Summary
Här beskriver vi live-cell avbildningstekniker för att kvantitativt mäta om migration och invasionen av glioblastoma hjärnan Tumörstamceller över tid och flera behandling villkor.
Abstract
Glioblastom (GBM) är en aggressiv hjärntumör som styrs dåligt med de för närvarande tillgängliga behandlingsalternativ. Nyckel dragen av GBMs inkluderar snabb spridning och genomträngande invasion in i normala hjärnan. Återkommande är tänkt att resultera från närvaron av radio - och kemo-resistenta hjärnan Tumörstamceller (BTSCs) att invadera från den ursprungliga cancerogena massan och, således, undgå kirurgisk resektion. Därför kan terapier som riktade BTSCs och invasiva förmåga förbättra den annars dålig prognosen av denna sjukdom. Vår grupp och andra framgångsrikt har fastställts och karakteriserat BTSC kulturer från GBM patientprover. Dessa BTSC kulturer visar grundläggande cancer stamceller egenskaper såsom clonogenic självförnyelse, multi härstamning differentiering och tumör inledande i immun-brist möss. För att förbättra de nuvarande behandlingsmetoder för GBM, krävs en bättre förståelse för mekanismerna bakom BTSC migration och invasion. I GBM är studiet av migration och invasion begränsat, delvis på grund av begränsningarna i befintliga tekniker som inte fullt står för in vitro- tillväxt egenskaper BTSCs odlas som neurospheres. Här beskriver vi snabba och kvantitativa live-cell imaging analyser för att studera både migration och invasion egenskaperna för BTSCs. Den första metoden som beskrivs är BTSC migration analysen som mäter migreringen mot en korrektiv övertoning. Den andra metoden som beskrivs är BTSC invasion analysen vilka bilder och kvantifierar en cellulär invasion från neurospheres in i en matris. De analyser som beskrivs här används för kvantifiering av BTSC migration och invasion över tid och under olika förhållanden.
Introduction
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och mest aggressiva formen av cancer i hjärnan och, trots den nuvarande terapin som innebär kirurgisk resektion följt av strålning och kemoterapi, median överlevnaden hos patienter är bara 15 månader1. GBM är invasiv, mycket resistenta, och i slutändan en obotlig sjukdom som kräver fortsatt forskning i dess inneboende biologi för att identifiera nya terapeutiska möjligheter. Den höga dödligheten i GBM patienter orsakas primärt av omfattande cellulära invasionen in i angränsande normal hjärnvävnad och migreringen längs blodkärl, vilket leder till ett återfall i sjukdomen efter behandling2,3 . En delmängd av celler, kallas hjärnan Tumörstamceller (BTSCs), som är långsamma cykling och terapeutiskt resistenta, har antagit hypotesen för att leda till sjukdom återfall. GBM BTSCs Visa egenskaper clonogenic självförnyelse, multipotency och tumör-inleder potentiellt4,5,6. BTSCs också behålla sin överordnade GBM tumörer7,8,9,10genetiska, molekylär och fenotypiska heterogenitet. Dessa egenskaper gör BTSCs en extremt användbar modellsystem för att studera GBM och för att utforska nya terapeutiska strategier. In vivo, dessa stamceller-liknande celler klarar av tumörbildning, tillväxt och invasion När inopererad i hjärnan hos neonatala råttor11 och icke-feta diabetiker/svår kombinerad immunbrist (nicka/SCID) möss4. BTSCs förmåga att upprepade gånger bildar invasiva tumörer i vivo att sammanfatta sin ursprungliga tumörer cellulära och histologiska egenskaper starkt stöder deras roll som tumör-inleda celler12.
Nya behandlingsmetoder utvecklas till målet BTSCs och förbättra det långsiktiga resultatet för GBM patienter. För närvarande finns det begränsad förståelse av de cellulära migration och invasion processer som är associerade med terapeutiska motstånd och återfall. Migration och invasion är separata företeelser; migration är en process som underliggande celler riktad rörelse och innebär omorganiseringen av cytoskelettet, adhesionsmolekyler och montering/demontering av fokal kontaktpunkter, medan invasion kräver också fysiska förstörelsen av hinder såsom en extracellulär matrix13. En allmänt accepterad metod för att studera cellmigration och invasion är Boyden kammare assay14,15. För denna teknik, är en dubbel kammare fylld med media, med media i botten kammare kompletteras med en korrektiv. Chemotaxis utlöses med specifika tillväxtfaktorer eller cytokiner, eller fetalt bovint serum som en icke-specifik korrektiv. Efter korrektiv gradient migrera celler genom porösa membran. Vid slutpunkten, kan migrerade cellerna visualiseras och kvantifieras på undersidan av membranet genom färgning med Cytologisk eller fluorescerande färgämnen. Den Boyden migration assay kan ändras till en invasion analys av beläggning den porösa filter med extracellulär matrix komponenter såsom typ I kollagen eller en basalmembranet-liknande matris. Invasiva celler försämras matrisen, gå igenom till botten av filtret porös och kan kvantifieras på ett liknande sätt till migrationen analysen. Andra vanliga migration analyser ingår scratch sår och cell säkerhetszon analyser13. Scratch såret analysen utförs av sprätta en lucka i en cellulär enskiktslager och observera migration av celler från kanten av såret av imaging med jämna mellanrum tills scratch är stängd. I cell utslagning analysen används en fysisk barriär för att skapa en cell-fri zon före odling av celler. Barriären är bort en gång cellerna är konfluenta och migreringen av celler in i cellen-fri zon är avbildade regelbundet16.
