Summary
Her beskriver vi live-celle Billeddannende teknikker for at måle kvantitativt migration og invasion af glioblastom hjerne tumor stamceller over tid og flere behandling betingelser.
Abstract
Glioblastom (GBM) er en aggressiv hjernetumor, der styres dårligt med de aktuelt tilgængelige behandlingsmuligheder. Nøglefunktioner i GBMs omfatter hurtig spredning og pervasive invasion i den normale hjerne. Gentagelse menes at skyldes tilstedeværelsen af radio - og kemo-resistent hjerne tumor stamceller (BTSCs) at invadere fra den oprindelige kræft masse og dermed unddrage kirurgisk resektion. Derfor, behandlinger, der er rettet mod BTSCs og deres invasive evner kan forbedre den ellers dårlig prognose for denne sygdom. Vores gruppe og andre har med succes etableret og karakteriseret BTSC kulturer fra GBM patientprøver. Disse BTSC kulturer demonstrere grundlæggende kræft stamceller egenskaber såsom clonogenic selvfornyelse, multi lineage differentiering og tumor indledning i immun-mangelfuld mus. For at forbedre de nuværende terapeutiske tilgange til GBM, er en bedre forståelse af mekanismerne i BTSC migration og invasion nødvendigt. I GBM er undersøgelse af migration og invasion begrænset, dels på grund af begrænsninger af eksisterende teknikker, som ikke fuldt ud højde for in vitro- vækst egenskaber af BTSCs vokset som neurospheres. Her beskriver vi hurtig og kvantitative live-celle imaging assays for at studere både migration og invasion egenskaberne for BTSCs. Den første metode beskrevet er BTSC migration analysen, som måler migration mod et chemoattractant forløb. Den anden metode beskrevet er BTSC invasion assay som billeder og kvantificerer en cellulær invasion fra neurospheres ind i en matrix. Assays beskrevet her bruges til kvantificering af BTSC migration og invasion over tid og under forskellige betingelser.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den mest almindelige og aggressiv form for kræft i hjernen, og trods den aktuelle terapi der indebærer kirurgisk resektion efterfulgt af stråling og kemoterapi, den mediane overlevelse for patienter er en blot 15 måneder1. GBM er invasiv, meget resistente, og i sidste ende, en uhelbredelig sygdom, der kræver fortsatte forskning i dens iboende biologi for at identificere nye terapeutiske muligheder. Den høje dødelighed af GBM patienter er primært forårsaget af den omfattende cellulære invasion i tilstødende normale hjernevæv og migration langs blodkar, der fører til en gentagelse af sygdommen efter behandling2,3 . En delmængde af celler, betegnes hjerne tumor stamceller (BTSCs), der er langsom, cykling og terapeutisk resistente, har været en hypotese for at føre til sygdom tilbagefald. GBM BTSCs se egenskaberne for clonogenic selvfornyelse, multipotency og tumor-indlede potentielle4,5,6. BTSCs også bevare den genetiske, molekylære og fænotypiske heterogenitet af deres overordnede GBM tumorer7,8,9,10. Disse egenskaber gør BTSCs en meget nyttig modelsystem for studiet af GBM og for at udforske nye terapeutiske strategier. In vivo, disse stamceller-lignende celler er i stand til svulst dannelse, vækst og invasion Når implanteret i hjerner af neonatal rotter11 og ikke-overvægtig diabetisk/svær kombineret immundefekt (NOD/SCID) mus4. BTSCs evne til at gentagne gange danne invasive tumorer i vivo at sammenfatte de cellulære og histologiske karakteristika af deres oprindelige tumorer kraftigt støtter deres rolle som tumor-indlede celler12.
Roman terapeutiske tilgange udvikles til indskyde BTSCs og hjælpe med at forbedre den langsigtede resultat for GBM patienter. I øjeblikket, er der begrænset forståelse af de cellulære migration og invasion processer, der er knyttet til terapeutiske modstand og fornyet. Invasion og migration er særskilte fænomener; migration er processen bag bevægelsen styret af celler og indebærer omorganisering af cytoskeleton, adhæsionsmolekyler og montering/afmontering af fokale kontaktpunkter, hvorimod invasion også kræver fysisk destruktion af barrierer som en ekstracellulære matrix13. En bredt accepteret metode til at studere celle migration og invasion er Boyden kammer assay14,15. For denne teknik, er en dobbelt kammer fyldt med medier, med medierne i bunden kammer suppleret med en chemoattractant. Chemotaxis udløses ved hjælp af specifikke vækstfaktorer eller cytokiner eller føtal bovint serum som en ikke-specifik chemoattractant. Efter forløb af chemoattractant celler vandrer gennem den porøse membran. På slutpunktet, kan de migrerede celler visualiseret og kvantificeres på bunden af membranen ved farvning med cytologiske eller fluorescerende farvestoffer. Boyden migration assay kan ændres til en invasion assay med belægning af porøse filter med ekstracellulære matrix komponenter såsom type jeg kollagen eller en basalmembran-lignende matrix. Invasive celler nedbrydes matrix, bevæge sig gennem bunden af filteret porøs og kan kvantificeres på en lignende måde at migration assay. Andre almindeligt anvendte migration assays omfatter bunden sår og celle udelukkelse zone-undersøgelser,13. Scratch sår analysen er udført af skrabe et hul i en cellulær éncellelag og observere migration af celler fra kanten af såret af imaging med jævne mellemrum, indtil bunden er lukket. I celle udstødelse assay, er en fysisk barriere brugt til at oprette en celle-fri zone forud for såning af celler. Barriere er fjernet når cellerne er sammenflydende og migration af celler ind i celle-fri zone er afbildet regelmæssigt16.
