (Figura 1).
Nota: O tempo de duplicação de diferentes culturas BTSC varia amplamente. Tamanho de neurosphere pode ser medido usando um micrômetro ocular. - Para passagem BTSCs, coletar os meios de comunicação e neurospheres pipetando a mídia abaixo da superfície do frasco para recolher todos os neurospheres e transfira para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar o tubo por 7 min em 150 RCF.
Nota: Os balões podem ser verificadas sob um microscópio para garantir que todos os neurospheres foram recolhidos. Uma lavagem adicional com 5 mL de fosfato tampão salino (PBS) ou meios de comunicação podem ser realizados para coletar qualquer restantes neurospheres conforme necessário. - Para dissociar o BTSC neurospheres em células únicas, aspirar a mídia e adicione 1 mL de solução de desprendimento de células previamente aquecido e incubar que a 37 ° C por 7 min. Triture o BTSC suspensão x 40 com um P1, micropipeta 000 fixado em 800 μL.
Nota: As células podem ser incubadas já a 37 ° C se o neurospheres não se dissociam. - Adicionar 5 mL de PBS (com os antibióticos penicilina e estreptomicina) para os BTSCs dissociadas e centrifugar as células no RCF 150 por 7 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender os BTSCs em 1-4 mL de mídia completa, dependendo do tamanho do centrifugado.
Nota: A suspensão de célula precisa ser diluído ainda mais se a concentração for além do limite de detecção precisa para celular precisa contar. - Usando um corante que exclui as células mortas, como trypan azul, contar o número de células viáveis e propagar os BTSCs para o balão ou a placa de interesse — normalmente, as células de 200.000-300.000 em 8 mL de mídia completa num balão T25.
2. cérebro Tumor ensaio de migração de células-tronco
- Células de semente 200.000 num balão T25 em 8 mL de mídia completa 1-2 semanas antes de planejar realizar um ensaio de migração.
Nota: O tempo entre o chapeamento e realizar o ensaio irá variar dependendo da taxa de crescimento da cultura BTSC usada.- Para testar o efeito de um tratamento de drogas, na migração, pré-tratamento das células com o veículo apropriado, como DMSO e drogas de interesse adicionando volumes aplicáveis do veículo ou droga circulante diretamente nos poços separados dos meios de comunicação que contém as células.
- Prepare a placa de migração quimiotaxia (Figura 2A) revestindo-a com uma fina camada de colágeno.
- Calcule o número de poços de uma placa de 96 poços quimiotaxia que terá de ser revestido com colágeno. Inclua pelo menos três poços replicar para cada condição.
- Diluir 5 mg/mL de estoque do colágeno tipo I a 0,2 mg/mL em puro ácido acético diluído a 0,14% em água de grau de cultura.
- Pipete 0,2 mg/mL de colágeno para ambos os poços da inserção da membrana e os poços de reservatório inferior que estão sendo usados.
Nota: Os reservatórios inferior da placa exigem 225 µ l e os poços de inserção de membrana 75 µ l de colágeno para um revestimento adequado. - Lugar a placa de migração em uma incubadora a 37 ° C por 1 h. aspirar a solução de colágeno dos poços sem riscar o revestimento do colágeno.
- Lavar os poços 2 x com PBS 1x estéril. Se a placa não estiver sendo usada imediatamente, aspirar a PBS e armazená-lo em 4 ° C por até 2 semanas. Antes da utilização, aquecer a placa de migração quimiotaxia à temperatura ambiente.
- Prepare o reservatório inferior da placa de migração de quimiotaxia.
- Pipete µ l 225 de mídia (sem fatores de crescimento), suplementado com 10% FBS como um quimiotático, aos poços da placa de migração quimiotaxia reservatório inferior.
- Coloque delicadamente a inserção da membrana no reservatório inferior em um ângulo para evitar a criação de bolhas.
- As células da placa para a inserção da membrana da placa de migração da quimiotaxia.
- Ressuspender dissociado BTSCs na mídia (sem fatores de crescimento), com uma densidade de células de 50.000 células/mL. Adicione drogas aos meios de comunicação se avaliando a migração durante tratamentos com drogas diferentes. Alternadamente, semente igual número de células previamente tratadas e controle as células, mantendo a concentração de fármaco final quando o chapeamento.
- Placa de 50 µ l dos BTSCs da etapa 2.4.1 em cada poço da placa de migração, sob as condições de tratamento desejado.