Dessa etablerade tidigare analyser används ofta för att studera den migration eller invasion av vidhäftande och homogen cellpopulationer men pose avsevärda nackdelar när man studerar GBM BTSCs eller andra heterogena cancer cellpopulationer. Boyden kammare analysen kan bara generera endpoint mätningar kontra en kinetic bedömning av cellers rörelser. En observation över tid är av hög relevans för mätning av BTSC migration, med tanke på att celler från olika kulturer ofta migrera i olika takt. Som sådan, villkor och tidpunkten för analysen måste optimeras för varje typ av kultur och kräver tidskrävande arbete för adekvat provtagning och kvantifiering. Skrapa och cell uteslutandet analyser inte är väl lämpade att BTSC kulturer som, även när BTSCs är odlade på enskiktslager villkor med laminin-belagda plattor, har vi observerat att BTSCs verkar motstå rörelsen in i det öppna utrymmet och föredrar att bo i nära närhet till andra celler. Dessutom etablerade dessa migration analyser inte tillåter för visualisering och uppföljning av enskilda celler i hela försökstiden. Övervakning av enskilda celler över tid är värdefull för bedömning av migration i heterogena cellpopulationer såsom BTSCs. ytterligare nackdelar med Boyden kammare, scratch, och cell-utslagning zon analyserna för BTSC kulturer är som de kräver relativt hög cell nummer, kan vara tidskrävande att ställa in och antingen snabbt jämvikt eller inte har en korrektiv övertoning. Dessa analyser är som sådan inte idealisk att använda för sällsynta eller långsamt växande cellpopulationer eller för drogkontroll. Dessa analyser är dessutom inte lämpade för att mäta en invasion i en tredimensionell (3D)-format, vilket är särskilt viktigt för BTSCs odlas under neurosphere förhållanden.
Här beskriver vi analyser speciellt modifierats för observation och kvantifiering av migreringen för enskilda BTSCs, och invasionen av GBM BTSCs odlade som neurospheres. Första analysen beskriver en anpassning av Boyden kammare analysen använder live-cell time-lapse imaging och en chemotaxis migration tallrik för att mäta kemotaktisk cell migration13. Live-cell imaging i flera format tillåter för visualisering och kvantifiering av cellmigration flera behandling villkor. Den andra analysen som beskrivs här är en sfäroid invasion assay13,17, vilka åtgärder invasiva egenskaper för BTSCs odlade neurosphere villkor och inbäddade i en 3D extracellulärmatrix under olika behandling villkor. Dessa analyser finns Sammantaget mycket mer kompatibel än tidigare beskrivna metoder för att studera den flyttande och invasiva egenskaper för heterogena BTSC kulturer. De erbjuder också bättre möjligheter för utredning av nya terapeutiska strategier att rikta både migration och invasion, som bidrar väsentligt till återfall i sjukdom och dödlighet.
Protocol
1. odla stamceller i hjärnan tumören tidigare härrör från mänskliga Glioblastoma exemplar
Obs: BTSC kulturer var tidigare etablerade från mänskliga GBM patientprover6,7,8,9,10.
- Tina en injektionsflaska med cryogenically bevarade BTSCs i en bägare som innehåller 70% etanol, placeras inuti ett vattenbad vid 37 ° C, bara tills sist av isen smält. Späd de upptinade cellerna i 10 mL av media i en 15 mL koniska rör och centrifugera cellerna på 150 relativ centrifugalkraft (RCF) för 7 min.
Obs: I dessa protokoll, komplett media hänvisar till standardmedia brukade kultur BTSCs (tidigare beskrivits av Kelly et al.) 6, vanligtvis med tillväxtfaktorer närvarande. Media utan tillväxtfaktorer refererar till base media med alla komponenter men utan någon tillväxtfaktorer kompletteras. - Aspirera media och resuspendera cellerna i 8 mL av komplett media överför celler och media till en T25 kolv.
- Efter 1 vecka av odling av icke-anhängare villkor, dagligen övervaka kolven och komplettera innehållet med 1-2 mL av komplett media som behövs, om media börjar att tömma eller börjar bli sura som anges av en färgförändring av orange-gul. Passagen celler när neurospheres nå en diameter av ungefärligt 250 μm, normalt mellan 10-14 d (figur 1).
