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Cancer Research

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Published: August 29, 2018 doi: 10.3791/58152
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Hotchkiss Brain Institute, Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology Program, Arthur and Sonia Labatt Brain Tumor Research Centre, The Hospital for Sick Children

Summary

यहाँ, हम लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन मात्रात्मक समय के साथ और कई उपचार की स्थिति के तहत ग्लियोब्लास्टोमा मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को मापने के लिए.

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) खराब वर्तमान में उपलब्ध उपचार के विकल्प के साथ नियंत्रित किया जाता है कि एक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर है । GBMs की मुख्य विशेषताओं में तेजी से प्रसार और सामांय मस्तिष्क में व्यापक आक्रमण शामिल हैं । पुनरावृत्ति रेडियो की उपस्थिति से परिणाम के लिए सोचा है-और chemo प्रतिरोधी मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम सेल (BTSCs) कि प्रारंभिक कैंसर द्रव्यमान से दूर आक्रमण और, इस प्रकार, शल्य चिकित्सा लकीर से बचने । इसलिए, चिकित्सा कि लक्ष्य BTSCs और उनके इनवेसिव क्षमताओं इस रोग के अंयथा गरीब रोग का निदान में सुधार हो सकता है । हमारे समूह और दूसरों को सफलतापूर्वक स्थापित किया है और जीबीएम रोगी नमूनों से BTSC संस्कृतियों विशेषता । इन BTSC संस्कृतियों मौलिक कैंसर इस तरह के clonogenic आत्म नवीकरण, बहु वंश भेदभाव, और प्रतिरक्षा की कमी चूहों में ट्यूमर दीक्षा के रूप में कोशिका के गुणों स्टेम प्रदर्शित करता है । आदेश में जीबीएम, BTSC प्रवास और आक्रमण के तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए वर्तमान चिकित्सीय दृष्टिकोण पर सुधार करने के लिए आवश्यक है । जीबीएम में, प्रवास और आक्रमण का अध्ययन प्रतिबंधित है, भाग में, मौजूदा तकनीक की सीमाओं के कारण जो पूरी तरह से इन विट्रो विकास के लिए नहीं खाते में BTSCs की विशेषताओं के रूप में विकसित neurospheres । यहां, हम तेजी से और मात्रात्मक जीवित सेल इमेजिंग परख का वर्णन करने के लिए दोनों प्रवास और BTSCs के आक्रमण गुणों का अध्ययन । पहली विधि वर्णित BTSC प्रवास परख जो एक chemoattractant ढाल की ओर पलायन उपाय है । दूसरी विधि वर्णित BTSC आक्रमण परख जो छवियां और neurospheres से एक मैट्रिक्स में एक सेलुलर आक्रमण quantifies है । यहां वर्णित परख समय के साथ और विभिंन उपचार की स्थिति के तहत BTSC प्रवास और आक्रमण के ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है ।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क कैंसर का सबसे आम और आक्रामक रूप है और, वर्तमान सर्जिकल विकिरण और कीमोथेरेपी के बाद लकीर शामिल चिकित्सा के बावजूद, रोगियों के औसत जीवित रहने के एक मात्र 15 महीने1है । जीबीएम आक्रामक, उच्च दवा प्रतिरोधी है, और अंत में, एक लाइलाज बीमारी है कि अपने निहित जीव विज्ञान में जारी अनुसंधान की आवश्यकता है ताकि उपंयास चिकित्सीय रास्ते की पहचान करने के लिए । जीबीएम रोगियों की उच्च मृत्यु दर मुख्य रूप से आसन्न सामान्य मस्तिष्क ऊतक में व्यापक सेलुलर आक्रमण और रक्त वाहिकाओं के साथ प्रवास, जो उपचार निम्नलिखित रोग की पुनरावृत्ति की ओर जाता है की वजह से है2,3 . कोशिकाओं का एक सबसेट, शब्द मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम सेल (BTSCs), कि धीमी गति से साइकिल चालन और चिकित्सकीय प्रतिरोधी रहे हैं, रोग पुनरावृत्ति के लिए नेतृत्व की कल्पना की गई है । जीबीएम BTSCs प्रदर्शन के गुण clonogenic स्व-नवीकरण, multipotency, और ट्यूमर-प्रारंभिक क्षमता4,5,6। BTSCs भी आनुवंशिक, आणविक, और phenotypic विविधता उनके जनक जीबीएम ट्यूमर7,8,9,10को बनाए रखने । इन संपत्तियों जीबीएम के अध्ययन के लिए और उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों की खोज के लिए BTSCs एक अत्यंत उपयोगी मॉडल प्रणाली बनाते हैं । vivo में, इन स्टेम की तरह कोशिकाओं ट्यूमर गठन में सक्षम हैं, विकास, और आक्रमण जब नवजात चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित11 और गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह/गंभीर संयुक्त इम्यूनो (मंजूरी/SCID) चूहों4. BTSCs की क्षमता अपने मूल ट्यूमर की सेलुलर और ऊतकवैज्ञानिक विशेषताओं दृढ़ता से दोहराऊंगा कोशिकाओं ट्यूमर की शुरुआत12के रूप में उनकी भूमिका का समर्थन करता है कि vivo में इनवेसिव ट्यूमर फार्म के लिए.

उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण BTSCs लक्ष्य को विकसित किया जा रहा है और मदद जीबीएम रोगियों के लिए दीर्घकालिक परिणाम में सुधार होगा । वर्तमान में, वहां सेलुलर प्रवासन और आक्रमण प्रक्रियाओं है कि उपचारात्मक प्रतिरोध और पुनरावृत्ति के साथ जुड़े रहे है की समझ सीमित है । प्रवास और आक्रमण अलग घटनाएं हैं; प्रवास कोशिकाओं के निर्देश आंदोलन अंतर्निहित प्रक्रिया है और cytoskeleton के पुनर्गठन शामिल है, आसंजन अणुओं, और विधानसभा/फोकल संपर्क अंक के विधानसभा, जबकि आक्रमण भी बाधाओं के भौतिक विनाश की आवश्यकता है जैसे कि एक extracellular मैट्रिक्स13. सेल प्रवास और आक्रमण के अध्ययन की एक व्यापक रूप से स्वीकार की पद्धति Boyden चैंबर परख14,15है । इस तकनीक के लिए, एक डबल चैंबर मीडिया से भर जाता है, नीचे चैंबर में मीडिया के साथ एक chemoattractant के साथ पूरक । Chemotaxis विशिष्ट विकास कारकों या साइटोकिंस, या एक गैर विशिष्ट chemoattractant के रूप में भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग शुरू हो रहा है । chemoattractant के ढाल के बाद, कोशिकाओं को छिद्रित झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरित । समापन बिंदु पर, माइग्रेट किए गए कक्षों को विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है और कोशिकाविज्ञान या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ धुंधला करके झिल्ली के नीचे quantified. Boyden प्रवासन परख कोटिंग द्वारा एक आक्रमण परख के लिए संशोधित किया जा सकता है extracellular मैट्रिक्स घटकों के साथ इस तरह के रूप में मैं प्रकार कोलेजन या एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की तरह असुरक्षित फ़िल्टर । आक्रामक कोशिकाओं मैट्रिक्स नीचा, छिद्रित फिल्टर के नीचे करने के लिए कदम के माध्यम से, और प्रवास परख करने के लिए एक समान तरीके से quantified जा सकता है । अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रवास परख खरोंच घाव और कोशिका अपवर्जन क्षेत्र13परख शामिल हैं । खरोंच घाव परख एक सेलुलर monolayer में एक अंतर खरोंच द्वारा किया जाता है और खरोंच बंद हो जाता है जब तक नियमित अंतराल पर इमेजिंग द्वारा घाव के किनारे से कोशिकाओं के प्रवास को देख रहा है । कोशिका अपवर्जन परख में, एक शारीरिक बाधा कोशिकाओं के बोने से पहले एक सेल मुक्त क्षेत्र बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक बार जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह और सेल मुक्त क्षेत्र में कोशिकाओं के प्रवास नियमित रूप से16imaged है बाधा हटा दिया जाता है ।