- Imagem da migração de quimiotaxia.
- Coloque a placa de migração de quimiotaxia no sistema da imagem latente de viver-pilha e conjunto o software automatizado da imagem latente para adquirir imagens microscópicas da placa cada 1-2 h por até 72 h. usando software comercial (ver Tabela de materiais), botão direito do mouse sobre o cronograma e definir o intervalo de varredura a cada 2 h por 24h.
Nota: O intervalo de tempo e o tempo total decorrido pode variar entre culturas BTSC usadas; Comece com intervalos de 2 h para 72 h até tem adquirido experiência com culturas BTSC individuais. Se um sistema automatizado de imagem não estiver disponível, então imagens do mesmo campo de visão podem ser adquiridas manualmente com um microscópio e uma câmera conectada ao software da imagem latente. - Uma vez concluída a aquisição da imagem, obter as imagens para todo o experimento e criar uma definição de processamento usando o software de análise que diferencia as células de fundo de membrana e os poros de migração (Figura 2B, máscara vermelha) . Usando o software comercial (ver Tabela de materiais), selecione uma Nova definição de processamento e definir as configurações de definição de processamento de BTSCs para um limiar de semente , de 52, um limiar de crescer de 85, ajustes do tamanho (pixels) por -1 e uma área mínima de 200 μm2. Aplica esta definição de processamento para o lado inferior da membrana. Modifica esta análise se ele não faz distinção com precisão as células da membrana fundo.
- Colete dados como a área de superfície de célula no lado inferior da membrana para cada um dos três poços replicar, que só conta as células que migraram através dos poros. A migração das células em μm2 do gráfico (área de células migradas) ao longo do tempo (Figura 2 C, Figura 3).
Nota: Certifique-se que o número relativo de células chapeado e contou com a superfície superior da membrana no primeiro tempo-ponto é similar (menos de 20% de variação em todos os poços) entre todas as condições de tratamento para evitar quaisquer efeitos do chapeamento desigual. Coleção de dados usando que o software comercial (ver Tabela de materiais) pode ser executado através do lançamento da definição de processamento criada na etapa 2.5.2, clicando em métricas, em seguida, exportação de dados no gráfico/exportare então no .
- Coloque a placa de migração de quimiotaxia no sistema da imagem latente de viver-pilha e conjunto o software automatizado da imagem latente para adquirir imagens microscópicas da placa cada 1-2 h por até 72 h. usando software comercial (ver Tabela de materiais), botão direito do mouse sobre o cronograma e definir o intervalo de varredura a cada 2 h por 24h.
3. cérebro Tumor células-tronco Neurosphere invasão ensaio
- Células de semente 200.000 em 8 mL de mídia completa num balão T25 1-2 semanas antes de planejar realizar um ensaio de invasão.
Nota: O timing do chapeamento para realizar o ensaio dependerá da taxa de proliferação da cultura BTSC usada.- Para células pré-tratados, adicione o composto de interesse para o balão na concentração desejada para o curso de tempo predeterminado antes que o neurospheres está prontos para ser revestido para invasão.
- Espere até o tamanho de neurosphere média é de aproximadamente 150-200 μm; Normalmente, isso leva 7-14 d, dependendo da cultura BTSC sendo usada.
Nota: É comum observar uma distribuição de tamanhos de esfera no frasco. - Dica e delicadamente misturar o frasco com uma pipeta e mover 500 μL do BTSC neurospheres para um tubo cônico de 1,5 mL para cada condição de tratamento; Isto será usado para a placa de três poços de replicar.
Nota: Passos 3.3.1 - 3.3.2 são opcional mas recomendado para o primeiro experimento de invasão sobre uma nova cultura BTSC.- Para determinar a densidade de neurospheres que vai acabar no poço, prepare um tubo de 1,5 mL como na etapa 3.3. Delicadamente misture o neurospheres e mover 100 μL em uma placa de 96 poços separada e permitir que o neurospheres resolver por gravidade por 5 min.
- Verifique se o número de neurospheres sob o microscópio para garantir neurospheres múltiplos está na região do poço que vai ser fotografada sem a superlotação.
Nota: Neurospheres invasoras requerem espaço suficiente para triplicar de diâmetro sem interagir com os vizinhos neurospheres. O número de neurospheres por alvéolo pode ser ajustado contando o número de neurospheres por bem e adicionando mais ou menos neurospheres do recipiente T25 ao tubo cónico de 1,5 mL em passo 3.3.