Obs: Den fördubbling tid BTSC kulturer varierar kraftigt. Neurosphere storlek kan mätas med en okulär mikrometer. - För att passage BTSCs, samla media och neurospheres av pipettering media ner ytan på kolven för att samla alla neurospheres och överföra dem till en 15 mL koniska rör och centrifugera röret för 7 min på 150 RCF.
Obs: Kolvar kan kontrolleras i Mikroskop för att säkerställa att alla neurospheres har samlats. En ytterligare tvätta med 5 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller media kan utföras för att samla in eventuella återstående neurospheres som behövs. - För att separera den BTSC neurospheres in enstaka celler, aspirera media och tillsätt 1 mL före värmde cell avlossning lösning och inkubera att vid 37 ° C för 7 min. pulverisera BTSC suspension 40 x med en P1, 000 mikropipett inställd på 800 μL.
Obs: Celler kan inkuberas längre vid 37 ° C om neurospheres inte separera. - Tillsätt 5 mL PBS (med antibiotika penicillin och streptomycin) till de dissocierade BTSCs och centrifugera cellerna vid 150 RCF för 7 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera BTSCs i 1-4 mL av komplett media, beroende på storleken på cellpelleten.
Obs: Cellsuspension behöver spädas ytterligare om koncentrationen är bortom korrekt detektionsgränsen för korrekt cell inventering. - Använder ett färgämne som utesluter döda celler, såsom trypan blå, räkna antalet livskraftiga celler och utsäde av BTSCs in i kolven eller platta av intresse — vanligtvis 200.000-300.000 celler i 8 mL av komplett media i en T25 kolv.
2. hjärnan tumören Stem Cell Migration Assay
- Utsäde 200.000 celler i en T25 kolv i 8 mL komplett media 1-2 veckor innan du planerar att utföra en migrering assay.
Obs: Tiden mellan plätering och utför analysen varierar beroende på ökningen av BTSC kulturen används.- För att testa effekten av en läkemedelsbehandling om migration, förbehandla cellerna med lämpliga fordonet, såsom DMSO och drog av intresse genom att lägga till tillämpliga volymer av fordonet eller drogen beståndet direkt i separata brunnar i media som innehåller celler.
- Förbereda chemotaxis migration plattan (figur 2A) genom beläggning med ett tunt lager av kollagen.
- Beräkna antalet brunnar i en 96 brunnar chemotaxis-plattan som kommer att behöva vara belagd med kollagen. Omfatta minst tre replikera brunnar för varje villkor.
- Späd 5 mg/mL av typ I-kollagen till 0,2 mg/mL i ren ättiksyra spädd till 0,14% i kultur grade vatten.
- Pipettera 0,2 mg/mL av kollagen både membran infoga brunnarna och botten reservoar brunnarna som används.
Obs: Botten behållarna i plattan kräver 225 µL och membran infoga brunnarna kräver 75 µL av kollagen för en ordentlig beläggning. - Plats migration plattan i en inkubator vid 37 ° C för 1 h. Aspirera kollagen lösningen från brunnarna utan att repa kollagen beläggning.
- Tvätta brunnarna 2 x med steril 1 x PBS. Om plattan inte används direkt, aspirera PBS och lagra den på 4 ° C i upp till 2 veckor. Varma chemotaxis migration plattan till rumstemperatur före användning.
- Förbereda botten reservoaren av chemotaxisna migration plattan.
- Pipettera 225 µL av media (utan tillväxtfaktorer), kompletterad med 10% FBS som ett korrektiv, till botten reservoar brunnarna av chemotaxisna migration plattan.
- Placera försiktigt membran skäret i nedre behållaren i en vinkel att undvika att skapa bubblor.
- Platta celler i membranet infoga av chemotaxisna migration plattan.
- Återsuspendera separerade BTSCs i media (utan tillväxtfaktorer) på en cell densiteten av 50.000 celler/mL. Lägg till droger till media om bedömningen av migration under olika läkemedelsbehandlingar. Växelvis, utsäde jämlike numrerar av förbehandlade och kontroll celler, samtidigt som den slutliga drog koncentrationen när plätering.
- Tallrik 50 µL av BTSCs från steg 2.4.1 i varje brunn av migration plattan på önskad behandling villkor.
- Bild chemotaxis migreringen.
- Placera chemotaxis migration plattan i live-cell bildgivande systemet och ange automatiserade avbildningsprogrammet att förvärva mikroskopiska bilder av plattan varje 1-2 h för upp till 72 h. använda kommersiell programvara (se Tabell för material), högerklicka på den tidslinjen och ange scan intervall till varje 2 h för 24 h.
