Summary
여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.
Abstract
세포종 (GBM) 가난 하 게 현재 사용할 수 있는 치료 옵션으로 제어 되는 적극적인 뇌종양 이다. GBMs의 주요 특징은 급속 한 확산 등 정상적인 두뇌에 퍼지는 침략. 되풀이 라디오 및 화학 내성 뇌 종양 줄기 세포 (BTSCs) 초기 암 질량에서 침략 하 고, 따라서, 외과 절제술을 피하기 위해 그의 존재에서 유래 생각. 따라서, BTSCs 및 그들의 침략 적 능력 대상 요법이이 질병의 그렇지 않으면 빈약한 예 지를 높일 수 있습니다. 우리 그룹 등 성공적으로 설립 있고 GBM 환자 샘플에서 음성 문화 특징. 이러한 음성 문화 clonogenic 자체-갱신, 다중 계보 차별화 등 면역 결핍 쥐에 종양 개시 근본적인 암 줄기 세포 속성을 보여 줍니다. 개선 하기 위해 현재 치료 접근에 GBM를 위한, 더 나은 음성 마이그레이션 및 침략의 메커니즘의 이해는 필요 합니다. GBM, 마이그레이션 및 침략의 연구 부분, 완전히 neurospheres로 성장 하는 BTSCs의 생체 외에서 의 성장 특성에 대 한 계정을 하지 않습니다 기존 기술의 제한으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리 BTSCs의 마이그레이션 및 침략 속성을 공부를 신속 하 고 양적 라이브 셀 이미징 분석을 설명 합니다. 설명 하는 첫 번째 방법을 측정 chemoattractant 그라데이션으로 마이그레이션 하는 음성 마이그레이션 분석 결과 이다. 설명 하는 두 번째 방법을 음성 침공 분석 결과 이미지 이며 행렬에 neurospheres에서 셀룰러 침략 단정. 여기서 설명 하는 분석 실험 음성 마이그레이션 및 내 습 시간이 지남에 조건 하에서 다른 치료의 정량화에 사용 됩니다.
Introduction
세포종 (GBM) 뇌종양의 가장 일반적이 고 적극적인 형태는 현재 치료에도 불구 하 고 방사선 다음 외과 절제술을 포함 그리고, 화학 요법, 환자의 평균 생존은 불과 15 개월1. GBM은 침략, 높은 약물 내성, 그리고 궁극적으로, 필요로 하는 불 치의 질병 연구를 계속 했다 자사의 고유한 생물학에 소설 치료도 식별. GBM 환자의 높은 사망 율 주로 인접 한 정상 뇌 조직 및 치료2,3 다음 질환의 재발에 이르게 혈관에 따라 마이그레이션에 광범위 한 세포 침입에 의해 발생 . 자전거 및 치료 저항 하는, 느린 뇌 종양 줄기 세포 (BTSCs), 나 셀의 하위 집합 질병 재발으로 이어질 가설 되어 있다. GBM BTSCs clonogenic 자체-갱신, multipotency, 및 잠재적인4,5,종양을 시작6의 속성을 표시합니다. BTSCs는 또한 그들의 부모 GBM 종양7,8,,910의 유전, 분자, 및 phenotypic이 유지. 이러한 속성은 GBM의 연구와 탐험 비 발한 치료 전략에 대 한 매우 유용한 모델 시스템 BTSCs를 확인 합니다. Vivo에서이 같은 줄기 세포는 종양의 형성, 성장, 및 침략 신생아 쥐11 의 두뇌로 이식 때와 비 뚱뚱한 당뇨병/심한 결합 (끄 덕 임/SCID) 면역 결핍 쥐4. 반복적으로 침략 적인 종양에서 vivo에서 강하게 그들의 원래 종양 세포 및 조직학 특징을 정리 하는 형성 하는 BTSCs의 기능 세포 종양을 시작12로 그들의 역할을 지원 합니다.
소설 치료 접근 대상 BTSCs 개발 되 고 있다 고 GBM 환자에 대 한 장기 결과 개선 하는 데 도움이. 현재, 거기에 치료 저항 및 재발 관련 된 세포 이동과 내 습 프로세스의 이해 제한 됩니다. 마이그레이션 및 내 습은 뚜렷한 현상; 마이그레이션 셀의 감독된 운동 기본 프로세스 이며 침략은 방 벽의 물리적 파괴에도 필요 합니다 반면 골격, 접착 분자, 및 초점 접점의 조립/분해의 개편을 포함 세포 외 기질13등. 셀 이동과 침략의 널리 허용된 방법론 Boyden 챔버 시험14,15입니다. 이 기술에 대 한 더블 챔버는 chemoattractant 보충 아래쪽 챔버에 미디어와 미디어 채워집니다. Chemotaxis는 일반적인 chemoattractant로 특정 성장 인자, cytokines, 또는 소 태아 혈 청을 사용 하 여 발생 합니다. chemoattractant의 그라데이션에 따라 세포 다공성 멤브레인 통해 마이그레이션할. 끝점에서 마이그레이션된 셀 시각 및 cytological 또는 형광 성 염료로 염색 하 여 막의 아래쪽에 정량 될 수 있습니다. Boyden 마이그레이션 분석 결과 다공성 코팅 침공 분석 결과를 수정할 수 있습니다 필터링 유형 같은 기질 구성 요소와 나 콜라겐 또는 지하실 멤브레인와 같은 매트릭스. 침략 적 세포 매트릭스를 저하, 통해 다공성 필터의 아래쪽에 이동한 마이그레이션 분석 결과를 비슷한 방식으로 측정할 수 있습니다. 다른 일반적으로 사용 되는 마이그레이션 분석 스크래치 상처를 포함 하 고 셀 제외 영역 분석 실험13. 스크래치 상처 분석 결과 세포 단층에 격차를 긁 고 스크래치 닫힐 때까지 정기적으로 이미징 하 여 상처의 가장자리에서 셀의 마이그레이션을 관찰 하 여 수행 됩니다. 셀 제외 분석 결과, 물리적 장벽 시드 셀의 이전 셀 자유 영역을 만드는 데 사용 됩니다. 방 벽은 한 번 제거 셀 confluent 이며 셀 자유 영역에는 셀의 마이그레이션 몇 정기적으로16군데.