Disse etableret tidligere assays anvendes ofte til at studere migration eller invasion af vedhængende og homogen cellepopulationer, men udgør betydelige ulemper, når man studerer GBM BTSCs eller andre heterogene kræft cellepopulationer. Boyden kammer assay kan kun generere slutpunkt målinger versus en kinetisk vurdering af celle bevægelse. En observation over tid er af stor relevans for måling af BTSC migration, da celler fra forskellige kulturer ofte vandrer til forskellige priser. Som sådan, betingelser og timing af analysen skal optimeres for hver kultur og kræver tid-intensiv arbejdskraft til passende prøvetagning og kvantificering. Bunden og celle udelukkelse assays ikke er velegnet til BTSC kulturer, som selv når BTSCs er kulturperler under éncellelag forhold på laminin-belagte plader, vi har observeret, at BTSCs vises modstå bevægelse i det åbne rum og foretrækker at bo i tæt nærhed til andre celler. Desuden etableret disse migration assays ikke tillader for visualisering og overvågning af individuelle celler i et eksperiment. Overvågning af individuelle celler over tid er værdifuld for vurdering af migration i heterogene cellepopulationer, såsom BTSCs. yderligere ulemper af Boyden kammer, bunden og celle-udelukkelse zone assays til BTSC kulturer er der de kræver forholdsvis høje celle numre, kan være tidskrævende at oprette, og enten hurtigt reagensglasset eller ikke har et chemoattractant forløb. Som sådan, er disse assays ikke ideel til brug for sjældne eller langsomt voksende cellepopulationer eller stof screening. Desuden, disse assays er ikke egnet til måling af en invasion i en tre-dimensionelle (3D) format, hvilket er særligt vigtigt for BTSCs dyrket under neurosphere forhold.
Her beskriver vi assays specielt modificeret til observation og kvantificering af migration for enkelte BTSCs, og invasionen af GBM BTSCs kulturperler som neurospheres. Den første analyse beskriver en tilpasning af Boyden kammer analysen ved hjælp af live-celle time-lapse imaging og en chemotaxis migration plade til at måle kemotaktisk celle migration13. Live-celle billeddannelse i et multi godt format giver mulighed for visualisering og kvantificering af celle migration flere behandling betingelser. Den anden assay beskrevet her er en klumpformet invasion assay13,17, hvilke foranstaltninger de invasive egenskaber af BTSCs kulturperler neurosphere betingelser og indlejret i et 3D ekstracellulære matrix under forskellige behandling betingelser. Samlet, disse assays er langt mere kompatible end tidligere beskrevne metoder til at studere de vandrende og invasive egenskaber af heterogene BTSC kulturer. De giver også bedre muligheder for undersøgelse af nye terapeutiske strategier til at målrette mod både migration og invasion, som bidrager betydeligt til sygdom recidiv og dødelighed.
Protocol
1. dyrkning hjerne Tumor stamceller tidligere stammer fra menneskelige glioblastom prøver
Bemærk: BTSC kulturer var tidligere etableret fra menneskelige GBM patientprøver6,7,8,9,10.
- Tø en cryogenically bevarede BTSCs i et bægerglas, der indeholder 70% ethanol, placeret inde i et vandbad ved 37 ° C, lige indtil sidst is er optøet hætteglas. Fortynd de optøede celler i 10 mL af medier i en 15 mL konisk slange og centrifugeres celler på 150 relativ centrifugalkraft (Genbrugsfibre) i 7 min.
Bemærk: I hele disse protokoller, komplet media refererer til standard medier bruges til kultur BTSCs (tidligere beskrevet af Kelly et al.) 6, typisk med vækstfaktorer findes. Medier uden vækstfaktorer refererer til den base medier med alle komponenter, men uden nogen vækstfaktorer, suppleres. - Opsug mediet, resuspend celler i 8 mL af komplette medier og overføre celler og medier til en T25 kolbe.