Obs: De tidsintervall och totala tiden varierar mellan BTSC kulturer används; börja med 2 h mellanrum för 72 h tills erfarenheter med enskilda BTSC kulturer. Om ett automatiserat imaging system är tillgängligt, sedan bilder av samma synfält kan förvärvas manuellt med ett mikroskop och en kamera ansluten till avbildningsprogrammet. - När bilden förvärvet är klar, få bilderna för hela experimentet och skapa en bearbetning definition med programvaran analys som skiljer cellerna från bakgrund av membranet och migration porerna (figur 2B, röd mask) . Med kommersiell programvara (se Tabell för material), Välj en Ny bearbetning Definition och anger bearbetning definition för BTSCs till ett tröskelvärde för utsäde av 52, en växa tröskel av 85, justeringar av storleken (pixlar) av -1 och en minimiareal 200 μm2. Tillämpa denna bearbetning definition på undersidan av membranet. Ändra denna analys om det inte skiljer korrekt celler från bakgrunden membranet.
- Samla in data som cellen yta på undersidan av membranet för var och en av de tre replikera brunnar, som bara räknar de celler som har migrerat genom porerna. Diagram migration av cellerna i μm2 (område med celler migrerad) över tiden (figur 2 C, figur 3).
Obs: Se till att det relativa antalet celler Pläter och räknade på ovansidan av membranet på den första tidpunkten är liknande (mindre än 20% variation över alla brunnar) mellan alla behandling villkor att undvika eventuella effekter av ojämn plätering. Data insamling i den kommersiella programvaran (se Tabell för material) kan utföras genom att lansera bearbetning definitionen skapade i steg 2.5.2, att klicka på mått, sedan på grafen och export, och sedan på dataexport .
- Placera chemotaxis migration plattan i live-cell bildgivande systemet och ange automatiserade avbildningsprogrammet att förvärva mikroskopiska bilder av plattan varje 1-2 h för upp till 72 h. använda kommersiell programvara (se Tabell för material), högerklicka på den tidslinjen och ange scan intervall till varje 2 h för 24 h.
3. hjärnan tumören Stem Cell Neurosphere Invasion Assay
- Utsäde 200.000 celler i 8 mL av komplett media i en T25 kolv 1-2 veckor innan du planerar att utföra en invasion assay.
Obs: Timingen från plätering för att utföra analysen beror på andelen spridning av BTSC kulturen används.- För förbehandlade celler, lägga till sammansatta av intresse i kolven vid önskad koncentration på förutbestämd tid kursen innan neurospheres är redo att vara klädd för invasion.
- Vänta tills den genomsnittliga neurosphere storleken är cirka 150-200 μm. Detta tar normalt 7-14 d, beroende på BTSC kulturen som används.
Obs: Det är typiskt att iaktta en fördelning av sfär storlekar i kolven. - Spets och försiktigt blanda kolven med en pipett och flytta 500 μL av den BTSC neurospheres till ett 1,5 mL koniska rör för varje behandling villkor; Detta kommer att användas till tallrik tre replikera brunnar.
Obs: Stegen 3.3.1 - 3.3.2 är valfri men rekommenderas för den första invasionen experimenten på en ny BTSC kultur.- För att bestämma densiteten av de neurospheres som kommer att hamna i brunnen, förbereda en 1,5 mL tub som i steg 3.3. Blanda neurospheres försiktigt och flytta 100 μL till en separat plattan med 96 brunnar och Tillåt neurospheres sedimentera självtryck i 5 min.
- Kontrollera antalet neurospheres under mikroskopet se till flera neurospheres är i regionen av den brunn som ska avbildas utan överbefolkning det.
Obs: Invaderande neurospheres kräver tillräckligt med utrymme att tredubbla i diameter utan interagerar med angränsande neurospheres. Antalet neurospheres per brunn kan justeras genom att räkna antalet neurospheres per brunn och lägga till fler eller färre neurospheres från T25 kolven i 1,5 mL koniska röret i steg 3.3.
- Placera 1,5 mL koniska röret med celler från steg 3.3 på is och utför steg 3,5-3,7 på isen.
- Låt neurospheres reglera självtryck till botten av 1,5 mL koniska röret för 5 min och prechill en märkt plattan med 96 brunnar på is.
- Återsuspendera neurospheres i det extracellulära matrix proteinet.
- Förbereda 500 μL av en 0,4 mg/mL typ I-kollagen lösning på is för varje behandling villkor: lägga till 459 μL av media (utan tillväxtfaktorer), 40 μl av 5 mg/mL kollagen stamlösning och 0,92 μL av sterila 1N NaOH (tabell 1).
Obs: 500 μL av kollagen lösningen krävs per behandling skick: 100 μL för var och en av de tre replikera brunnarna och 200 μL av överskott. Läkemedelsbehandlingar behöver läggas här på önskad slutlig koncentration, subtraheras från komponenten media av lösningen. Det här protokollet beskriver användning av typ I-kollagen som extracellulär matrix protein; dock kan något extracellulär matrix protein testas. Dessutom för BTSC kan kulturer som har långsammare priser av invasion, tillväxtfaktorer eller FBS kompletteras i media för att öka graden av invasionen. - Efter neurospheres från steg 3.5 har kvittats sug upp så mycket av media som möjligt utan att förlora neurosphere pelleten som kvittats längst. Försiktigt Återsuspendera neurospheres i 500 μL av kollagen lösningen bereddes i steg 3.6.1.