이 이전 분석 공부 마이그레이션 또는 부착 하 고 동종 세포 인구 하지만 포즈 상당한 단점의 침공 GBM BTSCs 또는 기타 다른 유형의 암 세포 인구를 공부를 할 때 자주 사용 되는 설립. Boyden 챔버 분석 결과 끝점 측정 대 세포 이동의 운동 평가 생성할 수 있습니다. 시간이 지남에 관찰은 음성 이동의 측정에 대 한 높은 관련성의 주어진 다른 문화에서 셀 종종 서로 다른 속도로 이동. 따라서, 조건 및 타이밍 분석 결과의 각 문화 유형에 최적화 해야 하며 많은 시간과 노동 적절 한 샘플링 및 정량화에 대 한. 경우에 BTSCs laminin 코팅 접시에 단층 조건 하에서 교양, 우리 BTSCs 오픈 공간으로 움직임을 저항 하 고에 남아 선호 되도록 관찰해 서 분석 실험 음성 문화에 적합 하지 않습니다 스크래치 및 셀 제외 닫기 다른 셀에 근접입니다. 또한, 이러한 설립 마이그레이션 분석 시각화 및 실험을 통해 개별 셀의 모니터링에 대 한 허용 하지 않습니다. 와 같은 음성 문화 대 한 Boyden 챔버, 스크래치, 그리고 셀 제외 영역 분석의 BTSCs. 추가 불리는 시간이 지남에 개별 셀 모니터링 하는 것은 다른 유형의 세포 인구에 있는 이동의 평가 대 한 귀중 한 그들은 상대적으로 필요 높은 셀 번호, 설정, 수 수 하 고도 급속 하 게 equilibrate 또는 chemoattractant 그라데이션. 따라서, 이러한 분석 이상 희귀 또는 느린 성장 세포 인구 또는 약물 검사에 대 한 사용 되지 않습니다. 또한, 이러한 분석은 측정 neurosphere 조건 하에서 성장 하는 BTSCs에 대 한 특히 중요 한 3 차원 (3D) 형식, 침략 적합 하지.
여기, 우리가 구체적으로 관찰과 개별 BTSCs, 및 neurospheres로 경작 하는 GBM BTSCs의 침공에 대 한 마이그레이션의 정량화에 대 한 수정 분석 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 혈 세포 마이그레이션13측정 하 라이브 셀 시간 경과 이미징 및 chemotaxis 마이그레이션 플레이트를 사용 하 여 Boyden 챔버 분석 결과의 적응을 설명 합니다. 다 잘 형태로 라이브 셀 이미징 시각화와 여러 치료 조건 하에서 세포 이동의 정량화 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 두 번째 분석 결과 회전 타원 체 침공 분석 결과13,17, BTSCs의 침략 적 속성 neurosphere 조건 하에서 배양 하 고 다양 한 치료에서 3 차원 기질에 포함 측정 하 조건입니다. 전반적으로,이 분석 실험은 이기종 음성 문화의 속성과 침략 철새 공부에 대 한 앞에서 설명한 방법론 보다 훨씬 더 호환 됩니다. 그들은 또한 모두 마이그레이션 및 침략, 질병 재발과 치 사 율에 크게 공헌 하는 새로운 치료 전략의 수사를 위한 더 나은 기회를 제공 합니다.
Protocol
1. 뇌 종양 줄기 세포를 배양 이전 인간의 세포종 표본에서 파생 된
참고: 음성 문화 이전 인간의 GBM 환자 샘플6,7,8,,910에서 설립 되었다.
- 70% 에탄올, 얼음의 마지막은 해 동 때까지 그냥 37 ° C에 물 욕조 안에 배치를 포함 하는 비 커에서 저온 보존 된 BTSCs의 병 동 해 동된 셀 15 mL 원뿔 튜브에서 미디어의 10 mL에 희석 하 고 150 상대 원심력 (RCF) 7 분에 세포를 원심.
참고: 이러한 프로토콜을 통해 완전 한 미디어는 문화 (이전 켈리 그 외 여러분에 의해 설명 되는) BTSCs 사용 하는 표준 미디어 6, 현재 성장 요인으로 일반적으로. 성장 인자 없이 미디어 기본 미디어 어떤 성장 인자를 보충 하지 않고 모든 구성 요소를 나타냅니다. - 미디어를 발음 하 고 완전 한 미디어, 8 mL에 셀 resuspend T25 플라스 크에 세포와 미디어를 전송.
- 비 점착 조건 하에서 경작의 1 주 후 플라스 크를 매일 모니터링 하 고 필요에 따라, 미디어 고갈 하기 시작 또는 오렌지-노란색 색상 변화에 의해 표시 된 산 성 되기 시작 하는 경우 1-2 mL의 완전 한 미디어와 내용을 보충. 통로 세포는 neurospheres 약 250 μ m, 10-14 d (그림 1) 사이 일반적으로의 직경을 도달할 때.
참고: 다른 음성 문화의 두 배로 시간 넓게 변화 한다. 눈 마이크로미터를 사용 하 여 Neurosphere 크기를 측정할 수 있습니다. - BTSCs 통행에 모든 neurospheres를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송 하 고 150 RCF에 7 분 동안 튜브를 원심 플라스 크의 표면 아래로 미디어 pipetting으로 미디어와 neurospheres를 수집 합니다.