- Efter 1 uge med dyrkning af ikke-tilhænger betingelser, overvåge kolben dagligt og supplere indholdet med 1-2 mL af komplette medier efter behov, hvis medierne begynder at nedbryder eller begynder at blive sure som angivet ved en farveændring af orange-gul. Passage celler, når neurospheres nå en diameter på cirka 250 μm, typisk mellem 10-14 d (figur 1).
Bemærk: Den fordobling tid af forskellige BTSC kulturer varierer meget. Neurosphere størrelse kan måles ved hjælp af en okulær mikrometer. - For at passage BTSCs, indsamle medierne og neurospheres af pipettering medierne ned overfladen af kolben for at indsamle alle neurospheres og overføre dem til en 15 mL konisk slange og centrifugeres slange i 7 min. ved 150 Genbrugsfibre.
Bemærk: Kolber kan kontrolleres under et mikroskop for at sikre, at alle neurospheres er blevet indsamlet. En ekstra vask med 5 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) eller medier kan udføres for at indsamle enhver resterende neurospheres efter behov. - For at adskille BTSC neurospheres i enkelt celler, Aspirér medierne og tilsættes 1 mL pre varmede celle detachment og inkuberes ved 37 ° C i 7 min. hakkede BTSC suspension 40 x med en P1, 000 mikropipette indstillet på 800 μL.
Bemærk: Celler kan blive udruget længere ved 37 ° C Hvis neurospheres ikke tage afstand. - Der tilsættes 5 mL PBS (med antibiotika penicillin og streptomycin) til de dissocierede BTSCs og centrifugeres celler på 150 Genbrugsfibre i 7 min.
- Opsug supernatanten og resuspend på BTSCs i 1-4 mL af komplette medier, afhængigt af størrelsen på den celle pellet.
Bemærk: Cellesuspension skal fortyndes yderligere hvis koncentrationen er ud over nøjagtige detektionsgrænsen for nøjagtig celle optælling. - Ved hjælp af et farvestof, der udelukker døde celler, såsom trypan blå, tælle antallet af levedygtige celler og seed BTSCs ind i kolbens eller plade af interesse — typisk 200.000-300.000 celler i 8 mL af komplette medier i en T25 kolbe.
2. brain Tumor stamcelle Migration Assay
- Frø 200.000 celler i en T25 kolbe i 8 mL af komplette medier 1-2 uger før planlægger at udføre en migration assay.
Note: Tid mellem plating og udfører analysen vil variere afhængigt af væksten i den BTSC kultur anvendes.- For at teste effekten af en narkotikabehandling for migration, forbehandle celler med passende køretøj, som DMSO og stof af interesse ved at tilføje gældende mængder af køretøjet eller stof lager direkte i separate brønde af medier indeholdende cellerne.
- Forberede chemotaxis migration plade (figur 2A) med belægning med et tyndt lag af kollagen.
- Beregne antallet af huller i en 96-brønd chemotaxis pladen, der skal belægges med kollagen. Omfatte mindst tre Repliker brønde for hver betingelse.
- Fortyndet 5 mg/mL af bestanden af type I-kollagen til 0,2 mg/mL i ren eddikesyre, fortyndet til 0,14% i vand af kultur.
- Der afpipetteres 0,2 mg/mL af kollagen membran Indsæt brønde og de nederste reservoir brønde, der bliver brugt.
Bemærk: Bunden reservoirer for pladen kræver 225 µL og membran Indsæt wells kræver 75 µL af kollagen til en ordentlig belægning. - Sted migration plade i en inkubator ved 37 ° C for 1 h. Aspirér kollagen løsning fra brøndene uden at ridse kollagen belægningen.
- Vaske brønde 2 x med steril 1 x PBS. Hvis pladen ikke er bliver brugt lige med det samme, Aspirér PBS og gemme det ved 4 ° C i op til 2 uger. Før brug, varm chemotaxis migration plade til stuetemperatur.
- Forberede den nederste reservoir af chemotaxis migration plade.
- Afpipetteres 225 µL af medier (uden vækstfaktorer), suppleret med 10% FBS som en chemoattractant nederste reservoir brønde af chemotaxis migration plade.
- Anbring forsigtigt membran Indsæt i bunden reservoiret i en vinkel til at undgå at skabe bobler.
- Plade celler ind i membranen indsætte af chemotaxis migration plade.
- Resuspend adskilles BTSCs i medierne (uden vækstfaktorer) med en celle tæthed på 50.000 celler/mL. Tilføje narkotika til medierne, hvis vurderingen af migration i forskellige medicinske behandlingsmetoder. Skiftevis, frø lige mange forbehandlet celler og kontrol celler, samtidig med at den endelige drug koncentration når plating.
- Plade 50 µL af BTSCs fra trin 2.4.1 i hver brønd i migration pladen betingelser ønskede behandling.
- Billede chemotaxis migration.