- Colocar o tubo cónico de 1,5 mL com as células da etapa 3.3 no gelo e execute as etapas 3.5-3.7 no gelo.
- Deixe o neurospheres resolver por gravidade para o fundo do tubo cónico 1,5 mL por 5 min e prechill uma placa de 96 poços etiquetada no gelo.
- Ressuspender o neurospheres em proteínas da matriz extracelular.
- Preparar 500 μL de uma 0,4 mg/mL tipo I solução de colágeno no gelo para cada condição de tratamento: Adicionar 459 μL de mídia (sem fatores de crescimento), 40 μL da solução-mãe 5mg/mL colagénio e 0,92 μL de estéril 1N NaOH (tabela 1).
Nota: 500 μL da solução de colágeno é necessário por condição de tratamento: 100 μL de cada um dos três poços replicar e 200 μL de excesso. Tratamentos com drogas precisam ser adicionados aqui na concentração final desejada, subtraída do componente da solução de mídia. Este protocolo descreve o uso do colágeno tipo I como a proteína da matriz extracelular; no entanto, qualquer proteína de matriz extracelular pode ser testada. Além disso, para BTSC culturas que têm taxas mais lentas de invasão, fatores de crescimento ou FBS podem ser completadas na mídia para aumentar a taxa de invasão. - Após os neurospheres da etapa 3.5 se instalaram, Aspire tanto da mídia quanto possível, sem perder a pelota de neurosphere que se estabeleceu na parte inferior. Resuspenda suavemente o neurospheres em 500 µ l da solução de colágeno preparada na etapa 3.6.1.
- Preparar 500 μL de uma 0,4 mg/mL tipo I solução de colágeno no gelo para cada condição de tratamento: Adicionar 459 μL de mídia (sem fatores de crescimento), 40 μL da solução-mãe 5mg/mL colagénio e 0,92 μL de estéril 1N NaOH (tabela 1).
- Adicione 100 μL de mistura de colágeno e neurosphere três replicar poços da placa de 96 poços no gelo. Permitir que o neurospheres resolver no gelo por 5 min.
- Transferi a placa de 96 poços para uma incubadora de 37 ° C por 5 min permitir a polimerização do colágeno.
- Imediatamente, prepare-se para a placa de 96 poços de imagem.
- Coloque a placa de 96 poços na bandeja de um sistema de imageamento de viver-pilha ou no palco de um microscópio para adquirir uma imagem como uma referência para o tamanho de neurosphere no momento do chapeamento, antes que a invasão começa.
- Adquirir imagens de cada hora, até que a taxa de invasão estacionou; Geralmente, isso ocorre dentro de 24h.
Nota: O intervalo de imagem pode ser modificado dependendo do equipamento utilizado. O imagem tempo decorrido intervalo e total também pode ser modificado para culturas BTSC que têm diferentes taxas de invasão.
- Determine a área de superfície crescente de BTSCs como eles invadem a matriz ao longo do tempo.
Nota: A área da superfície de células aquando do chapeamento, calculado como a média dos três poços replicar, precisa ser semelhante (menos de 20% de variação em todos os poços) entre as condições de tratamento diferenciado para as diferenças na invasão BTSC não sejam fortemente afetados pelo número ou tamanho do neurospheres chapeado.- Para o sistema de análise de viver-pilha, use um objectivo X 10 para a aquisição de imagem e adquirir quatro imagens por alvéolo para replicam de três poços. Para determinar a área de superfície de célula relativa, representada como a confluência de porcentagem do poço, configure uma definição de processamento que destaca especificamente as células sobre o fundo do poço. Usando o software comercial (ver Tabela de materiais), selecione uma nova definição de processamento e definir o ajuste de segmentação para 0,8, a área mínima de 300 μm2e a excentricidade máxima de 0,99. Modifica esta análise se ele não distinguir com precisão as células do fundo.
Nota: Se utilizar outros métodos para invasão de neurosphere de imagem ao longo do tempo, é aconselhável obter múltiplos campos de visão para os três replicam poços ao longo do tempo. No entanto, não a imagem exato mesmo campo de visão em cada intervalo irá aumentar o erro-padrão dos dados recolhidos. Software de computador pode ser usado para ajudar a medir a área de superfície das células invasoras em cada imagem. - Coletar dados como a célula total área de superfície (relativa ou absoluta) para cada bem em cada ponto do tempo e determinar a média dos três poços replicar. Gráfico da invasão de BTSCs traçando a crescente área de célula ao longo do tempo.