참고: 플라스 크는 모든 neurospheres가 수집 되도록 현미경으로 확인할 수 있습니다. 인산 염의 5 mL을 추가 세척 식 염 수 (PBS) 버퍼링 또는 미디어 필요에 따라 모든 나머지 neurospheres 수집을 수행할 수 있습니다. - 단일 셀으로 음성 neurospheres 해리, 미디어를 발음 하 고 미리 데워 진된 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 7 분에 대 한 37 ° C에는 p1, 000 micropipette 800 μ에서 설정 음성 정지 40 x Triturate를 품 어.
참고: 셀 수 있는 알을 품 더 이상 37 ° C에는 neurospheres 해리 하지 않는 경우. - 해리 BTSCs를 (와 항생제 페니실린 스) PBS의 5 mL을 추가 하 고 7 분 150 RCF에 세포를 원심.
- 발음은 상쾌한 고 셀 펠 릿의 크기에 따라 완전 한 미디어의 1-4 mL에는 BTSCs를 resuspend.
참고: 셀 서 스 펜 션 추가 경우 정확한 셀 계산에 대 한 정확한 검출 한계 농도 희석 해야 합니다. - 죽은 세포를 제외 하는 염료를 사용 하 여, trypan 파랑, 같은 실행 가능한 세포의 수를 계산 하 고 플라스 크 또는 관심의 접시에는 BTSCs 씨-T25 플라스 크에 완전 한 미디어의 8 mL에 일반적으로, 200000-300000 셀.
2. 뇌 종양 줄기 세포 마이그레이션 분석 결과
- 씨앗 200, 000의 완전 한 미디어 마이그레이션 분석 결과 수행을 계획 하기 전에 1-2 주 8 ml에서 T25 플라스 크에 세포.
참고: 도금 및 분석 결과 수행 사이의 시간 사용 하는 음성 문화권의 성장 속도 따라 달라 집니다.- 마이그레이션에 약물 치료의 효과 테스트 하려면 셀에 포함 된 미디어의 별도 우물에 직접 차량 또는 약물의 해당 볼륨을 추가 하 여 적절 한 차량, DMSO, 등 관심의 약 셀을 pretreat.
- 콜라겐의 얇은 층으로 코팅 하 여 chemotaxis 마이그레이션 플레이트 (그림 2A)를 준비 합니다.
- 콜라겐 코팅 될 필요가 있을 것 이다 chemotaxis 96 잘 접시의 우물의 수를 계산 합니다. 각 조건에 대 한 적어도 3 개의 복제 우물을 포함 합니다.
- 주식의 희석 5 mg/mL 0.14% 문화 학년 물에 희석 하는 순수한 초 산 나 콜라겐 0.2 mg/mL을 입력 합니다.
- 0.2 mg/mL 막 삽입 우물과 사용 되는 아래쪽 저수지 우물에 콜라겐의 플라스틱
참고: 접시의 아래쪽 저수지 필요 225 µ L 고 막 삽입 우물 적절 한 코팅에 대 한 콜라겐의 75 µ L을 요구. - 장소 1 h. 위해 37 ° C에서 인큐베이터에서 마이그레이션 접시 콜라겐 코팅 긁힘 없이 우물에서 콜라겐 솔루션 발음.
- 2 웰 스 워시 살 균 1 x PBS와 x. 접시는 지금 당장 사용 되 고는, PBS 발음 하 고 4 ° C에서 최대 2 주 동안 그것을 저장 합니다. 사용 전에 chemotaxis 마이그레이션 접시 실내 온도를 따뜻하게.
- Chemotaxis 마이그레이션 판의 아래쪽 저수지를 준비 합니다.
- 10% 보충 (성장 인자) 없이 미디어의 225 µ L 플라스틱 FBS chemotaxis 마이그레이션 접시의 아래쪽 저수지 우물에 chemoattractant로.
- 부드럽게 거품을 만들지 않도록 각도에서 아래쪽 저수지로 막 삽입을 놓습니다.
- 플레이트 chemotaxis 마이그레이션 접시의 세포 막으로 삽입.
- Resuspend는 50, 000 셀/mL의 셀 밀도에서 미디어 (성장 인자) 없이 BTSCs를 해리 했다. 다른 약물 치료 동안 마이그레이션 평가 하는 경우 미디어에 약을 추가 합니다. 또는, 도금 하는 경우 최종 약물 농도 유지 하면서 미리 치료 세포 및 제어 셀의 동등한 수 씨.
- 원하는 치료 조건에서 마이그레이션 플레이트의 각 음에 2.4.1 단계에서 BTSCs의 50 µ L 플레이트.
- 이미지 chemotaxis 마이그레이션입니다.
- 라이브 셀 이미징 시스템으로 chemotaxis 마이그레이션 접시를 놓고 설정 접시의 미세한 이미지 자동된 이미징 소프트웨어 최대 72 h. 사용 하 여 상용 소프트웨어에 대 한 모든 1-2 h ( 재료의 표참조)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 합니다 타임 라인 및 설정 24 h에 대 한 모든 2 h 스캔 간격
참고: 시간 간격 및 총 경과 시간 사용; 음성 문화 사이 달라 집니다. 개별 음성 문화 경험을 얻고 있다 때까지 72 h에 대 한 2 시간 간격으로 시작 합니다. 자동된 이미징 시스템을 사용할 수 없는 경우 다음 이미지 보기의 동일한 필드의 취득 될 수 있다 수동으로 현미경 그리고 카메라 이미징 소프트웨어에 연결 된. - 이미지 수집 완료 되 면 전체 실험에 대 한 이미지 고 막 및 마이그레이션 숨 구멍 (그림 2B, 빨간 마스크)의 배경에서 셀을 구분 하는 분석 소프트웨어를 사용 하 여 처리 정의 만들기 . 상용 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 새로운 처리 정의 선택 하 고 BTSCs에 대 한 처리 정의 설정을 한 성장 임계값 크기의 85, 조정의 52의 씨앗 임계값 설정 (픽셀)-1와 200 μ m2의 최소 영역 . 이 처리 정의 막의 하단 측면에 적용 됩니다. 그것은 정확 하 게 구분 하지 셀 배경 막에서이 분석을 수정 합니다.