ये पहले से स्थापित की परख अक्सर प्रवास या अनुयाई और सजातीय कोशिका आबादी के आक्रमण का अध्ययन, लेकिन काफी नुकसान जब जीबीएम BTSCs या अंय विषम कैंसर कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । Boyden चैंबर परख ही समापन बिंदु माप बनाम सेल आंदोलन के एक काइनेटिक मूल्यांकन उत्पंन कर सकते हैं । समय के साथ एक प्रेक्षण BTSC प्रवास की माप के लिए उच्च प्रासंगिकता का है, दिया है कि विभिंन संस्कृतियों से कोशिकाओं को अक्सर अलग दरों पर पलायन । इस तरह के रूप में, शर्तों और परख के समय प्रत्येक संस्कृति प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और पर्याप्त नमूना और ठहराव के लिए समय की आवश्यकता है गहन परिश्रम । खरोंच और कोशिका अपवर्जन परख अच्छी तरह से BTSC संस्कृतियों के रूप में अनुकूल नहीं हैं, यहां तक कि जब BTSCs laminin पर monolayer शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कर रहे है लेपित प्लेटें, हमने देखा है कि BTSCs को खुले स्थान में आंदोलन का विरोध और बंद में रहना पसंद करते दिखाई अंय कोशिकाओं से निकटता । इसके अलावा, इन स्थापित प्रवास परख एक प्रयोग में दृश्य और व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी के लिए अनुमति नहीं देते । समय के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी विषम कोशिका आबादी में प्रवास के आकलन के लिए इस तरह के BTSCs के रूप में मूल्यवान है । Boyden चैंबर, खरोंच के अतिरिक्त नुकसान, और सेल-BTSC संस्कृतियों के लिए अपवर्जन क्षेत्र परख रहे है कि वे अपेक्षाकृत उच्च कोशिका संख्या की आवश्यकता होती है, समय की स्थापना के लिए लेने वाली हो सकता है, और या तो तेजी से equilibrate या एक chemoattractant ढाल नहीं है । जैसे, इन परख के लिए दुर्लभ या धीमी गति से बढ़ती कोशिका आबादी या दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए आदर्श नहीं हैं । इसके अलावा, इन परख एक तीन आयामी (3 डी) प्रारूप है, जो neurosphere शर्तों के तहत हो BTSCs के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है में एक आक्रमण को मापने के लिए अनुकूल नहीं हैं ।

यहां, हम विशेष रूप से अवलोकन और व्यक्तिगत BTSCs के लिए प्रवास के ठहराव के लिए संशोधित परख का वर्णन है, और जीबीएम के आक्रमण के लिए BTSCs neurospheres के रूप में संस्कृति । पहली परख Boyden चैंबर परख के एक अनुकूलन रहते सेल समय-चूक इमेजिंग और एक chemotaxis माइग्रेशन प्लेट का उपयोग करने के लिए chemotactic सेल माइग्रेशन13मापने का वर्णन करता है । Live-एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में सेल इमेजिंग दृश्य और कई उपचार शर्तों के तहत सेल प्रवास के ठहराव के लिए अनुमति देता है । दूसरी परख यहां वर्णित एक अंडाकार आकृति आक्रमण परख13,17, जो neurosphere शर्तों के तहत BTSCs के इनवेसिव गुण उपायों और विभिंन उपचार के तहत एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में एंबेडेड है शर्तों. कुल मिलाकर, इन परख बहुत अधिक पहले से विषम BTSC संस्कृतियों के प्रवासी और इनवेसिव गुणों का अध्ययन करने के लिए तरीके वर्णित संगत कर रहे हैं । उंहोंने यह भी उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों की जांच के लिए बेहतर अवसर प्रदान करने के लिए दोनों प्रवास और आक्रमण है, जो महत्वपूर्ण रोग पुनरावृत्ति और घातकता को लक्षित करते हैं ।

Protocol

1. संवर्धन ब्रेन ट्यूमर स्टेम पहले मानव ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों से व्युत्पंन कोशिकाओं

नोट: BTSC संस्कृतियों पहले मानव जीबीएम रोगी नमूने6,7,8,9,10से स्थापित किए गए थे ।