- Placer chemotaxis migration plade i live-celle billedbehandlingssystem og indstille automatiseret billedbehandling software at erhverve mikroskopiske billeder af pladen hver 1-2 h for op til 72 h. brug af kommerciel software (Se Tabel af materialer), Højreklik på den tidslinjen og sæt scanning intervallet til hver 2 h 24 h.
Bemærk: Tidsinterval og samlede forløbne tid varierer mellem BTSC kulturer anvendes; Start med 2 h intervaller for 72 h indtil har været erfaringer med enkelte BTSC kulturer. Hvis et automatiseret billedbehandling system er ikke tilgængelig, så billeder af den samme synsfelt kan erhverves manuelt med et mikroskop og en kamera tilsluttet den billedbehandlingsprogrammer. - Når image erhvervelse er fuldført, få billeder til hele eksperimentet og oprette en forarbejdning definition ved hjælp af analysesoftwaren, der adskiller cellerne fra baggrunden af membranen og migration porer (figur 2B, rød maske) . Ved hjælp af kommerciel software (Se Tabel af materialer), Vælg en Ny Definition af forarbejdning og sat behandling definition af indstillingerne for BTSCs til en frø tærskel på 52, en vokse tærskel 85, justeringer af størrelsen (pixels) af -1 og et minimumsareal af 200 μm2. Anvende denne forarbejdning definition på den nederste side af membranen. Ændre denne analyse, hvis det ikke skelner præcist celler fra baggrunden membran.
- Indsamle data som celle areal på den nederste side af membranen for hver af de tre Repliker brønde, som kun tæller de celler, der har migreret gennem porerne. Graf migration af celler i μm2 (område med celler migrerede) over tid (figur 2 C, figur 3).
Bemærk: Sikre, at det relative antal celler forgyldt og tælles på oversiden af membranen for det første tidspunkt lignende (mindre end 20% variation på tværs af alle brønde) mellem alle behandling betingelser for at undgå eventuelle virkninger af ujævn plating. Data samling ved hjælp af den kommerciel programmel (Se Tabel af materialer) kan udføres ved at lancere forarbejdning definitionen skabt taktfast 2.5.2, klikke på målinger, derefter på grafen og eksport, og derefter på dataeksport .
- Placer chemotaxis migration plade i live-celle billedbehandlingssystem og indstille automatiseret billedbehandling software at erhverve mikroskopiske billeder af pladen hver 1-2 h for op til 72 h. brug af kommerciel software (Se Tabel af materialer), Højreklik på den tidslinjen og sæt scanning intervallet til hver 2 h 24 h.
3. brain Tumor Stem Cell Neurosphere Invasion Assay
- Frø 200.000 celler i 8 mL af komplette medier i en T25 kolbe 1-2 uger før planlægger at udføre en invasion assay.
Bemærk: Timing fra plating til at udføre analysen vil afhænge af spredning sats på den BTSC kultur anvendes.- For massiv celler, sammensatte af interesse kolben tilsættes i den ønskede koncentration til forudbestemt tid kursus før neurospheres er klar til at blive forgyldt for invasion.
- Vent indtil den gennemsnitlige neurosphere størrelse er ca 150-200 μm; typisk, det tager 7-14 d, afhængigt af den BTSC kultur bliver brugt.
Bemærk: Det er typisk at observere en distribution af kugle størrelser i kolben. - Tip og forsigtigt blandes kolben med en pipette og flytte 500 μl af BTSC neurospheres til en 1,5 mL konisk slange for hver behandling betingelse; Dette vil blive brugt til plade tre Repliker brønde.
Bemærk: Trin 3.3.1 - 3.3.2 er valgfrit, men anbefales til den første invasion eksperiment på en ny BTSC kultur.- Bestem tætheden af den neurospheres, der vil ende i brønden, forberede en 1,5 mL tube som i trin 3.3. Forsigtigt blandes neurospheres og flytte 100 μL i en separat 96-brønd plade og tillade neurospheres at afregne ved tyngdekraft i 5 min.
- Kontroller antallet af neurospheres under mikroskop for at sikre flere neurospheres er i regionen i brønden, der vil være afbildet uden overbelægning det.
Bemærk: Invaderende neurospheres kræver plads nok at tredoble i diameter uden at interagere med tilstødende neurospheres. Antallet af neurospheres pr. brønd kan justeres ved at tælle antallet af neurospheres pr. brønd og tilføje flere eller færre neurospheres fra T25 kolben til 1,5 mL konisk slange i trin 3.3.
- 1,5 mL konisk glasset med celler fra trin 3.3 anbringes på is og udføre trin 3,5-3,7 på is.
- Lad neurospheres afregne ved tyngdekraft til bunden af 1,5 mL konisk røret i 5 min og prechill et mærket 96-brønd plade på is.
- Resuspend neurospheres i den ekstracellulære matrix protein.