Nota: Coleta de dados utilizando o software comercial (ver Tabela de materiais) pode ser executado através do lançamento da definição de processamento criada na etapa 3.10.1, clicando em métricase, em seguida, no gráfico e exportação, e depois na exportar dados .
- Para o sistema de análise de viver-pilha, use um objectivo X 10 para a aquisição de imagem e adquirir quatro imagens por alvéolo para replicam de três poços. Para determinar a área de superfície de célula relativa, representada como a confluência de porcentagem do poço, configure uma definição de processamento que destaca especificamente as células sobre o fundo do poço. Usando o software comercial (ver Tabela de materiais), selecione uma nova definição de processamento e definir o ajuste de segmentação para 0,8, a área mínima de 300 μm2e a excentricidade máxima de 0,99. Modifica esta análise se ele não distinguir com precisão as células do fundo.
Representative Results
Aqui, descrevemos exemplos de dados que podem ser obtidos usando viver-pilha de imagem ensaios para estudar a migração de BTSC e invasão. BTSCs são banhados como células únicas e podem ser crescidas como neurospheres flutuantes (Figura 1). Nós mostramos que o BTSCs podem ser dissociados e banhado em poços da inserção da membrana em um prato de migração de quimiotaxia que é revestido com uma camada fina do tipo eu colágeno (Figura 2A). BTSCs individuais são uniformemente dispersos no topo da inserção da membrana no início do ensaio. Ao longo de um período de 24-72 h, células aderem à membrana, movem ao longo da superfície de colágeno-revestido e migram através de um dos 96 poros pequenos ao lado da membrana, em direção a um quimiotático no reservatório inferior, bem. Depois de destacar as células na parte superior da membrana em amarelo, os poros em azul e as células na parte inferior da membrana em vermelho, as células podem ser vistas entrando em poros na parte superior (célula amarela se aproximando um poro azul) e saída do poro na parte inferior (saída de glóbulos vermelhos ing do poro azul) (Figura 3). Importante, as células podem ser tratados com drogas e chapeado no mesmo prato quimiotaxia migração como células de controle veículo-tratada para estudar o efeito de intervenções terapêuticas na migração BTSC (Figura 2B). A placa de migração quimiotaxia permite a geração de imagens de células na parte superior e na parte inferior da inserção da membrana. Portanto, a quantificação da migração celular ao longo do tempo é possível através da contagem das células que migraram para o lado inferior da membrana (Figura 2).
Descobrimos que se BTSCs não são totalmente dissociados, então as células não migrar através dos poros e permanecem como pequenas neurospheres (Figura 4A). É também importante para o prato não mais do que 2.500 BTSCs/bem como este resulta em aglutinação de célula em vez de migração para o lado inferior da membrana (Figura 4B). Por último, é essencial para evitar fazer bolhas na membrana inserir poços quando chapeamento células e quando colocar a membrana inserir no reservatório inferior, já que esta impede a imagem exata e quantificação (Figura 4).
Em seguida, mostramos que invasão BTSC, de neurospheres para a matriz circundante, pode ser fotografada e quantificado ao longo do tempo em um formato de placa de 96 poços (Figura 5A). Invasão pode ser medido através da quantificação da área de superfície das células, como eles invadem a matriz ao longo do tempo. Usando o software de análise de imagem, uma definição de processamento foi aplicada que sobrepõe uma máscara para a célula superfície, que permite a quantificação automática ao longo do tempo (Figura 5B). Vídeos de lapso de tempo das invasões BTSC também podem ser criados, para facilmente observar todo o processo de invasão BTSC (Figura 6). Além disso, a microscopia fluorescente pode ser usado para imagem BTSCs que expressam proteínas fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP) ou da proteína fluorescente vermelha (RFP). Aqui, nós criamos um vídeo lapso de tempo de BTSCs, expressando uma forma citosólica de GFP para ajudar a controlar o BTSCs individuais como eles invadem um matriz de tipo membrana basal (Figura 7). Este ensaio de invasão neurosphere BTSC também permite tratamentos com drogas ser adicionado em poços replicar diretamente, avaliar seus efeitos sobre a invasão de BTSC de neurospheres em uma matriz (Figura 8A). A quantificação de vários neurospheres em replicar poços pode ser calculada e graficamente ao longo do tempo para avaliar o efeito de drogas em várias concentrações (Figura 8B).