- 만 숨 구멍을 통해 마이그레이션한 셀을 세는 3 개의 복제 웰 스의 각 막의 하단 측면에 셀 표면 영역으로 데이터 수집 합니다. Μ m2 에 셀의 마이그레이션 그래프 (셀의 영역 마이그레이션) (그림 2 C, 그림 3) 시간이 지남에.
참고: 도금 막의 위쪽 표면에서 처음으로 포인트 계산 하는 셀의 상대적인 수는 비슷한 보장 (보다 작은 모든 우물에 걸쳐 20% 변형)을 고르지 도금의 모든 효과 피하기 위해 모든 치료 조건 사이. 데이터 컬렉션을 사용 하 여 상용 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 실행 될 수 있습니다 단계 2.5.2, 통계, 그래프/수출, 그리고 에 데이터 내보내기 다음 클릭에서 만든 처리 정의 시작 하 여 .
- 라이브 셀 이미징 시스템으로 chemotaxis 마이그레이션 접시를 놓고 설정 접시의 미세한 이미지 자동된 이미징 소프트웨어 최대 72 h. 사용 하 여 상용 소프트웨어에 대 한 모든 1-2 h ( 재료의 표참조)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 합니다 타임 라인 및 설정 24 h에 대 한 모든 2 h 스캔 간격
3. 뇌 종양 줄기 세포 Neurosphere 침공 분석 결과
- 8 ml T25 술병 침입 분석을 수행을 계획 하기 전에 1-2 주에에서 완전 한 미디어의 씨앗 200, 000 셀.
참고: 도금에서 타이밍 분석 결과 수행을 사용 하는 음성 문화 확산 속도에 따라 달라 집니다.- 전에 neurospheres 도금 침공에 대 한 준비가 청소용된 셀에 대 한 미리 정해진된 시간 과정에 대 한 원하는 농도에서 플라스 크에 관심의 화합물을 추가 합니다.
- 평균 neurosphere 크기는 약 150-200 μ m; 때까지 기다립니다 일반적으로, 이것은 사용 되는 음성 문화에 따라 7-14 d.
참고: 플라스 크에서 구체 크기의 분포를 관찰 하는 것이 일반적입니다. - 팁 부드럽게 플라스 크는 피 펫 혼합 하 고 각 치료 상태에 대 한 1.5 mL 원뿔 튜브 500 μ 음성 neurospheres의 이동 이 접시 3 복제 우물 사용 될 것입니다.
참고: 단계 3.3.1-3.3.2는 옵션 이지만 새로운 음성 문화에 첫 번째 침공 실험에 대 한 권장 합니다.- 잘 끝날 것입니다 neurospheres의 밀도 확인 하려면 단계 3.3에서 1.5 mL 튜브 준비. 부드럽게 믹스는 neurospheres 별도 96 잘 접시로 100 μ를 이동 하 고 5 분 동안 중력에 의해 정착 neurospheres 허용.
- 그것은 밀 하지 않고는 몇 군데는 잘의 지역에 여러 neurospheres를 위해 현미경 neurospheres의 수는 확인 합니다.
참고: 침입 neurospheres neurospheres 이웃 상호 작용 없이 직경에 트리플 충분 한 공간이 필요 합니다. 잘 당 neurospheres의 수는 잘 당 neurospheres의 수를 세 고 T25 플라스 크에서 단계 3.3에서에서 1.5 mL 원뿔 튜브에 더 또는 더 적은 neurospheres를 추가 하 여 조정할 수 있습니다.
- 얼음에 단계의 3.3 셀과 1.5 mL 원뿔 튜브를 놓고 얼음에 3.5-3.7 단계를 수행 합니다.
- 5 분 동안 1.5 mL 원뿔 튜브의 아래쪽에 중력에 의해 가라앉 고 얼음에 레이블이 96 잘 접시 prechill neurospheres 하자.
- 세포 외 기질 단백질에는 neurospheres를 resuspend.
- 준비 500 μ는 0.4 mg/mL의 타입 콜라겐 솔루션 각 치료 상태에 대 한 얼음에: 추가 (성장 인자) 없이 미디어의 459 μ, 5 mg/mL 콜라겐 재고 솔루션의 40 μ 및 살 균 1N의 0.92 μ NaOH (표 1).
참고: 콜라겐 솔루션의 500 μ는 치료 조건 당 필요: 3 복제 우물과 과잉의 200 μ의 각 100 μ. 약물 치료는 여기 솔루션의 미디어 구성 요소에서 빼고 원하는 최종 농도에 추가 될 필요가 있다. 이 프로토콜의 사용을 설명 합니다 유형 I 교원 질 세포 외 기질 단백질;로 그러나, 어떤 세포 외 기질 단백질을 테스트할 수 있습니다. 또한, 음성에 대 한 침략의 속도를 증가 미디어에서 문화 침략, 성장 인자 또는 FBS의 느린 속도 보완할 수 있습니다. - 3.5 단계에서 neurospheres, 정착 후 하단에 정착 했다 neurosphere 펠 릿을 잃지 않고 가능한 미디어의 발음. 부드럽게 단계 3.6.1에 콜라겐 솔루션의 500 μ에는 neurospheres resuspend.
- 준비 500 μ는 0.4 mg/mL의 타입 콜라겐 솔루션 각 치료 상태에 대 한 얼음에: 추가 (성장 인자) 없이 미디어의 459 μ, 5 mg/mL 콜라겐 재고 솔루션의 40 μ 및 살 균 1N의 0.92 μ NaOH (표 1).