- Forberede 500 μl af en 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen løsning på isen for hver behandling betingelse: tilføje 459 μL af medier (uden vækstfaktorer), 40 μl af 5 mg/mL kollagen stamopløsningen og 0.92 μl sterilt 1N NaOH (tabel 1).
Bemærk: 500 μl af opløsningen kollagen kræves pr. behandling tilstand: 100 μL af hver tre Repliker brøndene og 200 μl af overskydende. Lægemiddelsbehandlinger skal tilføjes her på den ønskede slutkoncentration, trækkes fra medier komponenten i løsningen. Denne protokol beskriver brugen af type I kollagen-som den ekstracellulære matrix protein; men enhver ekstracellulære matrix protein kan testes. Derudover for BTSC kan kulturer, der har langsommere satser for invasionen, vækstfaktorer eller FBS suppleres i medierne til at øge hastigheden af invasionen. - Efter neurospheres fra trin 3.5 er bundfældet, Aspirér så meget af medier som muligt uden at miste de neurosphere pellet, der har afgjort på bunden. Forsigtigt resuspend i neurospheres i 500 μl af den kollagen rengøringsopløsning taktfast 3.6.1.
- Forberede 500 μl af en 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen løsning på isen for hver behandling betingelse: tilføje 459 μL af medier (uden vækstfaktorer), 40 μl af 5 mg/mL kollagen stamopløsningen og 0.92 μl sterilt 1N NaOH (tabel 1).
- Tilsæt 100 μL af kollagen og neurosphere blandingen til tre Repliker pladens huller, 96-brønd på is. Tillade neurospheres at udligne på is i 5 min.
- Overføre 96-brønd plade til 37 ° C inkubator for 5 min at tillade kollagen polymerisering.
- Straks klar til at billede 96-brønd plade.
- 96-brønd pladen anbringes i magasinet af en live-celle billedbehandlingssystem eller på scenen i et mikroskop for at erhverve et billede som en reference for neurosphere størrelse i forbindelse med forkromning, før invasionen begynder.
- Erhverve billeder hver time indtil satsen af invasion har plateaued; Dette sker typisk inden for 24 timer.
Bemærk: Den billeddiagnostiske interval kan ændres afhængig af det udstyr, der anvendes. Den imaging interval og alt er forløbet kan også ændres til BTSC kulturer, der har forskellige satser for en invasion.
- Bestemme den stigende areal af BTSCs, som de invaderer matrix over tid.
Bemærk: Areal af celler på tidspunktet for plating, beregnet som gennemsnittet af tre Repliker wells, skal være tilsvarende (mindre end 20% variation på tværs af alle brønde) mellem de forskellige behandling betingelser at sikre forskelle i BTSC invasion ikke stærkt påvirket af antallet eller størrelsen af den neurospheres, forgyldt.- For live-celle analysesystem, bruge en 10 X mål for image erhvervelse og erhverve fire billeder pr. brønd for tre replikate brønde. Bestem den relative celle areal, repræsenteret som procent sammenløbet af brønden, opsætning af en behandling definition, der specifikt fremhæver cellerne over baggrunden af brønden. Ved hjælp af kommerciel software (Se Tabel af materialer), Vælg en ny Definition af forarbejdning og indstille justeringen segmentering til 0,8, området minimum 300 μm2og excentriciteten maksimum til 0,99. Ændre denne analyse, hvis det ikke skelner præcist celler fra baggrunden.
Bemærk: Hvis du bruger andre metoder til billede neurosphere invasion over tid, er det anbefales at få flere felter i visningen for tre replikate wells over tid. Imidlertid øges ikke tænkelig den nøjagtige samme synsfelt på hvert interval standardfejl for de indsamlede data. Computersoftware kan bruges til at måle arealet af de invaderende celler i hvert billede. - Indsamle data som cellen total areal (relativ eller absolut) for hver brønd ved hvert tidspunkt og bestemme middelværdi af de tre Repliker brønde. Graf invasionen af BTSCs ved at plotte de stigende celle område over tid.
Bemærk: Indsamling af Data ved hjælp af kommerciel software (Se Tabel af materialer) kan udføres ved at lancere forarbejdning definitionen skabt taktfast 3.10.1, klikke på målinger, så på graf/eksport, og derefter på Data eksport .
- For live-celle analysesystem, bruge en 10 X mål for image erhvervelse og erhverve fire billeder pr. brønd for tre replikate brønde. Bestem den relative celle areal, repræsenteret som procent sammenløbet af brønden, opsætning af en behandling definition, der specifikt fremhæver cellerne over baggrunden af brønden. Ved hjælp af kommerciel software (Se Tabel af materialer), Vælg en ny Definition af forarbejdning og indstille justeringen segmentering til 0,8, området minimum 300 μm2og excentriciteten maksimum til 0,99. Ændre denne analyse, hvis det ikke skelner præcist celler fra baggrunden.