  1. ७०% इथेनॉल युक्त यूरिन में क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित BTSCs की एक शीशी, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान के अंदर रखा गया है, बस जब तक बर्फ के पिछले गल गया है । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मीडिया के 10 मिलीलीटर में गल कोशिकाओं को पतला और 7 मिनट के लिए १५० सापेक्ष केंद्रापसारक बल (आरसीएफ) पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    नोट: इन प्रोटोकॉल के दौरान, पूरा मीडिया मानक संस्कृति BTSCs के लिए इस्तेमाल किया मीडिया को संदर्भित करता है (पहले केली एट अल द्वारा वर्णित है.) 6, आमतौर पर विकास कारकों के साथ मौजूद । विकास कारकों के बिना मीडिया सभी घटकों के साथ आधार मीडिया को संदर्भित करता है, लेकिन किसी भी विकास कारकों के बिना पूरक ।
  2. मीडिया महाप्राण, पूरी मीडिया के 8 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend, और एक T25 कुप्पी करने के लिए कोशिकाओं और मीडिया हस्तांतरण ।
  3. गैर के तहत संवर्धन के 1 सप्ताह के बाद अनुयाई शर्तों, दैनिक कुप्पी की निगरानी और पूरा मीडिया के 1-2 मिलीलीटर के साथ सामग्री के पूरक के रूप में जरूरत है, अगर मीडिया को समाप्त करने के लिए शुरू होता है या एक नारंगी पीले रंग परिवर्तन द्वारा संकेत के रूप में अंलीय बन शुरू होता है । जब neurospheres लगभग २५० माइक्रोन के एक व्यास तक पहुंचने कोशिकाओं गद्यांश, 10-14 d (चित्रा 1) के बीच आम तौर पर.
    नोट: अलग BTSC संस्कृतियों के दोहरीकरण समय व्यापक रूप से बदलता है । Neurosphere आकार एक नेत्र माइक्रोमीटर का उपयोग कर मापा जा सकता है ।
  4. BTSCs पारित करने के लिए, मीडिया को इकट्ठा करने और neurospheres कुप्पी की सतह के नीचे मीडिया pipetting द्वारा आदेश में सभी neurospheres इकट्ठा करने के लिए और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए उन्हें हस्तांतरण और १५० आरसीएफ में 7 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक ।
    नोट: सभी neurospheres एकत्र किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कुप्पी जाँच की जा सकती है । फास्फेट का 5 मिलीलीटर के साथ एक अतिरिक्त धोने (पंजाब) खारा या मीडिया के लिए आवश्यक के रूप में किसी भी शेष neurospheres इकट्ठा किया जा सकता है ।
  5. BTSC neurospheres को एकल कक्षों में अलग कर देना करने के लिए, मीडिया को महाप्राण और पूर्व-उष्ण सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ ° c 7 min. Triturate के लिए BTSC निलंबन 40x के साथ एक P1, 000 micropipette ८०० पर सेट μL ।
    नोट: neurospheres अलग कर देना नहीं है, तो कोशिकाओं ३७ ° c पर अब किया जा सकता है ।
  6. असंबद्ध BTSCs के लिए (एंटीबायोटिक पेनिसिलिन और streptomycin के साथ) पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 7 मिनट के लिए १५० आरसीएफ में कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
  7. महाप्राण supernatant और पूरा मीडिया के 1-4 मिलीलीटर में BTSCs resuspend, सेल गोली के आकार पर निर्भर करता है ।
    नोट: यदि एकाग्रता सटीक सेल गिनती के लिए सटीक पता लगाने की सीमा से परे है तो सेल सस्पेंशन को और पतला करने की जरूरत है ।
  8. एक डाई है कि ऐसे trypan नीले रंग के रूप में मृत कोशिकाओं, शामिल है का उपयोग करना, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती और ब्याज की कुप्पी या थाली में BTSCs बीज-आम तौर पर, २००,०००-एक T25 कुप्पी में पूरा मीडिया के 8 मिलीलीटर में ३००,००० कोशिकाओं ।

2. ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल माइग्रेशन परख

  1. बीज २००,००० पूरा मीडिया के 8 मिलीलीटर में एक T25 कुप्पी में सेल 1-2 सप्ताह के लिए एक प्रवास परख प्रदर्शन की योजना बना पहले ।
    नोट: चढ़ाना और परख प्रदर्शन के बीच समय BTSC संस्कृति के विकास दर के आधार पर भिंन होगा इस्तेमाल किया ।
    1. माइग्रेशन पर किसी औषध उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, उपयुक्त वाहन, जैसे DMSO के साथ कोशिकाओं का इलाज, और ब्याज की दवा कोशिकाओं से युक्त मीडिया के अलग कुओं में सीधे वाहन या दवा शेयर के लागू संस्करणों को जोड़कर.
  2. chemotaxis माइग्रेशन प्लेट (चित्रा 2a) इसे कोलेजन की एक पतली परत के साथ कोटिंग द्वारा तैयार करें ।
    1. एक ९६ के कुओं की संख्या की गणना-अच्छी तरह से chemotaxis प्लेट कि कोलेजन के साथ लेपित करने की आवश्यकता होगी । प्रत्येक शर्त के लिए कम से कम तीन दोहराने कुओं शामिल हैं ।