- Förbereda 500 μL av en 0,4 mg/mL typ I-kollagen lösning på is för varje behandling villkor: lägga till 459 μL av media (utan tillväxtfaktorer), 40 μl av 5 mg/mL kollagen stamlösning och 0,92 μL av sterila 1N NaOH (tabell 1).
- Tillsätt 100 μL av kollagen och neurosphere blandningen till tre replikera brunnar i plattan med 96 brunnar på is. Låt neurospheres sedimentera på is i 5 min.
- Överföra plattan med 96 brunnar till en 37 ° C inkubator för 5 min för kollagen polymerisation.
- Genast förbereda till bild plattan med 96 brunnar.
- Placera plattan med 96 brunnar i facket ett live-cell imaging system eller på scenen av Mikroskop till förvärva en bild som referens för neurosphere storlek vid tidpunkten för plätering, innan invasionen börjar.
- Förvärva bilder varje timme tills graden av invasion har nått sitt tak; Detta inträffar vanligtvis inom 24 h.
Obs: Imaging intervallet kan ändras beroende på den utrustning som används. Imaging intervall och total förfluten tid kan också modifieras för BTSC kulturer som har olika priser för invasionen.
- Fastställa BTSCs ökande yta som de invadera matrisen över tid.
Obs: Ytan av celler vid tidpunkten för plätering, beräknad som medelvärdet av tre replikera brunnar, behöver vara liknande (mindre än 20% variation över alla brunnar) mellan de olika behandling villkor att säkerställa att skillnaderna i BTSC invasionen inte starkt påverkas av antalet eller omfattningen av de neurospheres pläterade.- För live-cell analyssystem, Använd ett 10 X-objektiv för bild förvärv och förvärva fyra bilder per brunn för tre replikera brunnar. För att bestämma relativt cell yta, representerade som procent sammanflödet av brunnen, ställa in en bearbetning definition som speciellt belyser cellerna över bakgrunden av brunnen. Med kommersiell programvara (se Tabell för material), Välj en ny bearbetning Definition och ange justeringen segmentering till 0,8, området minst 300 μm2och excentricitet maximum till 0,99. Ändra denna analys om det inte skiljer korrekt celler från bakgrunden.
Obs: Om du använder andra metoder för att bilden neurosphere invasion över tid, det rekommenderas att få flera synfält för tre replikera brunnar över tid. Dock kommer att inte imaging exakt samma synfält på varje intervall öka de insamlade standardfel. Datorprogram kan användas för att mäta ytan av invaderande celler i varje bild. - Samla in data som summacell yta (relativ eller absolut) för varje brunn vid varje tidpunkt och Bestäm medelvärdet av de tre replikera brunnarna. Diagram invasionen av BTSCs genom att rita området ökande cellen över tid.
Obs: Datainsamling använder kommersiell programvara (se Tabell för material) kan utföras genom att lansera bearbetning definitionen skapade i steg 3.10.1, klicka på mått, sedan på grafen och export, och sedan exportera Data på .
- För live-cell analyssystem, Använd ett 10 X-objektiv för bild förvärv och förvärva fyra bilder per brunn för tre replikera brunnar. För att bestämma relativt cell yta, representerade som procent sammanflödet av brunnen, ställa in en bearbetning definition som speciellt belyser cellerna över bakgrunden av brunnen. Med kommersiell programvara (se Tabell för material), Välj en ny bearbetning Definition och ange justeringen segmentering till 0,8, området minst 300 μm2och excentricitet maximum till 0,99. Ändra denna analys om det inte skiljer korrekt celler från bakgrunden.
Representative Results
Här, beskriver vi exempel på data som kan erhållas med hjälp av live-cell imaging analyser för att studera BTSC migration och invasion. BTSCs är klädd som enstaka celler och kan odlas som fritt flytande neurospheres (figur 1). Vi visar att BTSCs kan särskiljas och klädd i brunnarna membran insatsen i en chemotaxis migration platta som är belagd med ett tunt lager av typ I kollagen (figur 2A). Enskilda BTSCs sprids jämnt på toppen av membran skäret i början av analysen. Under en period av 24-72 h, celler följer membranet, flytta längs kollagen-belagd yta och migrera genom en av de 96 små porerna på undersidan av membranet, mot en korrektiv i behållaren väl. Efter att markera cellerna på toppen av membranet i gult, porerna i blått och cellerna längst ned på membranet i rött, celler kan ses att ange i urlakat på toppen (gul cell närmar sig en blå por) och spännande pore på undersidan (red cell avfart ing blå pore) (figur 3). Ännu viktigare, kan celler vara behandlade med läkemedel och pläterad i samma chemotaxis migration platta som fordonet-behandlade kontroll celler att studera effekten av terapeutiska interventioner på BTSC migration (figur 2B). Chemotaxis migration plattan möjliggör bildtagning av celler både på toppen och på botten av membran skäret. Därför, kvantifiering av cellmigration över tid är möjligt genom att räkna de celler som har migrerat till undersidan av membranet (figur 2 c).