Representative Results
Her beskriver vi eksempler på data, der kan opnås ved hjælp af live-celle imaging assays til at studere BTSC migration og invasion. BTSCs er belagte som enkelt celler og kan dyrkes som frit svævende neurospheres (figur 1). Vi viser, at BTSCs kan adskilles og forgyldt i wells af membran indsætte i en chemotaxis migration plade, der er belagt med et tyndt lag af typen jeg kollagen (figur 2A). Enkelte BTSCs er jævnt spredt på toppen af membran-Indsæt i starten af analysen. Over en periode på 24-72 h, celler overholder membranen, flytte langs den kollagen-belagt overflade, og vandrer gennem en af de 96 små porer til den nederste side af membranen, mod et chemoattractant i reservoiret godt. Efter at fremhæve celler på toppen af membranen i gul, porer i blå og celler i bunden af membranen i rød, celler kan ses ind i pore på toppen (gul celle nærmer sig en blå pore) og spændende pore i bunden (rød celle exit ING blå pore) (figur 3). Vigtigere, kan celler være stof-behandlede og forgyldt i samme chemotaxis migration plade som køretøj-behandlede kontrol celler at studere effekten af terapeutiske indgreb på BTSC migration (figur 2B). Chemotaxis migration plade giver mulighed for billeddannelse af celler både på toppen og i bunden af membran Indsæt. Derfor er kvantificering af celle migration over tid muligt ved at tælle de celler, der har migreret til den nederste side af membranen (figur 2 c).
Vi har fundet, at hvis BTSCs ikke er fuldt adskilt, så cellerne ikke vandrer gennem porerne og ikke som små neurospheres (figur 4A). Det er også vigtigt at ikke pladen mere end 2.500 BTSCs/brønd som denne resultater i celle sammenklumpning i stedet for migration til den nederste side af membranen (figur 4B). Endelig er det vigtigt at undgå at komme bobler i membranen indsætte wells når plating celler og Hvornår markedsføring membranen indsætter den nederste reservoir, da dette forhindrer præcis billedbehandling og kvantificering (figur 4 c).
Næste, vi viser at BTSC invasion, fra neurospheres i de omkringliggende matrix, kan afbildet og kvantificeres over tid i en 96-brønd plade format (figur 5A). Invasionen kan måles ved kvantificere areal af cellerne, som de invaderer matrix over tid. Brug billede analyse software, blev en behandling definition anvendt at overlays en maske på cellens overflade område, som giver mulighed for automatisk kvantificering over tid (figur 5B). Time-lapse videoer BTSC invasioner kan også oprettes nemt observere den overordnede proces for en BTSC invasion (figur 6). Derudover kan fluorescerende mikroskopi bruges til billede BTSCs, der udtrykker fluorescerende proteiner, såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller rødt fluorescerende proteiner (RFP). Her har vi lavet en time-lapse video af BTSCs udtrykker en cytosole form for normal god landbrugspraksis for at spore individuelle BTSCs, som de invaderer en basalmembran-lignende matrix (figur 7). Denne BTSC neurosphere invasion analyse giver også mulighed for lægemiddelsbehandlinger tilføjes i Repliker brønde til direkte vurdering af deres virkninger på BTSC invasion fra neurospheres ind i en matrix (figur 8A). Kvantificering af flere neurospheres i Repliker brønde kan beregnes og grafen over tid at vurdere virkningen af lægemidler på flere koncentrationer (figur 8).
Undladelse af at tiltræde protokollen beskrevet ovenfor kan føre til manglende evne til at opnå pålidelige og nøjagtige data. Indlejring BTSC neurospheres, der er for stor, fører med en diameter større end 200 µm, til en planet for fokus, der er for stor til nøjagtigt kvantificere alle kugler i et synsfelt (fig. 8 c). På samme måde, manglende evne til at opretholde matrix ved 4 ° C, mens indlejring af neurospheres kan også føre til kugler, der ikke er på det samme planet for fokus og en ekstracellulære matrix, der ikke er størknet jævnt, som forhindrer indsamling af nøjagtige data (figur 8 d ).