Para aderir ao protocolo descrito acima pode provocar uma incapacidade de obter dados confiáveis e precisos. Incorporação de BTSC neurospheres que são grandes demais, com um diâmetro superior a 200 µm, leva a um plano de foco que é demasiado grande para quantificar com precisão todas as esferas em um campo de visão (Figura 8). Da mesma forma, não conseguir manter a matriz a 4 ° C durante a incorporação o neurospheres também pode levar a domínios que não estão no mesmo plano de foco e uma matriz extracelular que solidificou não uniformemente, o que impede a coleta de dados precisos (Figura 8 ).
Figura 1: cultivo de BTSCs. Estes painéis são um exemplo representativo de BTSCs crescido de células únicas para neurospheres durante um período de 14-d na cultura. Os neurospheres mostrados aqui no dia 14 são de um tamanho adequado para a passagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem latente da viver-pilha de uma migração de BTSC. (A) este é um exemplo de uma placa de migração quimiotaxia de 96 poços revestidos com uma camada fina do tipo colágeno antes de realizar o ensaio de migração com BTSCs. As imagens mostram i) um prato com três peças (tampa, inserção de membrana e reservatório) colocados juntos, ii) todas as três partes separadas, iii) uma imagem de close-up da vista superior da inserção da membrana, iv) uma imagem de close-up da vista inferior da inserção da membrana e v) uma imagem de close-up do reservatório inferior. (B) Estas são imagens representativas de uma migração de BTSC no início do experimento (0 h) e a 24 h. O foco da imagem é no topo da inserção da membrana, onde as células foram originalmente banhadas. Células que migraram para a parte inferior da placa de migração a quimiotaxia são destacadas em vermelho. Às 0h, algumas células migraram para o lado inferior da membrana. Após 24 h, o número de células migradas aumentou dramaticamente. A comparação das imagens em 24h para células tratadas com uma veículo vs drogas X demonstra que o tratamento medicamentoso diminui a migração BTSC. A escala barras representam 600 µm. (C), este painel mostra a quantificação de uma migração de BTSC após pré-tratamento com um veículo ou drogas X. O gráfico mostra que o tratamento medicamentoso tem um forte efeito sobre a migração de BTSCs. Os pontos de dados são a média dos três poços replicar técnicas, e as barras de erro representam o desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Animado Figura 3: vídeo Time-Lapse de BTSC migração. Este vídeo mostra a migração de BTSCs usando um tipo eu colágeno-revestido placa de migração de quimiotaxia. Células na parte superior da inserção da membrana são destacadas em amarelo, as células que migraram para a parte inferior da inserção da membrana são destacadas em vermelho, e os poros na membrana são destacados em azul. O plano de foco é definido como células de imagem no lado inferior da membrana. O vídeo foi criado usando o lapso de tempo imagens tomadas a cada hora para h 51 e compilados em 4 frames por segundo. Barra de escala representa 200 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Figura 4: exemplos de erros na confi guração do ensaio de migração. (A), este painel mostra um exemplo de BTSCs que não foram totalmente dissociado antes chapeamento na inserção da membrana superior da placa de migração de quimiotaxia. Devido ao grande tamanho das esferas e o pequeno tamanho dos poros da membrana, as células são incapazes de migrar para o reservatório inferior. (B) este painel mostra um exemplo de um ensaio de migração onde muitas células foram banhadas. A aglutinação das células interfere com a migração celular e prejudica a quantificação. (C) este painel mostra um exemplo de formação de bolhas na inserção da membrana onde BTSCs foram banhados. Bolhas de resultam em má qualidade de imagem e evitar uma quantificação exacta da migração. As barras de escala representam 600 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ensaio de invasão BTSC neurosphere. Estes painéis mostram um exemplo de BTSCs invadindo um neurosphere em um tipo de 0,4 mg/mL eu matriz de colagénio durante um período de 6 