- 얼음에 96 잘 접시의 3 개의 복제 웰 스 콜라겐과 neurosphere 혼합물의 100 μ를 추가 합니다. 5 분 동안 얼음에 정착을 neurospheres를 수 있습니다.
- 콜라겐 합 수 있도록 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 96 잘 접시를 전송.
- 즉시 96 잘 접시 이미지를 준비 합니다.
- 또는 도금, 침공이 시작 되기 전에 당시 neurosphere 크기에 대 한 참조로 이미지를 얻으려고 현미경의 스테이지에서 라이브 셀 이미징 시스템의 트레이에 96 잘 접시를 놓습니다.
- 매 시간 마다의 속도 plateaued 있다; 때까지 이미지를 수집 일반적으로,이 24 시간 이내에 발생합니다.
참고: 이미지 간격 사용 되는 장비에 따라 수정할 수 있습니다. 이미지 간격 및 총 경과 시간 음성 문화 침략의 다른 비율을 위해 또한 수정할 수 있습니다.
- 그들은 시간이 지남에 따라 행렬을 침략으로 BTSCs의 증가 표면 영역을 결정 합니다.
참고: 도금, 3 복제 우물의 평균으로 계산 시 세포의 표면적 해야 비슷한 (보다 작은 모든 우물에 걸쳐 20% 변형) 사이의 음성 침략에 차이 되지 않습니다 보장 하기 위해 다른 치료 조건 강하게 수 또는 도금 neurospheres의 크기에 의해 영향을 받습니다.- 라이브 세포 분석 시스템에 대 한 이미지 수집에 대 한 10 X 목표를 사용 하 고 3 복제 웰 스에 대 한 잘 당 4 개의 이미지를 취득 합니다. 잘의 백분율 합류로 표현 상대 셀 면적 결정 하려면 특히 우물의 배경 위에 셀을 하이라이트 처리 정의를 설정. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 새로운 처리 정의 선택 하 고 최대 0.99 0.8, 최소 300 μ m2, 및 이심률 영역을 세분화 조정 설정. 그것은 정확 하 게 구분 하지 셀 배경에서이 분석을 수정 합니다.
참고: 시간이 지남에 따라 이미지 neurosphere 침공에 다른 방법을 사용 하 여, 그것 것이 좋습니다 3 시간이 지남에 웰 스 복제에 대 한 여러 분야의 보기를. 그러나, 하지 각 간격에 동일한 필드의 보기 영상 수집 데이터의 표준 오차를 증가할 것 이다. 컴퓨터 소프트웨어는 각 이미지에 침입 세포의 표면적을 측정할 수 있도록 사용할 수 있습니다. - 각 시간 지점에서 총 셀 영역 (상대 또는 절대) 모든 잘으로 데이터를 수집 하 고 3 복제 우물의 평균을 결정 합니다. 시간이 지남에 따라 증가 셀 영역을 그려서 BTSCs의 침공을 그래프.
참고: 데이터 수집 상용 소프트웨어를 사용 하 여 (참조 테이블의 자료) 단계 3.10.1, 통계, 다음 그래프/내보내기클릭에서 만든 처리 정의 실행 하 여 실행 될 수 있습니다 및 다음 에서 데이터 내보내기 .
- 라이브 세포 분석 시스템에 대 한 이미지 수집에 대 한 10 X 목표를 사용 하 고 3 복제 웰 스에 대 한 잘 당 4 개의 이미지를 취득 합니다. 잘의 백분율 합류로 표현 상대 셀 면적 결정 하려면 특히 우물의 배경 위에 셀을 하이라이트 처리 정의를 설정. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 새로운 처리 정의 선택 하 고 최대 0.99 0.8, 최소 300 μ m2, 및 이심률 영역을 세분화 조정 설정. 그것은 정확 하 게 구분 하지 셀 배경에서이 분석을 수정 합니다.
Representative Results
여기, 우리는 음성 마이그레이션 침공을 공부 하 고 라이브 셀 이미징 분석 실험을 사용 하 여 얻을 수 있는 데이터의 예를 설명 합니다. BTSCs는 단일 세포로 도금 고 부동성 neurospheres (그림 1)으로 성장 될 수 있다. 우리는 BTSCs 해리 수 및 코팅 종류의 얇은 층으로 나 chemotaxis 마이그레이션 접시에 막 삽입의 우물에서 콜라겐 (그림 2A) 도금을 보여줍니다. 개별 BTSCs는 분석 결과의 시작 부분에 막 삽입 위에 균등 하 게 분산 됩니다. 24-72 h 동안, 세포 막에, 콜라겐 코팅 표면을 따라 이동 및 준수 잘 저수지에서 chemoattractant으로 막의 밑바닥 측에 96 작은 구멍 중 하나를 통해 마이그레이션. 노란색, 파란색, 모 공에 빨간색으로 막의 아래쪽에 셀 막 위에 셀을 강조 표시, 셀 볼 수 있습니다 (노란색 셀 블루 공 접근) 위에 기 공에 입력 하 고 하단 (붉은 세포 출구에 기 공 종료 ing 블루 기 공) (그림 3). 중요 한 것은, 세포는 약물 치료와 음성 마이그레이션 (그림 2B)에 치료 내정간섭의 효과 연구를 차량 처리 제어 셀 같은 chemotaxis 마이그레이션 접시에 도금 될 수 있습니다. Chemotaxis 마이그레이션 접시 위에 고 막 삽입의 하단에 셀의 이미징에 대 한 수 있습니다. 따라서, 시간이 지나면서 세포 이동의 정량화 막 (그림 2C)의 하단 쪽으로 마이그레이션한 셀을 계산 하 여 가능 하다.