Figur 1: dyrkning af BTSCs. Disse paneler er et repræsentativt eksempel på BTSCs vokset fra enkelt celler til neurospheres over en periode på 14-d i kultur. Neurospheres vist her på dag 14 er af en passende størrelse for passaging. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Live-celle imaging af en BTSC migration. (A) Dette er et eksempel på en 96-brønd chemotaxis migration plade overtrukket med et tyndt lag af type kollagen før du udfører overførslen assay med BTSCs. Billederne viser i) en plade med alle tre dele (låg, membran Indsæt og reservoir) placeret sammen, ii) alle tre dele adskilt, iii) et close-up billede af den øverste visning af membran Indsæt, iv) et close-up billede af visningen bunden af membran Indsæt og v) et close-up billede af den nederste reservoir. (B) disse er repræsentative billeder af en BTSC overførsel fra starten (0 h) af eksperimentet og på 24 h. Billede fokus er på toppen af membran Indsæt hvor cellerne oprindelig var forgyldt. Celler, der er overført til bunden af chemotaxis migration plade er fremhævet med rødt. Ved 0 h, har et par celler migreret til den nederste side af membranen. Efter 24 h, er antallet af overflyttede celler steget dramatisk. Sammenligning af billeder på 24 h for celler behandles med et køretøj vs stof X viser, at behandlingen nedsætter BTSC migration. Den skala barer repræsenterer 600 µm. (C) dette panel viser kvantificering af en BTSC overførsel efter forbehandling med et køretøj eller stof X. Grafen viser, at medicinsk behandling har en stærk effekt på migration af BTSCs. Datapunkterne er gennemsnittet af tre tekniske Repliker brønde, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Animeret figur 3: BTSC migration time-lapse video. Denne video viser migration af BTSCs ved hjælp af en type jeg kollagen-belagt chemotaxis migration plade. Celler på toppen membran Indsæt er fremhævet med gult, celler, der er overført til bunden af membran Indsæt er fremhævet med rødt, og porerne i membranen er fremhævet med blåt. Flyet af fokus er indstillet til billede celler på den nederste side af membranen. Videoen blev oprettet ved hjælp af time-lapse billeder taget hver time for 51 h og sammenstillet på 4 billeder i sekundet. Skalalinjen repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 4: eksempler på fejl i migration assay set-up. (A) dette panel viser et eksempel på BTSCs, ikke var fuldt dissocieres før plating på den øverste membran indsætte af chemotaxis migration plade. På grund af den store størrelse af kugler og den lille størrelse af membran porer er cellerne ude af stand til at migrere til nederste reservoir. (B) dette panel viser et eksempel på en migration assay hvor alt for mange celler blev forgyldt. Sammenklumpning af celler forstyrrer celle migration og svækker kvantificering. (C) dette panel viser et eksempel på boble dannelse på membran Indsæt hvor BTSCs var belagt. Bobler resultere i dårlig billedkvalitet og forhindrer en nøjagtig kvantificering af migration. Skala søjler repræsenterer 600 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: BTSC neurosphere invasion assay. Disse paneler viser et eksempel på BTSCs invaderer fra en neurosphere til en 0,4 mg/mL type jeg kollagen matrix over en periode på 6 h. Her, vises (A) fase kontrast billeder på hvert tidspunkt (B) med repræsentative kvantitativ masken overlejret, som beskrevet i detaljer i protokollen trin 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: BTSC neurosphere invasion time-lapse video i type I-kollagen. Denne video viser en invasion af BTSCs fra en neurosphere til en 0,4 mg/mL type I-kollagen matrix (også vist som stillbilleder i figur 5A). Billederne er anskaffet ved hjælp af en 10 X mål hver time til 12 h og er sammenstillet på 4 billeder i sekundet. Skalalinjen repræsenterer 300 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 7: BTSC neurosphere invasion time-lapse video i en basalmembran-lignende matrix. Denne video viser en invasion af BTSCs, at udtrykke cytosole normal god landbrugspraksis, fra en neurosphere til en basalmembran-lignende matrix. Billederne er anskaffet ved hjælp af en 4 X mål hvert 30 min for 48 h og blev sammenstillet på 8 billeder per sekund. Skalalinjen repræsenterer 800 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 8: BTSC neurosphere invasion assay med behandling. (A) BTSC neurospheres blev integreret i en basalmembran-lignende matrix tilberedt med køretøjet eller de angivne koncentrationer af stoffet X. billeder blev erhvervet hver time; vist her er billeder taget på tidspunktet i yderklædningen og efter 16 h. Skalalinjen repræsenterer 200 µm. (B) en invasion af BTSCs fra neurospheres i de omkringliggende matrix var kvantificeret hver time, som beskrevet i protokollen trin 3. Datapunkterne er gennemsnittet af tre tekniske Repliker brønde, og fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). (C) dette panel viser BTSC neurospheres indlejret i type, jeg kollagen med en kugle, der er for stor til kvantificering. Skalalinjen repræsenterer 300 µm. (D) dette panel viser BTSC neurospheres indlejret i type kollagen, der ikke satte fuldt ud. Skalalinjen repræsenterer 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kollagen løsning forberedelse | |
| Materiel [kollagen] (mg/ml) | 5 |
| Endelig [kollagen] (mg/ml) | 0,4 |
| Antallet af brønde behov: | 5 |
| Samlede volumen (μl) | 500 |
| Volumen af stock kollagen (μl) | 40 |
| Volumen af 1N NaOH (μl) | 0,92 |
| Volumen af medier (μl) | 459 |
Tabel 1: forberedelse af 0,4 mg/mL type I-kollagen løsning. Listet er kendt starter og ønskede endelige koncentrationer af typen jeg kollagen løsning. De mængder, der er anført tilstrækkelige til at pladen neurospheres i tre Repliker brønde, plus to for overskydende, og kan omfatte en enkelt behandling betingelse, som beskrevet i detaljer i protokollen trin 3.