    2. पतला 5 प्रकार मैं कोलेजन को ०.२ मिलीग्राम/एमएल शुद्ध एसिटिक एसिड में ०.१४% से संस्कृति ग्रेड पानी में पतला के शेयर के मिलीग्राम/
    3. पिपेट ०.२ मिलीग्राम/दोनों झिल्ली डालने के कुओं और नीचे जलाशय कुओं है कि इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए कोलेजन की एमएल ।
      नोट: प्लेट के नीचे जलाशयों २२५ µ एल की आवश्यकता होती है और झिल्ली डालने कुओं एक उचित कोटिंग के लिए कोलेजन के ७५ µ एल की आवश्यकता होती है ।
    4. एक मशीन में ३७ ° c में माइग्रेशन प्लेट प्लेस 1 h. महाप्राण कोलेजन कोटिंग खरोंच के बिना कुओं से कोलेजन समाधान के लिए ।
    5. बाँझ 1x पंजाबियों के साथ कुओं 2x धो लो । अगर प्लेट अभी इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, तो पंजाबियों को महाप्राण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 हफ्तों तक स्टोर करें । उपयोग करने से पहले, कमरे के तापमान के लिए chemotaxis माइग्रेशन प्लेट गर्म ।
  3. chemotaxis माइग्रेशन प्लेट का निचला जलाशय तैयार करें ।
    1. पिपेट २२५ मीडिया के µ एल (विकास कारकों के बिना), एक chemoattractant के रूप में 10% FBS के साथ पूरक, नीचे chemotaxis माइग्रेशन प्लेट के जलाशय कुओं के लिए ।
    2. धीरे बुलबुले बनाने से बचने के लिए एक कोण पर नीचे जलाशय में झिल्ली डालने जगह ।
  4. कोशिकाओं chemotaxis माइग्रेशन प्लेट की झिल्ली डालने में प्लेट ।
    1. ५०,००० कोशिकाओं की एक कोशिका घनत्व पर मीडिया में (विकास कारकों के बिना) असंबद्ध BTSCs resuspend/ मीडिया के लिए ड्रग्स जोड़ें यदि विभिंन दवा उपचार के दौरान प्रवास का आकलन । वैकल्पिक रूप से, बीज पूर्व इलाज कोशिकाओं और नियंत्रण कोशिकाओं के बराबर संख्या है, जबकि अंतिम दवा एकाग्रता को बनाए रखने जब चढ़ाना ।
    2. प्लेट ५० वांछित उपचार की स्थिति के तहत माइग्रेशन प्लेट के प्रत्येक कुआं में कदम 2.4.1 से BTSCs के µ एल ।
  5. इमेज chemotaxis प्रवास.
    1. live-सेल इमेजिंग सिस्टम में chemotaxis माइग्रेशन प्लेट प्लेस करें और स्वचालित इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट करने के लिए प्लेट की सूक्ष्म छवियां हर 1-2 एच के लिए ७२ h. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें), पर राइट-क्लिक करें समयरेखा और स्कैन अंतराल सेट करने के लिए हर 2 h के लिए 24 h.
      नोट: समय अंतराल और कुल बीता हुआ समय BTSC संस्कृतियों के बीच भिंन होगा; ७२ के लिए 2 एच अंतराल के साथ शुरू करें जब तक अनुभव व्यक्तिगत BTSC संस्कृतियों के साथ प्राप्त किया गया है । यदि एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली अनुपलब्ध है, तो देखने के एक ही क्षेत्र की छवियों को एक खुर्दबीन और एक कैमरा इमेजिंग सॉफ्टवेयर से जुड़े के साथ मैंयुअल रूप से प्राप्त किया जा सकता है ।
    2. एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, पूरे प्रयोग के लिए छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि झिल्ली की पृष्ठभूमि और प्रवास pores (चित्रा बी, लाल मुखौटा) से अलग कोशिकाओं का उपयोग कर एक प्रसंस्करण परिभाषा बनाने . वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), एक नई प्रोसेसिंग परिभाषा का चयन करें और ५२ के एक बीज दहलीज के लिए BTSCs के लिए प्रसंस्करण परिभाषा सेटिंग्स सेट, ८५ की एक वृद्धि दहलीज , आकार के समायोजन (पिक्सल) द्वारा-1, और २०० माइक्रोन2के एक ंयूनतम क्षेत्र । झिल्ली के नीचे की ओर करने के लिए इस प्रसंस्करण परिभाषा लागू करें । इस विश्लेषण को संशोधित करें यदि यह सही पृष्ठभूमि झिल्ली से कोशिकाओं को भेद नहीं है ।
    3. तीन कुओं, जो केवल कोशिकाओं है कि pores के माध्यम से चले गए है गिनती के प्रत्येक के लिए झिल्ली के नीचे की ओर पर सेल सतह क्षेत्र के रूप में डेटा इकट्ठा । ग्राफ़ समय (आकृति 2cचित्रा 3) के साथ माइक्रोन2 (कोशिकाओं के क्षेत्र में माइग्रेट) में कोशिकाओं का माइग्रेशन.
      नोट: सुनिश्चित करें कि मढ़वाया कोशिकाओं की सापेक्ष संख्या और पहली बार बिंदु पर झिल्ली की ऊपरी सतह पर गिना समान है (सभी कुओं में कम 20% भिंनता) सभी उपचार शर्तों के बीच असमान चढ़ाना के किसी भी प्रभाव से बचने के लिए । वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा संग्रह ( सामग्री की तालिकादेखें) चरण 2.5.2 में बनाई गई प्रोसेसिंग परिभाषा शुरू करके निष्पादित की जा सकती है, मैट्रिक्सपर क्लिक करके, फिर ग्राफ़/निर्यातपर, और फिर डेटा निर्यात पर .

3. ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल Neurosphere आक्रमण परख

  1. बीज २००,००० एक T25 कुप्पी में पूरा मीडिया के 8 मिलीलीटर 1-2 सप्ताह में एक आक्रमण परख प्रदर्शन की योजना बना पहले कोशिकाओं ।
    नोट: समय को परख प्रदर्शन के लिए चढ़ाना से BTSC संस्कृति के प्रसार दर पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया ।
    1. पूर्व निर्धारित समय पाठ्यक्रम के लिए वांछित एकाग्रता पर कुप्पी के लिए ब्याज की यौगिक जोड़ने के लिए, पहले से ही neurospheres आक्रमण के लिए चढ़ाया जा करने के लिए तैयार हैं ।
  2. औसत neurosphere आकार तक प्रतीक्षा करें लगभग १५०-२०० माइक्रोन; आमतौर पर, यह 7-14 डी लेता है, BTSC संस्कृति के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है ।
    नोट: यह ठेठ है कुप्पी में क्षेत्र आकार के वितरण का निरीक्षण करने के लिए ।
  3. टिप और धीरे एक पिपेट के साथ कुप्पी मिश्रण और BTSC neurospheres के ५०० μL कदम प्रत्येक उपचार हालत के लिए एक १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए; यह तीन दोहराने कुओं थाली के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: चरण 3.3.1-3.3.2 वैकल्पिक हैं, लेकिन एक नई BTSC संस्कृति पर प्रथम आक्रमण प्रयोग के लिए अनुशंसित ।
    1. neurospheres है कि अच्छी तरह से खत्म हो जाएगा के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, ३.३ कदम के रूप में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब तैयार करते हैं । धीरे neurospheres मिश्रण और एक अलग ९६ में १०० μL कदम अच्छी तरह से थाली और neurospheres 5 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. माइक्रोस्कोप के तहत neurospheres की संख्या की जाँच करें सुनिश्चित करने के लिए एकाधिक neurospheres के क्षेत्र में हैं अच्छी तरह से है कि यह भीड़ के बिना छवि हो जाएगा.
      नोट: हमलावर neurospheres पर्याप्त कमरे पड़ोसी neurospheres के साथ बातचीत के बिना व्यास में ट्रिपल करने की आवश्यकता है । neurospheres की संख्या प्रति कुआं neurospheres की संख्या की गणना करके समायोजित किया जा सकता है और T25 कुप्पी से अधिक या कम neurospheres जोड़ने के लिए १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब चरण ३.३ में ।
  4. बर्फ पर ३.३ कदम से कोशिकाओं के साथ १.५ एमएल शंकु ट्यूब प्लेस और बर्फ पर ३.५-३.७ कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  5. neurospheres 5 मिनट के लिए १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसा है और बर्फ पर एक लेबल ९६ अच्छी तरह से थाली ठंडा ।
  6. extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन में neurospheres resuspend ।
    1. एक ०.४ मिलीग्राम/एमएल प्रकार के ५०० μL तैयार प्रत्येक उपचार हालत के लिए बर्फ पर मैं कोलेजन समाधान: जोड़ें ४५९ मीडिया के μL (विकास कारकों के बिना), ४० के μL 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर कोलेजन स्टॉक समाधान, और μL बाँझ 1N NaOH (तालिका 1) के ०.९२ ।
      नोट: ५०० कोलेजन समाधान के μL उपचार की हालत के प्रति आवश्यक है: प्रत्येक तीन कुओं और २०० μL के अतिरिक्त की नकल के लिए १०० μL । दवा उपचार की जरूरत है यहां वांछित अंतिम एकाग्रता पर जोड़ा, समाधान के मीडिया घटक से घटाया । इस प्रोटोकॉल प्रकार मैं extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के रूप में कोलेजन का उपयोग का वर्णन; हालांकि, किसी भी extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन का परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, BTSC संस्कृतियों है कि आक्रमण की धीमी दरों, विकास कारकों या FBS मीडिया में पूरक किया जा सकता है के लिए आक्रमण की दर को बढ़ाने के लिए ।
    2. ३.५ कदम से neurospheres के बाद बसे हैं, महाप्राण के रूप में संभव के रूप में मीडिया के ज्यादा neurosphere गोली है कि नीचे बसे है खोने के बिना । धीरे 3.6.1 चरण में तैयार कोलेजन समाधान के ५०० μL में neurospheres resuspend ।
  7. जोड़ें १०० कोलेजन और neurosphere मिश्रण के तीन μL के कुओं को दोहराने की ९६-बर्फ पर अच्छी तरह से प्लेट । neurospheres 5 मिनट के लिए बर्फ पर बसने के लिए अनुमति दें ।
  8. 5 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए ९६-अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण कोलेजन बहुलकीकरण के लिए अनुमति देते हैं ।
  9. तुरंत ९६-अच्छी तरह से थाली छवि को तैयार ।
    1. एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली की ट्रे में या चढ़ाना के समय neurosphere आकार के लिए एक संदर्भ के रूप में एक छवि प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के मंच पर ९६-well थाली प्लेस, इससे पहले कि आक्रमण शुरू होता है ।
    2. हर घंटे छवियों को प्राप्त आक्रमण की दर पठारी है जब तक; सामांयतया, यह 24 घंटे के भीतर होती है ।
      नोट: इमेजिंग अंतराल संशोधित किया जा सकता उपकरणों के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है । इमेजिंग अंतराल और कुल बीता समय भी BTSC संस्कृतियों कि आक्रमण के विभिंन दरों है के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
  10. BTSCs की बढ़ती सतह क्षेत्र का निर्धारण के रूप में वे समय के साथ मैट्रिक्स आक्रमण ।
    नोट: चढ़ाना के समय में कोशिकाओं की सतह क्षेत्र, तीन दोहराने कुओं के अर्थ के रूप में गणना की, समान होने की जरूरत है (सभी कुओं में 20% से कम भिंनता) BTSC आक्रमण में अंतर सुनिश्चित करने के लिए विभिंन उपचार शर्तों के बीच नहीं है neurospheres चढ़ाया की संख्या या आकार से दृढ़ता से प्रभावित ।
    1. लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली के लिए, छवि अधिग्रहण के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग करें और अच्छी तरह से प्रति चार छवियों को प्राप्त करने के लिए तीन दोहराने कुओं । सापेक्ष कोशिका सतह क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, अच्छी तरह से प्रतिशत संगम के रूप में प्रतिनिधित्व किया, एक प्रसंस्करण परिभाषा है कि विशेष रूप से अच्छी तरह से कोशिकाओं की पृष्ठभूमि पर प्रकाश डाला गया सेट । वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), एक नई प्रोसेसिंग परिभाषा का चयन करें और ०.८ के लिए विभाजन समायोजन सेट, ३०० माइक्रोन2के लिए क्षेत्र ंयूनतम, और सनकी अधिकतम करने के लिए ०.९९ । इस विश्लेषण को संशोधित करें यदि यह पृष्ठभूमि से कक्षों को सही तरीके से भेद नहीं करता है ।
      नोट: यदि समय के साथ छवि neurosphere आक्रमण के लिए अंय तरीकों का उपयोग कर, यह तीन समय के साथ दोहराने कुओं के लिए देखने के कई क्षेत्रों को प्राप्त करने की सिफारिश की है । हालांकि, नहीं इमेजिंग प्रत्येक अंतराल पर देखने के सटीक एक ही क्षेत्र डेटा एकत्र की मानक त्रुटि में वृद्धि होगी । कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के लिए प्रत्येक छवि में हमलावर कोशिकाओं की सतह क्षेत्र को मापने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. कुल सेल सतह क्षेत्र के रूप में डेटा इकट्ठा (या तो रिश्तेदार या निरपेक्ष) हर एक बार बिंदु पर अच्छी तरह के लिए और तीन कुओं की नकल का मतलब निर्धारित करते हैं । ग्राफ समय के साथ बढ़ती सेल क्षेत्र की साजिश रचने के द्वारा BTSCs के आक्रमण ।
      नोट: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा संग्रह ( सामग्री की तालिकादेखें) चरण 3.10.1 में बनाई गई प्रोसेसिंग परिभाषा शुरू करके निष्पादित की जा सकती है, मैट्रिक्सपर क्लिक करके, फिर ग्राफ़/निर्यातपर, और फिर डेटा निर्यात पर .

Representative Results

यहां, हम डेटा के उदाहरण है कि लाइव सेल इमेजिंग परख का उपयोग करने BTSC प्रवास और आक्रमण का अध्ययन प्राप्त किया जा सकता है का वर्णन । BTSCs एकल कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया जाता है और मुक्त अस्थाई neurospheres (चित्रा 1) के रूप में उगाया जा सकता है । हम बताते है कि BTSCs असंबद्ध और एक chemotaxis माइग्रेशन प्लेट कि प्रकार मैं कोलेजन (चित्रा 2a) की एक पतली परत के साथ लेपित है में झिल्ली डालने के कुओं में चढ़ाया जा सकता है । व्यक्तिगत BTSCs की परख की शुरुआत में झिल्ली डालने के शीर्ष पर समान रूप से फैला रहे हैं । 24-72 घंटे की अवधि में, कोशिकाओं झिल्ली का पालन, कोलेजन लेपित सतह के साथ कदम है, और ९६ छोटे में से एक के माध्यम से विस्थापित झिल्ली के नीचे की ओर pores, जलाशय में एक chemoattractant की ओर अच्छी तरह से । के बाद पीले रंग में झिल्ली के ऊपर कोशिकाओं पर प्रकाश डाला, नीले रंग में pores, और लाल रंग में झिल्ली के तल पर कोशिकाओं, कोशिकाओं को ऊपर (पीले एक नीला ताकना आ कोशिका) पर ताकना में प्रवेश कर देखा जा सकता है और नीचे (लाल कोशिका बाहर निकलने पर ताकना बाहर निकलने नीले ताकना) (चित्रा 3) आईएनजी । महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं को दवा का इलाज किया और वाहन के रूप में एक ही chemotaxis माइग्रेशन प्लेट में चढ़ाया जा सकता है नियंत्रण कोशिकाओं BTSC प्रवास (चित्रा बी) पर उपचारात्मक हस्तक्षेप के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए । chemotaxis माइग्रेशन प्लेट दोनों शीर्ष पर और झिल्ली डालने के तल पर कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इसलिए, समय के साथ कक्ष माइग्रेशन की ठहराव झिल्ली (चित्र 2c) के नीचे की ओर माइग्रेट किए गए कक्षों की गणना करके संभव है.