우리는 BTSCs 완전 하 게 해리 하지 경우 다음 셀 숨 구멍을 통해 마이그레이션 없고 작은 neurospheres (그림 4A)으로 유지를 발견 했다. 그것은 또한 하지 접시 2500 보다 더 중요 한 BTSCs/잘이 결과 세포 응집 보다는 막 (그림 4B)의 하단 쪽으로 마이그레이션. 마지막으로, 그러면 정확한 이미징 및 정량화 (그림 4C)으로 셀과 아래쪽 저수지에 삽입 막 배치 때 도금 우물 삽입 막에 거품을 만드는 피하기 위해 필수적입니다.
다음으로, 우리 주변 매트릭스로 neurospheres에서 음성 침공 몇 군데 하 고 (그림 5A) 96-잘 플레이트 형식으로 시간이 지남에 따라 측정할 수 있습니다 보여줍니다. 침공 그들은 시간이 지남에 따라 행렬을 침략으로 세포의 표면적을 측정 하 여 측정 될 수 있다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 처리 정의 오버레이 셀에 마스크 표면 영역 (그림 5B) 시간이 지남에 따라 자동 정량화에 대 한 허용 하는 적용 했다. 음성 침략의 시간 경과 비디오도 만들 수 있습니다, 쉽게 음성 침공 (그림 6)의 전체 프로세스를 관찰. 또한, 형광 현미경 이미지 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 빨간색 형광 성 단백질 (RFP) 형광 단백질을 표현 하는 BTSCs 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 그들은 지하실 막 같은 매트릭스 (그림 7) 침략으로 개별 BTSCs 추적 있도록 GFP의 cytosolic 형태를 표현 하는 BTSCs의 시간 경과 비디오를 만들었습니다. 또한이 음성 neurosphere 침공 분석 결과 복제 우물에 추가 될 약물 치료에 대 한 직접 매트릭스 (그림 8A)에 neurospheres에서 음성 침략에 그들의 효과 평가 하기 위해 수 있습니다. 복제 우물에 여러 neurospheres의 부 량 계산 하 고 여러 농도 (그림 8B)에서 약물의 효과 평가 하기 위해 시간이 지남에 그래프로 수 있습니다.
위에서 설명한 프로토콜을 준수 하는 실패는 안정적이 고 정확한 데이터를 얻기 위해 무 능력으로 이어질 수 있습니다. 너무 큰 음성 neurospheres 포함, 200 µ m 보다 큰 직경을 가진 리드 너무 커서 필드의 보기 (그림 8C)에서 모든 분야를 정확 하 게 계량 하는 초점의 비행기. 마찬가지로, 4 ° C에서 매트릭스는 neurospheres를 포함 하는 동안 유지 하기 위해 실패 이어질 수 있습니다 또한 초점과 기질을 균등 하 게, 경화는 정확한 데이터 (그림 8D의 수집 방지의 같은 평면에 있지 않은 분야 ).
그림 1: 경작 BTSCs. 이 패널은 문화에 14-d 동안 neurospheres 단일 셀에서 성장 하는 BTSCs의 대표적인 예입니다. 주 14에서 여기에 표시 된 neurospheres 뿌리고에 대 한 적절 한 크기의 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 음성 이동의 라이브 셀 이미징. (A)이는 96-잘 chemotaxis 마이그레이션 판의 예 코팅 타입의 얇은 층으로 나 BTSCs와 마이그레이션 분석 결과 수행 하기 전에 콜라겐. 이미지 표시 i) 모든 세 접시 (뚜껑, 막 삽입 및 저수지) 부품 배치 ii) 모든 세 부분 분리, 막 삽입, 막 삽입의 하단 보기의 iv)는 클로즈업 이미지의 최고 보기의 클로즈업 이미지 iii)를 함께 그리고 v) 아래쪽 저수지의 클로즈업 이미지. (B) 다음은 음성 이동 실험의 시작 (0 h)과 24 h의 대표 이미지. 이미지 셀 도금 원래 했다 막 삽입 상단입니다. Chemotaxis 마이그레이션 접시 밑면 마이그레이션한 셀은 빨간색으로 강조 표시 됩니다. 0 h에서 몇 가지 세포는 막의 하단 쪽으로 마이그레이션됩니다. 24 시간 후 마이그레이션된 세포의 수는 극적으로 증가 했다. 24 h X 약 대 차량으로 치료 하는 셀에 대 한 이미지의 비교 약물 치료 음성 마이그레이션 감소 하는 방법을 보여 줍니다. 규모 바 대표 600 µ m. (C)이이 패널 차량 또는 마약 X 전처리 다음 음성 이동의 정량화를 보여줍니다. 그래프 약물 치료는 BTSCs의 마이그레이션에 강한 영향을 보여 줍니다. 데이터 포인트는 3 개의 기술 복제 웰 스, 평균 하 고 오차 막대를 나타내는 표준 편차 (SD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
애니메이션 그림 3: 음성 마이그레이션 시간 경과 비디오. 이 비디오에서는 BTSCs의 마이그레이션 유형 나 교원 질 코팅을 사용 하 여 chemotaxis 마이그레이션 접시. 세포 막 삽입 상단 노란색으로 강조 표시 됩니다, 세포 막 삽입의 하단에 마이그레이션한 빨간색으로 강조 표시 됩니다 하 고 막에 있는 숨 구멍 파란색으로 강조 표시 됩니다. 초점의 비행기는 막의 하단 측면에 이미지 셀으로 설정 됩니다. 비디오 51 h에 대 한 모든 시간을 촬영 하 고 초당 4 프레임에서 컴파일 시간 경과 이미지를 사용 하 여 만들었습니다. 눈금 막대가 나타냅니다 200 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 4: 마이그레이션 분석 결과 설정에서 오류의 예. (A)이이 패널 chemotaxis 마이그레이션 판의 최고 막 삽입에 도금 하기 전에 완전 하 게 해리 하지 했다 BTSCs의 예를 보여 줍니다. 