Vi har funnit att om BTSCs inte är fullt dissocierade, då cellerna inte migrera genom porerna och kvar som små neurospheres (figur 4A). Det är också viktigt att inte plattan mer än 2 500 BTSCs per brunn som detta resulterar i cell klumpar i stället för migrering till undersidan av membranet (figur 4B). Slutligen är det viktigt att undvika att göra bubblor i membranet infoga brunnar när plätering celler och när släpps ut membranet infogar nedre behållaren, eftersom detta förhindrar korrekt avbildning och kvantifiering (figur 4 c).
Nästa, vi visar att BTSC invasion, från neurospheres in i omgivande matrisen, kan avbildas och kvantifieras med tiden i plattan med 96 brunnar format (figur 5A). Invasionen kan mätas genom att kvantifiera ytan av cellerna som de invadera matrisen över tid. Med bild analys programvara, tillämpades en bearbetning definition att överlägg en masken på cellens yta, vilket möjliggör automatisk kvantifiering över tiden (figur 5B). Time-lapse video BTSC invasioner kan också skapas, för att enkelt följa den övergripande processen för BTSC invasion (figur 6). Fluorescerande mikroskopi kan dessutom användas till bild BTSCs som uttrycker fluorescerande proteiner, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) eller röd fluorescerande protein (RFP). Här har vi skapat en time-lapse video av BTSCs uttrycker en cytosoliska form av GFP för att spåra enskilda BTSCs som de invadera en basalmembranet-liknande matris (figur 7). Denna BTSC neurosphere invasion analys möjliggör också läkemedelsbehandlingar ska läggas i replikera wells att direkt bedöma deras effekter på BTSC invasion från neurospheres in i en matris (figur 8A). Kvantifiering av flera neurospheres i replikera brunnar kan beräknas och ett diagram över tid för att bedöma effekten av läkemedel vid flera koncentrationer (figur 8B).
Underlåtelse att följa det protokoll som beskrivs ovan kan leda till en oförmåga att erhålla tillförlitliga och korrekta data. Bädda in BTSC neurospheres som är för stora, leder med en diameter som är större än 200 µm, till ett plan i fokus som är för stor att exakt kvantifiera alla områden i ett synfält (figur 8 c). Likaså kan underlåtenhet att upprätthålla matrisen vid 4 ° C medan inbäddning i neurospheres också leda till områden som inte är på samma plan i fokus och en extracellulär matrix som inte stelnat jämnt, vilket förhindrar insamling av korrekta uppgifter (figur 8 d ).
Figur 1: odling BTSCs. Dessa paneler är ett representativt exempel på BTSCs vuxit från enstaka celler till neurospheres under en 14-d i kultur. De neurospheres som visas här på dag 14 är av lämplig storlek för passaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Live-cell avbildning av en BTSC migrering. (A) Detta är ett exempel på en platta med 96 brunnar Kemotaxis i migration belagd med ett tunt lager av typ I kollagen innan du utför migreringen analysen med BTSCs. Bilderna visar i) en tallrik med alla tre delarna (lock, membran infoga och reservoar) placeras tillsammans, ii) alla tre delar åtskilda, iii) en närbild bild av ovanifrån av membran skäret, iv) en närbild bild av vyn botten av membran skäret och v) en närbild bild av reservoaren botten. (B) dessa är representativa bilder av en BTSC migrering från början (0 h) av experimentet och på 24 h. Bild fokus ligger på toppen av membran skäret där cellerna var ursprungligen klädd. Celler som har migrerat till botten av chemotaxisna migration plattan är markerade i rött. Vid 0 h, har några celler migrerat till undersidan av membranet. Efter 24 h, har Antal migrerade celler ökat dramatiskt. Jämförelse av bilderna på 24 h för celler behandlas med ett fordon vs läkemedel X visar att läkemedelsbehandlingen minskar BTSC migrationen. Den skala barer representera 600 µm. (C), denna panel visar kvantifiering av en BTSC migration efter förbehandling med ett fordon eller drogen X. Grafen visar att läkemedelsbehandlingen har en stark effekt på migrering av BTSCs. Datapunkterna är medelvärdet av tre tekniska replikera brunnar och felstaplar representera standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Animerad figur 3: BTSC migration time-lapse video. Denna video visar migration av BTSCs med hjälp av en typ som jag kollagen-belagd chemotaxis migration plattan. Cellerna på toppen av membran infoga markeras i gult, celler som har migrerat till botten av membran Skäret är markerade i rött och porerna i membranet är markerade i blått. Planet av fokus är inställt på bildcellerna på undersidan av membranet. Videon skapades med time-lapse bilder tas varje timme för 51 h och sammanställt 4 bilder per sekund. Skalstapeln representerar 200 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 4: exempel på