हमने पाया है कि अगर BTSCs पूरी तरह से असंबद्ध नहीं कर रहे हैं, तो कोशिकाओं pores के माध्यम से विस्थापित नहीं है और छोटे neurospheres (चित्र 4a) के रूप में रहते हैं । यह भी महत्वपूर्ण है प्लेट नहीं २,५०० से अधिक BTSCs/अच्छी तरह के रूप में इस परिणाम के रूप में कक्ष में झुरमुट के बजाय पलायन में झिल्ली के नीचे की ओर (चित्रा 4B) । अंत में, यह झिल्ली डालने के कुओं में बुलबुले बनाने से बचने जब कोशिकाओं चढ़ाना और जब नीचे जलाशय पर झिल्ली डालने रखने के रूप में यह सही इमेजिंग और ठहराव (आंकड़ा 4c) को रोकता है, को रोकने के लिए आवश्यक है ।

अगले, हम बताते है कि BTSC आक्रमण, neurospheres से आसपास के मैट्रिक्स में, और imaged किया जा सकता है एक ९६ में समय के साथ अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप (आंकड़ा 5 ए) । आक्रमण कोशिकाओं की सतह क्षेत्र को बढ़ाता है के रूप में वे समय के साथ मैट्रिक्स आक्रमण द्वारा मापा जा सकता है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक प्रसंस्करण परिभाषा लागू किया गया था कि सेल सतह क्षेत्र है, जो समय पर स्वचालित ठहराव के लिए अनुमति देता है पर एक मुखौटा ओवरले (चित्रा 5B). समय चूक BTSC हमलों के वीडियो भी बनाया जा सकता है, आसानी से BTSC आक्रमण (चित्रा 6) की समग्र प्रक्रिया का पालन करें । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवि BTSCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त । यहां, हम GFP के एक cytosolic फार्म व्यक्त BTSCs की एक समय चूक वीडियो बनाया है के लिए व्यक्तिगत BTSCs ट्रैक के रूप में वे एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स आक्रमण (7 चित्रा) । इस BTSC neurosphere आक्रमण परख भी दवा उपचार के लिए अनुमति देता है को दोहराने कुओं में जोड़ा जा करने के लिए सीधे एक मैट्रिक्स (चित्रा 8A) में neurospheres से BTSC आक्रमण पर उनके प्रभाव का आकलन । दोहराने कुओं में एकाधिक neurospheres के ठहराव की गणना की जा सकती है और समय के साथ ग्राफ कई सांद्रता पर दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए (चित्रा 8B).

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने में विफलता विश्वसनीय और सही डेटा प्राप्त करने के लिए एक अक्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एंबेडिंग BTSC neurospheres है कि बहुत बड़े हैं, एक व्यास से अधिक २०० µm के साथ, ध्यान के एक विमान की ओर जाता है कि सही दृश्य (चित्रा 8C) के एक क्षेत्र में सभी क्षेत्रों को बढ़ाता है बहुत बड़ा है । इसी तरह, 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स बनाए रखने में विफलता neurospheres embedding भी क्षेत्रों है कि ध्यान के एक ही विमान पर नहीं कर रहे है और एक extracellular मैट्रिक्स है कि समान रूप से जम नहीं है, जो सटीक डेटा के संग्रह को रोकता है का नेतृत्व कर सकते है (चित्रा 8D ).

Figure 1
चित्रा १: संवर्धन BTSCs. इन पैनलों एकल कोशिकाओं से हो BTSCs का एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए संस्कृति में एक 14 डी अवधि से अधिक neurospheres हैं । 14 दिन में यहां दिखाया neurospheres passaging के लिए एक उपयुक्त आकार के हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: लाइव सेल एक BTSC प्रवास के इमेजिंग । (क) यह एक ९६ का एक उदाहरण है अच्छी तरह से chemotaxis प्रवासन प्रकार की एक पतली परत के साथ लेपित थाली मैं कोलेजन से पहले BTSCs के साथ प्रवास परख प्रदर्शन । छवियां दिखाएं i) सभी तीन भागों के साथ एक थाली (ढक्कन, झिल्ली डालने, और जलाशय) एक साथ रखा, ii) सभी तीन भागों अलग, iii) झिल्ली डालने के शीर्ष दृश्य के एक क्लोज़ अप छवि, iv) झिल्ली डालने के नीचे देखने की एक क्लोज़ अप छवि , और वी) नीचे जलाशय की एक क्लोज़ अप छवि । (ख) ये प्रयोग के प्रारंभ (0 एच) में एक BTSC प्रवास की प्रतिनिधि छवियां है और 24 एच । छवि फोकस जहां कोशिकाओं को मूल रूप से चढ़ाया गया झिल्ली डालने के शीर्ष पर है । chemotaxis माइग्रेशन प्लेट के निचले भाग में माइग्रेट किए गए कक्षों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है. 0 एच में, कुछ कोशिकाओं को झिल्ली के नीचे की ओर चले गए हैं । 24 ज के बाद, माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या में नाटकीय वृद्धि हुई है । एक वाहन बनाम ड्रग एक्स के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए 24 ज में छवियों की तुलना दर्शाता है कि दवा उपचार BTSC प्रवास कम हो जाती है । स्केल बार्स ६०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ग) यह पैनल किसी वाहन या ड्रग एक्स के साथ पूर्व उपचार के बाद एक BTSC प्रवास के ठहराव को दिखाता है. ग्राफ से पता चलता है कि दवा उपचार BTSCs के प्रवास पर एक मजबूत प्रभाव है । डेटा अंक तीन तकनीकी दोहराने कुओं का मतलब है, और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
एनिमेटेड आंकड़ा 3: BTSC माइग्रेशन समय चूक वीडियो । यह वीडियो एक प्रकार मैं कोलेजन-लेपित chemotaxis माइग्रेशन प्लेट का उपयोग कर BTSCs के प्रवास से पता चलता है । झिल्ली डालने के शीर्ष पर कोशिकाओं पीले रंग में प्रकाश डाला जाता है, झिल्ली डालने के नीचे करने के लिए माइग्रेट किया है कि कोशिकाओं को लाल रंग में प्रकाश डाला है, और झिल्ली में pores नीले रंग में डाला जाता है । ध्यान के विमान झिल्ली के नीचे की ओर छवि कोशिकाओं के लिए सेट है । वीडियो ५१ एच के लिए हर घंटे लिया और प्रति सेकंड 4 तख्ते पर संकलित समय-चूक छवियों का उपयोग कर बनाया गया था. स्केल बार २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 4
चित्रा 4: माइग्रेशन परख सेट-अप में त्रुटियों के उदाहरण । (क) इस पैनल BTSCs है कि पूरी तरह से असंबद्ध chemotaxis माइग्रेशन प्लेट के शीर्ष झिल्ली डालने पर चढ़ाना करने से पहले नहीं थे का एक उदाहरण से पता चलता है । क्षेत्रों के बड़े आकार और झिल्ली के छोटे आकार के कारण pores, कोशिकाओं को नीचे जलाशय में स्थानांतरित करने में असमर्थ हैं । (ख) इस पैनल के एक प्रवास परख का एक उदाहरण से पता चलता है जहां बहुत अधिक कोशिकाओं को चढ़ाया गया । कोशिकाओं के झुरमुट कोशिका प्रवास और बिगड़ा ठहराव के साथ हस्तक्षेप । (ग) इस पैनल BTSCs जहां चढ़ाया गया झिल्ली डालने पर बुलबुला गठन का एक उदाहरण से पता चलता है । बुलबुले खराब छवि गुणवत्ता में परिणाम और प्रवास का एक सटीक ठहराव को रोकने के । स्केल पट्टियां ६०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: BTSC neurosphere आक्रमण परख । इन पैनलों एक 6 एच अवधि में एक ०.४ मिलीग्राम/मिलीलीटर प्रकार मैं कोलेजन मैट्रिक्स में एक neurosphere से हमला BTSCs का एक उदाहरण दिखाते हैं । यहां, (क) प्रत्येक समय पर चरण कंट्रास्ट छवियां बिंदु दिखाया (ख) प्रतिनिधि मात्रात्मक मुखौटा के साथ मढ़ा, के रूप में प्रोटोकॉल चरण 3 में विस्तार से वर्णित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: BTSC neurosphere आक्रमण समय चूक वीडियो प्रकार में मैं कोलेजन । इस वीडियो में एक neurosphere से BTSCs के एक आक्रमण से पता चलता है एक ०.४ मिलीग्राम/मिलीलीटर प्रकार मैं कोलेजन मैट्रिक्स (यह भी चित्र 5में अभी भी चित्र के रूप में दिखाया गया है) । छवियों को एक 10x उद्देश्य हर घंटे का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे 12 ज और प्रति सेकंड 4 तख्ते पर संकलित कर रहे हैं । स्केल बार ३०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 7
चित्रा 7: एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स में BTSC neurosphere आक्रमण समय चूक वीडियो । इस वीडियो BTSCs के एक आक्रमण से पता चलता है, कि एक्सप्रेस cytosolic GFP, एक neurosphere से एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स में । छवियों ४८ घंटे के लिए एक 4x उद्देश्य हर 30 मिनट का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया और प्रति सेकंड 8 तख्ते पर संकलित किया गया । स्केल बार ८०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 8
चित्र 8: उपचार के साथ BTSC neurosphere आक्रमण परख । (क) BTSC neurospheres एक तहखाने झिल्ली में एंबेडेड थे-वाहन या दवा एक्स छवियों के संकेत सांद्रता के साथ तैयार मैट्रिक्स की तरह हर घंटे का अधिग्रहण किया गया; यहां दिखाया गया है छवियों चढ़ाना के समय में लिया और 16 के बाद एच । स्केल बार २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) आसपास के मैट्रिक्स में neurospheres से BTSCs के एक आक्रमण हर घंटे quantified था, के रूप में प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित है । डेटा अंक तीन तकनीकी दोहराने कुओं का मतलब है, और त्रुटि पट्टियों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) इस पैनल से पता चलता है BTSC neurospheres प्रकार में एंबेडेड मैं एक क्षेत्र है कि ठहराव के लिए बहुत बड़ा है के साथ कोलेजन । स्केल बार ३०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । (घ) इस पैनल BTSC प्रकार मैं कोलेजन कि पूरी तरह से सेट नहीं किया neurospheres में एंबेडेड दिखाता है । स्केल बार ३०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