분야의 큰 크기 및 막 숨 구멍의 작은 크기, 셀 아래쪽 저수지에 마이그레이션할 수 없습니다. (B)이이 패널 너무 많은 셀 도금 했다 마이그레이션 분석 결과의 예가 나와 있습니다. 세포의 응집 셀 마이그레이션 방해 하 고 손상 부 량. (C)이이 패널에 BTSCs 도금 했다 막 삽입 거품 형성의 예가 나와 있습니다. 거품이 가난한 이미지 품질 고 이동의 정확한 정량화를 방지. 스케일 바 대표 600 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 음성 neurosphere 침공 분석 결과. 이러한 패널 표시 BTSCs의 예는 neurosphere에서 0.4 mg/mL의 유형으로 나 침입 콜라겐 매트릭스 6 h 동안. 여기, 각 시간 지점에서 (A) 단계 이미지 표시 됩니다 (B) 대표적인 양적 마스크 중첩, 프로토콜 단계 3에서에서 자세히 설명 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 음성 neurosphere 침공 시간 경과 비디오에서 유형 I 교원 질. 0.4 mg/mL로 한 neurosphere에서 BTSCs의 침공 한이 동영상을 보여주는 나 콜라겐 매트릭스 (또한 그림 5A에서 스틸 이미지로 표시 됨)를 입력 합니다. 이미지 12 h에 대 한 시간 마다 10 X 목표를을 사용 하 여 인수 했다 고 초당 4 프레임에서 컴파일됩니다. 눈금 막대가 나타냅니다 300 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 7: 지하실 막 같은 매트릭스에서 음성 neurosphere 침공 시간 경과 비디오. 이 비디오는 BTSCs, 지하실 멤브레인와 같은 매트릭스로 neurosphere에서 그 익스프레스 cytosolic GFP의 침공을 보여줍니다. 이미지 48 h에 대 한 모든 30 분 목표를 4 X를 사용 하 여 인수 했다 고 초당 8 프레임에서 집계 되었다. 눈금 막대가 나타냅니다 800 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 8: 음성 침략 neurosphere 분석 한 결과 치료. (A) 음성 neurospheres 차량 또는 X. 이미지; 모든 시간을 인수 했다 약의 표시 농도 준비 지하실 막 같은 매트릭스에 포함 했다 여기는 이미지 촬영 당시 도금의 후 16 h. 눈금 막대가 나타냅니다 200 µ m. (B) 프로토콜 단계 3에서에서 설명한 대로 주변 매트릭스에 neurospheres에서 BTSCs의 침공 매 시간 정량은 데이터 포인트는 3 개의 기술 복제 웰 스, 평균 하 고 오차 막대 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. (C)이이 패널 음성 neurospheres에에서 포함 된 유형 나 교원 질 정량화에 대 한 너무 큰 영역을 보여 줍니다. 눈금 막대가 나타냅니다 300 µ m. (D)이이 패널 음성 neurospheres에에서 포함 된 유형 나 완벽 하 게 설정 하지 않은 콜라겐을 보여줍니다. 눈금 막대 나타냅니다 300 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 콜라겐 솔루션 준비 | |
| 주식 [콜라겐] (mg/ml) | 5 |
| 마지막 [콜라겐] (mg/ml) | 0.4 |
| 필요한 우물의 수: | 5 |
| 총 볼륨 (μ) | 500 |
| 재고 콜라겐 (μ)의 볼륨 | 40 |
| 1N NaOH (μ)의 볼륨 | 0.92 |
| 미디어 (μ)의 볼륨 | 459 |
표 1: 0.4 mg/mL의 준비 유형 I 교원 질 솔루션. 알려진 시작 및 종류의 원하는 최종 농도 나열 나 콜라겐 솔루션. 나열 된 볼륨 3 복제 웰 스 플러스 2 초과에 접시 neurospheres에 충분 한 고 3 프로토콜 단계에 자세히 설명 된 대로 단일 처리 조건, 포함 될 수 있습니다.
Discussion
암 세포는 적극적으로 확산 하 고, 그에 주어진이 세포 이동의 연구에 대 한 잠재적인 기술 도전 포즈. 여기에 설명 된 마이그레이션 분석 결과 대 한 BTSCs 성장 인자 없이 도금은, 확산을 제한 하 고 chemotaxis 접시의 chemoattractant 그라데이션 72 시간 이상 완전히 equilibrate 하지는 않습니다. 또한, 셀 시간이 지남에 라이브 셀 이미징 사용 하 여 모니터링 하 고로 셀 모니터링할 수 있습니다 시각적으로 광범위 한 세포 분열 하지 발생 되도록. 마이그레이션 분석 결과의 성공에 대 한 그것은 완전히 단일 셀에 neurospheres를 해리 하 고 도금 하기 전에 핸드폰 번호를 정확 하 게 계산 하는 것이 중요. 도금 분야 또는 너무 많은 셀을 도금, 응집, 어떤 결과 (그림 4A 및 4B) 작은 숨 구멍을 통해 마이그레이션에서 셀을 방지할 수 있습니다. 그것은 또한 chemotaxis 마이그레이션 플레이트에 셀을 도금 또는 아래쪽 저수지에 막 삽입을 배치할 때 거품을 만들지 않도록 하는 것이 중요. 거품 초점의 비행기를 변경 하 고 정확한 정량화 (그림 4C)을 방지할 수 있습니다. 전체 접시 제공 하기 때문에이 세포는 접시에 있는 숨 구멍에 이동 하는 표면 준수 하는 chemoattractant으로 생물학으로 관련 된 표면에 걸쳐 마이그레이션한 다음 셀을 필요로 하는이 분석 결과 콜라겐의 얇은 층으로 코팅을 해야 합니다.