fel i migration assay set-up. (A) denna panel visar ett exempel på BTSCs som inte var fullt dissocierade före plätering på övre membran skäret av chemotaxisna migration plattan. På grund av den stora storleken på kulorna och små membran porerna är cellerna oförmögen att migrera till reservoaren botten. (B) i denna panel visas ett exempel på en migration analys där alltför många celler var klädd. Klumpar av celler stör cellmigration och försämrar kvantifiering. (C) i denna panel visas ett exempel på bubbla bildandet på membran skäret där BTSCs var klädd. Bubblor resultera i dålig bildkvalitet och förhindra en exakt kvantifiering av migration. De skala staplarna representerar 600 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: BTSC neurosphere invasion assay. Dessa paneler visar ett exempel på BTSCs invaderar från en neurosphere till en 0,4 mg/mL typ jag kollagenmatrisen under 6 h. Här, visas (A) fas kontrast bilder vid varje tidpunkt (B) med representativa kvantitativa masken överlagras, som beskrivs i detalj i protokollet steg 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: BTSC neurosphere invasion time-lapse video i typ I-kollagen. Denna video visar en invasion av BTSCs från en neurosphere till en 0,4 mg/mL typ I-kollagen matris (som också visas som stillbilder i figur 5A). Bilderna har förvärvats med ett 10 X mål varje timme för 12 h och sammanställs på 4 bilder per sekund. Skalstapeln representerar 300 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 7: BTSC neurosphere invasion time-lapse video i en basalmembranet-liknande matris. Denna video visar en invasion av BTSCs, att uttrycka cytosoliska GFP, från en neurosphere till en basalmembranet-liknande matris. Bilderna har förvärvats med ett 4 X-objektiv varje 30 min för 48 h och sammanställdes på 8 bilder per sekund. Skalstapeln representerar 800 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 8: BTSC neurosphere invasion assay med behandling. (A), BTSC neurospheres var inbäddad i en basalmembranet-liknande matris beredd med fordon eller angivna koncentrationerna av drogen X. bilder förvärvades varje timme; visas här är bilder tagna vid tiden för plätering och efter 16 h. Skalstapeln representerar 200 µm. (B) en invasion av BTSCs från neurospheres in i omgivande matrisen kvantifierades varje timme, enligt protokollet steg 3. Datapunkterna är medelvärdet av tre tekniska replikera brunnar och felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). (C), denna panel visar BTSC neurospheres inbäddade i typ I kollagen med en sfär som är för stor för kvantifiering. Skalstapeln representerar 300 µm. (D) i denna panel visas BTSC neurospheres inbäddade i typ I kollagen som inte fullt ut uppsättningen. Skalstapeln representerar 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Kollagen lösning förberedelse | |
| Lager [kollagen] (mg/ml) | 5 |
| Slutlig [kollagen] (mg/ml) | 0,4 |
| Antal brunnar behövs: | 5 |
| Total volym (µl) | 500 |
| Volym av lager kollagen (μl) | 40 |
| Volymen av 1N NaOH (μl) | 0,92 |
| Volymen av media (μl) | 459 |
Tabell 1: förberedelse av 0,4 mg/mL typ I-kollagen lösning. Listas kända start- och önskad slutliga koncentrationer av typ I kollagen lösning. De volymer som anges är tillräckliga för att plattan neurospheres till tre replikera brunnar, plus två för överskott, och kan omfatta ett enstaka behandling villkor, som beskrivs i detalj i protokollet steg 3.
Discussion
Med tanke på att cancercellerna breder aktivt, innebär detta en potentiell teknisk utmaning för studien av cellmigration. För migration analysen beskrivs här, BTSCs är pläterade utan tillväxt faktorer som begränsar spridningen och korrektiv toningen av chemotaxisna plattan fullt jämvikta inte över 72 timmar. Dessutom, eftersom cellerna som övervakas med hjälp av live-cell imaging över tid, kan celler visuellt kontrolleras för att säkerställa utbredda celldelning inte sker. För att lyckas med migration analysen är det viktigt att skilja neurospheres helt att enstaka celler och exakt räkna den cell nummer före plätering. Plätering sfärer eller plätering för många celler, vilket resulterar i klumpar, kan förhindra att celler migrerar genom små porer (figur 4A och 4B). Det är också viktigt att undvika att skapa bubblor när plätering cellerna i chemotaxis migration plattan eller att släppa ut membranet skäret på reservoaren botten. Bubblor kan ändra fokus plan och förhindra korrekt kvantifiering (figur 4 c). Hela plattan behöver vara belagd med ett tunt lager av kollagen eftersom detta ger cellerna en yta för att navigera vidare till porerna i plattan, eftersom denna analys kräver celler att uppfylla och sedan migrera över en biologiskt relevanta yta mot korrektiv.