h. Aqui, imagens de contraste de fase (A) em cada ponto de tempo é mostrado (B) com a máscara quantitativa representativa sobreposta, conforme descrito em detalhes na etapa do protocolo 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: BTSC neurosphere invasão lapso de tempo vídeo no colágeno tipo I. Este vídeo mostra uma invasão de BTSCs de um neurosphere em um 0,4 mg/mL tipo I matriz de colagénio (também mostrado como ainda imagens na Figura 5A). As imagens foram adquiridas utilizando um objectivo X 10 cada hora para 12h e são compiladas em 4 frames por segundo. Barra de escala representa 300 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Figura 7: BTSC neurosphere invasão lapso de tempo vídeo numa matriz de membrana basal-like. Este vídeo mostra uma invasão de BTSCs, que GFP citosólica expressa, de um neurosphere em uma matriz de membrana basal-like. As imagens foram adquiridas utilizando um objectivo de X 4 cada 30 min para 48 h e foram compiladas em 8 frames por segundo. Barra de escala representa 800 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Figura 8: ensaio de invasão neurosphere BTSC com tratamento. (A) BTSC neurospheres foram incorporados numa matriz de membrana basal, como preparado com veículo ou as concentrações indicadas de drogas X. imagens foram adquiridas a cada hora; mostrado aqui são imagens tiradas no momento do chapeamento e após 16 h. A barra de escala representa 200 µm. (B) uma invasão de BTSCs de neurospheres ao circundante Matrix foi quantificada a cada hora, conforme descrito na etapa do protocolo 3. Os pontos de dados são a média dos três poços replicar técnicas, e as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). (C), este painel mostra BTSC neurospheres incorporado no tipo eu colágeno com uma esfera que é demasiado grande para quantificação. A barra de escala representa 300 µm. (D) este painel mostra BTSC neurospheres incorporado no tipo de colágeno que não totalmente definido. A barra de escala representa 300 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Preparação de solução de colágeno | |
| Estoque [colágeno] (mg/ml) | 5 |
| Final [colágeno] (mg/ml) | 0.4 |
| Número de poços necessários: | 5 |
| Volume total (μl) | 500 |
| Volume de estoque colágeno (μl) | 40 |
| Volume de NaOH 1N (μl) | 0,92 |
| Volume de mídia (μl) | 459 |
Tabela 1: preparação da 0,4 mg/mL tipo I solução colágeno. Listados estão o conhecido começando e concentrações finais desejadas, do tipo solução de colágeno. Os volumes listados são suficientes para placa neurospheres em três poços replicar, mais dois por excesso e podem incluir uma condição de tratamento único, conforme descrito em detalhes na etapa do protocolo 3.
Discussion
Dado que as células cancerosas proliferam ativamente, isto coloca um potencial desafio técnico para o estudo da migração celular. Para o ensaio de migração descrito aqui, BTSCs são banhados sem fatores de crescimento, que limita a proliferação e o gradiente quimiotático da placa quimiotaxia não equilibrar totalmente mais de 72 horas. Além disso, como as células estão sendo monitoradas usando a imagem latente da viver-pilha ao longo do tempo, as células podem ser monitoradas visualmente para garantir a divisão celular generalizada não está ocorrendo. Para o sucesso do ensaio de migração, é importante dissociar o neurospheres completamente para células únicas e contar com precisão o número de células antes de chapeamento. Chapeamento de esferas ou metalização de muitas células, o que resulta na aglutinação, pode impedir que as células migrando através dos pequenos poros (Figura 4A e 4B). Também é importante evitar a criação de bolhas quando chapear as pilhas na placa de migração de quimiotaxia ou apoiando a inserção da membrana sobre o reservatório inferior. Bolhas podem alterar o plano de foco e evitar a quantificação exata (Figura 4). O prato inteiro precisa ser revestido com uma fina camada de colágeno, porque isso dá células uma superfície para navegar para os poros na placa, como este ensaio requer células de aderir a e em seguida migram através de uma superfície biologicamente relevante para o quimiotático.