여기에 설명 된 음성 마이그레이션 프로토콜 개별 셀 마이그레이션, 적은 셀 기존 프로토콜에 비교 될 때 다른 치료 조건 테스트를 위한 요구의 운동 평가 대 한 수 있습니다. 이 실험에 대 한 셀의 많은 수를 수집 하는 것이 어려울 수 있습니다 매우 느리게 성장 하는 문화에 대 한 중요 하다. Chemotaxis 마이그레이션 플레이트의 낮은 기 공 밀도 chemoattractant 그라데이션, 72 h, 보다 큰의 느린 평형에 대 한 허용 하 고 보다 효과적으로 시간의 긴 기간 동안 혈 마이그레이션의 생물 학적 과정을 모방. 프로토콜 분석 결과 조치 이동과 침략 하지 있도록 chemotaxis 마이그레이션 접시에 콜라겐 코팅의 아주 얇은 층을 최적화 했다. 그것은 또한 촉진 한다 이미징 및 단일 세포의 부 량으로 그들은 코팅 막 삽입 콜라겐 매트릭스를 준수. 그러나, 기술에의 한 제한 시간이 지남에 따라 여러 우물에서 마이그레이션의 정량화는 매우 단순 하 고 빠른 상용 소프트웨어를 사용 하 여은 ( 재료의 표참조). 마이그레이션 분석 결과의 주목할 만한 장점은 여기에 설명 된 대로 다른 셀 형식 프로토콜의 넓은 적응성입니다. 그것은 어느 느린 성장, 준수, 또는 천천히 마이그레이션할 어려운 셀 줄의 혈 마이그레이션 측정을 위해 특히 유용할 것 이다.
음성 침공 분석 결과의 성공을 위해, 그것은 200 µ m. 더 큰 분야는 지속적으로 이미지 (그림 5C) 계량을 너무 큰 초점의 비행기 보다 더 큰 되기 전에 neurospheres를 수집 하는 데 필요한. 또한, neurospheres는 덩어리와 다른 neurospheres와 집계를 시작할 수 있습니다. 이 정확 하 고 일관 된 데이터의 수집을 영향을 줍니다. 또한, 그것은 필수적인 콜라겐 초점 (그림 5D)의 단일 면에 이미지를 neurospheres 수 있도록 얼음에 여전히 동안 우물의 바닥에 침전 하는 neurospheres 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 완벽 하 게이 이미지 품질 (그림 5D)에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 심지어 매트릭스의 형성을 방해 수로 접시를 이동 하지 않고 설정에 콜라겐을 허용 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 음성 침공 분석 결과 대 한 주요 장점 중 하나는 BTSCs neurospheres로 교양 평가 될 수 있다 침략에 대 한 직접, adherently 성장 하는 필요 없이입니다. 또한, 음성 neurospheres 어떤 기질, 특정 조직에서 세포 외 매트릭스의 개별 구성 요소를 사용 하거나 상용 지하실 멤브레인 혼합물을 사용 하 여에 포함 될 수 있습니다. 세포 외 매트릭스를 지정 하 여 식별 하거나 침략의 특정 메커니즘을 테스트 도울 수 있다. 예를 들어이 프로토콜 특정 매트릭스 구성 요소를 저하 알려진 유전자의 매트릭스 metallopeptidase 가족의 개별 회원을 대상으로의 효과 평가 하기 위해 가능 하다. 또는,이 프로토콜은 음성 neurospheres, 비록 어떤 셀 영역으로 성장 비슷한 패션에 사용할 수 있습니다. 예로 유방암 세포 mammospheres 또는 tumorspheres;으로 교양된 주 대 장 암 세포 배양 그러나,이 셀 유형에 문화에서 영역으로 성장할 수 있는 방법을 제한 합니다. 마이그레이션 및 침입 분석 실험의 다른 장점은 그들은 설치 하기 쉽, 그들은 96-잘 형식에서 작동 및 데이터는 시간이 지나면서 같지는입니다.
전반적으로, 후 처리 GBM 재발을 방지 하기 위하여 음성 마이그레이션 및 침략의 조사를 용이 하 게 하는 방법론을 개발 필수적 이다. 여기에 설명 된 마이그레이션 프로토콜 이전 설립된 마이그레이션 분석 실험, 특히 GBM BTSCs의 연구에 대 한 많은 이점을 제공 합니다. 이 향상 된 마이그레이션 프로토콜 해리 BTSCs neurosphere 조건 하에서 경작 하 고 96 잘 콜라겐 코팅 chemotaxis 마이그레이션 접시에 단일 셀을 도금 하는 작업이 포함 됩니다. 라이브 셀 이미징 시스템을 사용 하 여, BTSCs의 마이그레이션 모니터링 되 고 시간이 지남에 계량. 여기에 설명 된 침공 분석 결과 행렬에 neurospheres에서 음성 침략의 모니터링 할 수 있습니다. 이 분석 결과 96 잘 접시에서 콜라겐 매트릭스, 또는 다른 단백질이 풍부한 기질, neurospheres를 포함 하는 작업이 포함 됩니다. 라이브 셀 시간 경과 이미징 시스템과 판 영상 시간이 지남에 다른 처리 조건 하에서 음성 침략의 분석에 대 한 수 있습니다. 이 분석 실험은 따라서, 과학자 음성 마이그레이션 및 침략을 기본 메커니즘을 이해 하기 바라고 귀중 한 도구를 제공 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 기술 지원에 대 한 Rozina Hassam와 Orsolya Cseh 감사합니다. 이 연구 프로젝트는 (H. Artee Luchman 사무엘와 이즈)를 혁신 하 고 (또한 H. Artee Luchman 사무엘와 이즈)를 캐나다의 줄기 세포 네트워크에 대 한 캐나다 재단에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
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