कोलेजन समाधान तैयारी
स्टॉक [कोलेजन] (मिलीग्राम/ 5
अंतिम [कोलेजन] (mg/ ०.४
कुओं की जरूरत की संख्या: 5
कुल मात्रा (μl) ५००
स्टॉक कोलेजन की मात्रा (μl) ४०
1N NaOH (μl) की मात्रा ०.९२
मीडिया की मात्रा (μl) ४५९

तालिका 1:०.४ मिलीग्राम/एमएल प्रकार मैं कोलेजन समाधान की तैयारी । सूचीबद्ध ज्ञात शुरू और वांछित प्रकार मैं कोलेजन समाधान के अंतिम सांद्रता रहे हैं । सूचीबद्ध खंडों में प्लेट neurospheres करने के लिए पर्याप्त है तीन खंड दोहराने कुओं, अधिक से अधिक दो, और एक एकल उपचार शर्त शामिल कर सकते हैं, के रूप में प्रोटोकॉल चरण 3 में विस्तार से वर्णित है ।

Discussion

यह देखते हुए कि कैंसर की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से proliferating हैं, यह सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक संभावित तकनीकी चुनौती बन गया है । प्रवास परख यहां वर्णित के लिए, BTSCs विकास कारकों, जो प्रसार सीमा के बिना चढ़ाया जाता है, और chemotaxis प्लेट के chemoattractant ढाल पूरी तरह से ७२ घंटे से अधिक नहीं equilibrate । इसके अलावा, के रूप में कोशिकाओं को समय के साथ रहते सेल इमेजिंग का उपयोग कर निगरानी की जा रही है, कोशिकाओं नेत्रहीन व्यापक कोशिका विभाजन सुनिश्चित करने के लिए नहीं होने वाली निगरानी की जा सकती है । प्रवास परख की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए neurospheres पूरी तरह से एकल कोशिकाओं को अलग कर देना और सही सेल संख्या चढ़ाना से पहले गिनती । क्षेत्रों चढ़ाना या भी कई कोशिकाओं चढ़ाना, जो का झुरमुट में परिणाम, छोटे pores (चित्रा 4a और 4B) के माध्यम से पलायन से कोशिकाओं को रोका जा सकता है । यह भी जब chemotaxis माइग्रेशन प्लेट में कोशिकाओं चढ़ाना या जब नीचे जलाशय पर झिल्ली डालने रखने बुलबुले बनाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । बुलबुले ध्यान के विमान बदल सकते हैं और सही ठहराव (चित्रा 4c) को रोकने के. पूरी थाली कोलेजन की एक पतली परत के साथ लेपित होने की जरूरत है क्योंकि यह कोशिकाओं को एक सतह पर नेविगेट करने के लिए थाली में pores देता है, के रूप में इस परख कोशिकाओं का पालन करने के लिए और फिर chemoattractant की ओर एक जैविक रूप से प्रासंगिक सतह भर में माइग्रेट करने की आवश्यकता है ।