BTSC migration protokollet beskrivs här tillåter för kinetiska bedömning av enskild cellmigration, som kräver färre celler för att testa olika behandling villkor jämfört med befintliga protokoll. Detta är viktigt för kulturer som växer mycket långsamt, eftersom det kan vara svårt att samla ett stort antal celler för experiment. Låg pore tätheten av chemotaxisna migration plattan möjliggör en långsammare Jämviktstiden korrektiv övertoningens, större än 72 h, och mer effektivt härmar den biologiska processen kemotaktisk migration över en längre tidsperiod. Protokollet var optimerad för att ha ett mycket tunt lager av kollagen beläggning på chemotaxis migration plattan att säkerställa att analysen åtgärder migration och inte invasionen. Det underlättar också imaging och kvantifiering av enstaka celler som de iakttar den kollagenmatrisen beläggning membran skäret. En begränsning av tekniken är dock att kvantifiering av migrering över flera brunnar över tid är kraftigt förenklat och påskyndat använder kommersiell programvara (se Tabell för material). En anmärkningsvärd fördel migration analysens är som beskrivs här bred anpassningsförmåga av protokollet till andra celltyper. Det kommer att vara särskilt användbart för att kvantifiera kemotaktisk migration av cellinjer som är antingen långsamt växande, svårt att följa, eller migrera långsamt.
För att säkerställa framgången för BTSC invasion analysen, är det nödvändigt att samla in neurospheres innan de blir större än 200 µm. större kulorna har ett plan i fokus som är för stor för att konsekvent bild och kvantifiera (figur 5 c). Dessutom kan neurospheres börja klumpa och aggregera med andra neurospheres. Detta påverkar förvärvet av korrekta och konsekventa data. Det är dessutom viktigt att neurospheres får bosätta sig på botten av brunnen medan kollagen är fortfarande på is, att neurospheres till avbildas i ett enda plan av fokus (figur 5 d). Likaså är det viktigt att låta kollagen ställa helt utan rörliga plattan eftersom detta kan orsaka bildandet av en jämn matris, som negativt kan påverka bildkvaliteten (figur 5 d). För BTSC invasion analysen beskrivs här, är en av de stora fördelarna att BTSCs odlade som neurospheres kan bedömas för invasion direkt, utan att behöva odlas adherently. Dessutom kan BTSC neurospheres bäddas in i någon extracellulära matrix, antingen med hjälp av enskilda komponenter i den extracellulära matrixen från en specifik vävnad eller en kommersiellt tillgänglig basalmembranet blandning. Ange den extracellular matrisen kan hjälpa till att identifiera eller testa specifika mekanismer av invasion. Exempelvis med detta protokoll är det möjligt att bedöma effekten av inriktning enskilda medlemmar av matrix metallopeptidase familj av gener, som är kända för att försämra specifika matrix komponenter. Alternativt, även om detta protokoll gäller BTSC neurospheres, celler odlas som sfärer kan användas på ett liknande sätt. Exempel är bröstcancerceller odlade som mammospheres eller Primär kolorektal cancerceller odlade som tumorspheres; Detta begränsar dock tekniken till celltyper som kan växa som sfärer i en kultur. Andra fördelar med både migration och invasion analyser är att de är lätta att ställa in, de arbetar i en 96-väl format, och data är kvantifierbara över tid.
Sammantaget för att förhindra efterbehandling GBM upprepning, är det nödvändigt att utveckla metoder att underlättar utredningen av BTSC migration och invasion. Det migration-protokollet som beskrivs här erbjuder många fördelar jämfört med tidigare etablerade migration analyser, särskilt för studiet av GBM BTSCs. Detta förbättrade migration protokoll innebär att separera BTSCs odlade neurosphere villkor och plätering enstaka celler i en 96-väl kollagen-belagd chemotaxis migration tallrik. Live-cell imaging system med kan migrering av BTSCs övervakas och kvantifieras med tiden. Invasion analysen beskrivs här möjliggör övervakning av BTSC invasioner från neurospheres in i en matris. Denna analys innebär att bädda in neurospheres i en kollagenmatrisen, eller en annan proteinrika extracellulär matrix, i en plattan med 96 brunnar. Avbildning av plattan med en live-cell time-lapse imaging system möjliggör analys av BTSC invasioner behandlas olika villkor över tid. Dessa analyser, ger därför ett värdefullt verktyg att forskare hoppas att bättre förstå mekanismerna bakom BTSC migration och invasion.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Rozina Hassam och Orsolya Cseh för deras tekniska support. Detta forskningsprojekt stöddes delvis genom bidrag från stiftelsen Kanada för Innovation (till H. Liselott Luchman och Samuel Weiss) och Kanadas Stem Cell Networks (också till H. Liselott Luchman och Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