O protocolo de migração BTSC aqui descrito permite a avaliação cinética da migração de células individuais, que requerem menos células para testar as condições de tratamento diferente quando comparado aos protocolos existentes. Isto é importante para culturas que crescem muito lentamente, como pode ser difícil coletar um grande número de células para a experimentação. A densidade de poros de baixo da placa de migração quimiotaxia permite um equilíbrio mais lento do gradiente quimiotático, superior a 72 h e mais efetivamente, imita o processo biológico de migração quimiotáctica durante um longo período de tempo. O protocolo foi otimizado para ter uma camada muito fina de revestimento de colágeno na placa quimiotaxia de migração para garantir que a migração de medidas de ensaio e não invasão. Também facilita a imagem e a quantificação de células únicas como aderem à matriz de colagénio revestimento inserção da membrana. No entanto, uma limitação da técnica é que a quantificação da migração através de vários poços ao longo do tempo é extremamente simplificada e acelerada usando software comercial (ver Tabela de materiais). Uma vantagem notável do ensaio de migração conforme descrito aqui é a ampla capacidade de adaptação do protocolo para outros tipos de células. Será especialmente útil para quantificar a migração quimiotático de linha celular que são de qualquer crescimento lento, difícil de aderir ou migrar lentamente.
Para garantir o sucesso do ensaio invasão BTSC, é necessário recolher neurospheres antes que se tornem maiores do que 200 µm. pontuações maiores esferas têm um plano de foco que é demasiado grande para consistentemente imagem e quantificar (Figura 5). Além disso, neurospheres pode começar a amontoar e agregar com outros neurospheres. Isso afeta a aquisição de dados precisos e consistentes. Além disso, é essencial que as neurospheres são permitidos para resolver sobre o fundo do poço, enquanto o colágeno é ainda no gelo, para permitir que o neurospheres ser fotografada em um único plano de foco (Figura 5). Da mesma forma, é importante permitir que o colágeno definir totalmente sem mover a placa, pois isso pode interromper a formação de uma matriz do mesmo, que pode afetar negativamente a qualidade da imagem (Figura 5). Para o ensaio de invasão BTSC descrito aqui, uma das principais vantagens é que BTSCs cultivadas como neurospheres podem ser avaliadas para invasão diretamente, sem a necessidade de ser cultivado aderentemente. Além disso, BTSC neurospheres pode ser incorporado em qualquer matriz extracelular, ou usando os componentes individuais da matriz extracelular de um tecido específico, ou usando uma mistura comercialmente disponível da membrana basal. Especificando a matriz extracelular pode ajudar a identificar ou testar mecanismos específicos de invasão. Por exemplo, com este protocolo, é possível avaliar o efeito de direcionamento membros individuais da família metallopeptidase de genes, que são sabidos para degradar componentes específicos matriz matriz. Como alternativa, embora este protocolo é específico para BTSC neurospheres, quaisquer células cultivadas como esferas podem ser usadas em uma forma similar. Exemplos incluem células de câncer de mama cultivadas como mammospheres ou câncer colorretal primário de células cultivadas como tumorspheres; no entanto, isso limita a técnica para tipos de célula que pode crescer, como esferas em uma cultura. Outras vantagens dos ensaios tanto a migração e invasão são que eles são fáceis de configurar, eles trabalham em um formato de 96 poços, e os dados são quantificáveis ao longo do tempo.
Em geral, a fim de prevenir a recorrência de GBM pós-tratamento, é essencial desenvolver metodologias que facilitam a investigação de BTSC migração e invasão. O protocolo de migração descrito aqui oferece muitas vantagens sobre os ensaios de migração previamente estabelecidos, especialmente para o estudo da GBM BTSCs. Este protocolo melhorado migração envolve dissociando BTSCs cultivadas sob condições de neurosphere e chapeamento de células individuais em um prato de migração quimiotaxia de colágeno-revestido de 96 poços. Usando um sistema de imageamento de viver-pilha, a migração de BTSCs pode ser monitorizada e quantificada ao longo do tempo. O ensaio de invasão aqui descrito permite o monitoramento de invasões BTSC de neurospheres em uma matriz. Este ensaio envolve a incorporação de neurospheres em uma matriz de colagénio, ou outro rico em proteínas da matriz extracelular, em uma placa de 96 poços. Imagem latente da placa com um sistema de imageamento de lapso de tempo de viver-pilha permite a análise de invasões de BTSC sob condições de tratamento diferentes ao longo do tempo. Estes ensaios, portanto, fornecem uma ferramenta valiosa para cientistas na esperança de compreender melhor os mecanismos subjacentes BTSC migração e invasão.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Rozina Hassam e Orsolya Cseh pelo apoio técnico. Este projecto de investigação foi apoiado em parte por subsídios da Fundação de Canadá para a inovação (para H. Artee Luchman e Samuel Weiss) e a redes de células-tronco do Canadá (também para H. Artee Luchman e Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
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