यहां वर्णित BTSC माइग्रेशन प्रोटोकॉल अलग-अलग सेल माइग्रेशन के काइनेटिक आकलन के लिए अनुमति देता है, मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में विभिन्न उपचार शर्तों के परीक्षण के लिए कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है । यह संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है कि बहुत धीमी गति से बढ़ने के रूप में यह प्रयोग के लिए कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में इकट्ठा करने के लिए मुश्किल हो सकता है । chemotaxis प्रवास प्लेट की कम ताकना घनत्व chemoattractant ढाल की एक धीमी equilibration के लिए अनुमति देता है, अधिक से अधिक ७२ ज, और अधिक प्रभावी ढंग से समय की एक लंबी अवधि में chemotactic प्रवास की जैविक प्रक्रिया की नकल । प्रोटोकॉल के लिए chemotaxis माइग्रेशन प्लेट पर कोलेजन कोटिंग की एक बहुत पतली परत को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि परख और प्रवास नहीं आक्रमण उपायों । यह भी इमेजिंग और एकल कोशिकाओं के ठहराव की सुविधा के रूप में वे कोलेजन मैट्रिक्स कोटिंग झिल्ली डालने के लिए पालन । हालांकि, तकनीक की एक सीमा है कि समय के साथ कई कुओं में प्रवास के ठहराव बहुत सरल है और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर शीघ्र ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रवास परख का एक उल्लेखनीय लाभ के रूप में यहां वर्णित अंय प्रकार के सेल के लिए प्रोटोकॉल की व्यापक अनुकूलन क्षमता है । यह सेल लाइनों है कि या तो धीमी गति से बढ़ रहे हैं, का पालन करने के लिए मुश्किल है, या धीरे पलायन के chemotactic प्रवास को बढ़ाता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा ।

BTSC आक्रमण परख की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह neurospheres इकट्ठा करने से पहले वे २०० µm से बड़ा बनने के लिए आवश्यक है । बड़े क्षेत्रों ध्यान केंद्रित है कि लगातार छवि और यों तो (चित्रा 5C) के लिए बहुत बड़ा है की एक विमान है । इसके अलावा, neurospheres अंय neurospheres के साथ झुरमुट और समग्र करने के लिए शुरू कर सकते हैं । यह सटीक और सुसंगत डेटा के अधिग्रहण को प्रभावित करता है । इसके अलावा, यह आवश्यक है कि neurospheres को अच्छी तरह के तल पर बसने की अनुमति दी जाती है, जबकि कोलेजन बर्फ पर अभी भी है, neurospheres की अनुमति के लिए ध्यान की एक एकल विमान में छवि है (चित्रा 5d) । इसी तरह, यह कोलेजन पूरी तरह प्लेट चलती के रूप में यह एक भी मैट्रिक्स, जो नकारात्मक छवि गुणवत्ता (चित्रा 5d) को प्रभावित कर सकता है के गठन को बाधित कर सकते है बिना सेट करने की अनुमति महत्वपूर्ण है । BTSC आक्रमण परख के लिए यहां वर्णित है, प्रमुख लाभ में से एक यह है कि neurospheres के रूप में BTSCs संस्कृति के लिए सीधे आक्रमण के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, की आवश्यकता के बिना हो adherently । इसके अलावा, BTSC neurospheres किसी भी extracellular मैट्रिक्स में एंबेड किया जा सकता है, या तो एक विशिष्ट ऊतक से extracellular मैट्रिक्स के व्यक्तिगत घटकों का उपयोग कर या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली मिश्रण का उपयोग कर । extracellular मैट्रिक्स को निर्दिष्ट करने की पहचान करने या आक्रमण के विशिष्ट तंत्र का परीक्षण करने में मदद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के साथ, यह जीन है, जो विशिष्ट मैट्रिक्स घटकों को नीचा करने के लिए जाना जाता है के मैट्रिक्स metallopeptidase परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों को लक्षित करने के प्रभाव का आकलन संभव है । वैकल्पिक रूप से, हालांकि इस प्रोटोकॉल BTSC neurospheres के लिए विशिष्ट है, क्षेत्रों के रूप में उगाया किसी भी कोशिकाओं को एक समान फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण स्तन कैंसर mammospheres या प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर tumorspheres के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं में शामिल; हालांकि, इस तकनीक को एक संस्कृति में क्षेत्रों के रूप में विकसित कर सकते है कि कोशिका प्रकार को सीमित करता है । दोनों प्रवास और आक्रमण परख के अंय लाभ है कि वे स्थापित करने के लिए आसान कर रहे हैं, वे एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में काम करते हैं, और डेटा समय के साथ quantifiable है ।

कुल मिलाकर, आदेश के बाद उपचार जीबीएम पुनरावृत्ति को रोकने के लिए, यह है कि BTSC प्रवास और आक्रमण की जांच की सुविधा के तरीके विकसित करने के लिए आवश्यक है । माइग्रेशन प्रोटोकॉल वर्णित यहां पहले से स्थापित प्रवास परख पर कई लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से जीबीएम BTSCs के अध्ययन के लिए । यह बेहतर माइग्रेशन प्रोटोकॉल dissociating BTSCs neurosphere शर्तों और चढ़ाना एकल कोशिकाओं में एक ९६-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित chemotaxis माइग्रेशन प्लेट के अंतर्गत cultureed शामिल है । एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करना, BTSCs के प्रवास पर नजर रखी जा सकता है और समय के साथ quantified । आक्रमण परख यहां वर्णित एक मैट्रिक्स में neurospheres से BTSC हमलों की निगरानी के लिए अनुमति देता है । यह परख एक कोलेजन मैट्रिक्स, या एक और प्रोटीन से भरपूर extracellular मैट्रिक्स में neurospheres embedding शामिल है, एक ९६ में अच्छी तरह से थाली । एक जीवित सेल समय चूक इमेजिंग प्रणाली के साथ प्लेट की इमेजिंग समय के साथ विभिंन उपचार की स्थिति के तहत BTSC हमलों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इन परख, इसलिए, बेहतर करने के लिए BTSC प्रवास और आक्रमण अंतर्निहित तंत्र को समझने की उंमीद वैज्ञानिकों को एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने उनके तकनीकी समर्थन के लिए Rozina Hassam और Orsolya Cseh का शुक्रिया अदा किया । इस अनुसंधान परियोजना के भाग में नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (एच Artee Luchman और शमूएल Weiss) और कनाडा के स्टेम सेल नेटवर्क (भी एच Artee Luchman और शमूएल Weiss के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
Matrigel matrix Corning 356230
NaOH VWR BDH3247-1
Acetic Acid Millipore Sigma AX0073-6
96-well plates Eppendorf 30730119
T25 Nunc EasYFlask ThermoFisher 156367
Falcon 15ml conical tube ThermoFisher 352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate Essen Bioscience 4582
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System Essen Bioscience 4545
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software Essen Bioscience 2016A Rev1
Accumax cell detachment solution Innovative Cell Technologies AM105
Penicillin, streptomycin  Sigma P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Culture grade water Lonza BioWhittaker 17-724Q
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 12483-020

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References

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Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (138), e58152, doi:10.3791/58152 (2018).

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