Discussion
I betragtning af at kræftceller aktivt prolifererende, udgør dette en potentiel tekniske udfordring for studiet af celle migration. For migration analysen beskrives her, BTSCs er belagte uden vækstfaktorer, der begrænser spredning og chemoattractant forløb af chemotaxis pladen fuldt reagensglasset ikke over 72 timer. Desuden, som cellerne bliver overvåget ved hjælp af live-celle imaging over tid, kan celler visuelt overvåges for at sikre udbredt celledeling ikke forekommer. For en vellykket migration assay er det vigtigt at adskille neurospheres helt til enkelt celler og præcist tælle celle tal før plating. Plating kugler eller plating for mange celler, hvilket resulterer i sammenklumpning, kan forhindre celler fra migrere gennem små porer (figur 4A og 4B). Det er også vigtigt at undgå at skabe bobler, når plating celler i chemotaxis migration plade eller placere membran Indsæt på nederste reservoir. Bobler kan ændre flyet af fokus og forhindre nøjagtig kvantificering (figur 4 c). Hele pladen skal være belagt med et tyndt lag af kollagen, fordi dette giver celler en overflade til at navigere til porer i pladen, da denne analyse kræver celler til at overholde og derefter overføre på tværs af en biologisk relevante overflade mod chemoattractant.
BTSC migration protokollen beskrevet her giver mulighed for den kinetiske vurdering af individuelle celle migration, der kræver færre celler til at teste forskellige behandling betingelser i forhold til eksisterende protokoller. Dette er vigtigt for kulturer, der vokser meget langsomt, som det kan være vanskeligt at samle et stort antal celler til eksperimenter. Lav pore tætheden af chemotaxis migration plade giver mulighed for en langsommere ækvilibrering af chemoattractant gradient, større end 72 h, og mere effektivt efterligner den biologiske proces kemotaktisk migration over en længere periode. Protokollen blev optimeret for at have et meget tyndt lag af kollagen belægning på chemotaxis migration plade til at sikre, at analysen foranstaltninger migration og ikke invasion. Det letter også imaging og kvantificering af enkelt celler, som de overholder kollagen matrix belægning membran Indsæt. Dog en begrænsning af teknikken er at kvantificeringen af migration på tværs af flere brønde over tid er meget forenklet og fremskyndet ved hjælp af kommerciel software (Se Tabel af materialer). En bemærkelsesværdig fordel af migrationen analysen er som beskrevet her bred tilpasningsevne af protokollen til andre celletyper. Det vil være særligt nyttigt for kvantificering kemotaktisk migration af cellelinjer, der er enten langsomt voksende, som vanskeligt at overholde, eller vandrer langsomt.
For at sikre succes for BTSC invasion assay, er det nødvendigt at indsamle neurospheres, før de bliver større end 200 µm. større sfærer har en flyet af fokus, der er for stor til konsekvent billede og kvantificere (figur 5 c). Derudover kan neurospheres begynde at klumpe og samlet med andre neurospheres. Dette påvirker erhvervelse af nøjagtige og ensartede data. Det er derudover afgørende at neurospheres får lov til at bosætte sig i bunden af brønden, mens kollagen er stadig på isen, til at tillade neurospheres at blive afbildet i en enkelt flyet af fokus (fig. 5 d). Det er ligeledes vigtigt at tillade kollagen til fuldt sæt uden at flytte pladen, da dette kan afbryde dannelsen af en selv matrix, som kan påvirke negativt billedkvalitet (fig. 5 d). For den BTSC invasion assay beskrevet her, er en af de store fordele at BTSCs kulturperler som neurospheres kan vurderes for invasion direkte, uden at være vokset adherently. Desuden kan BTSC neurospheres være indlejret i en ekstracellulære matrix, enten ved hjælp af enkelte komponenter i den ekstracellulære matrix fra en specifik væv eller en kommercielt tilgængelig basalmembranen blanding. Angiver den ekstracellulære matrix kan bidrage til at identificere eller teste specifikke mekanismer af invasionen. For eksempel med denne protokol er det muligt at vurdere effekten af rettet mod enkelte medlemmer af familien matrix metallopeptidase af gener, som er kendt for at forringe specifikke matrix komponenter. Alternativt, selv om denne protokol er specifikke for BTSC neurospheres, eventuelle celler, der dyrkes som kugler kan bruges i en lignende måde. Eksempler kan nævnes brystkræftceller dyrkes som mammospheres eller primære kolorektal cancerceller kulturperler som tumorspheres; dog, dette begrænser teknik til celletyper, der kan vokse som kugler i en kultur. Andre fordele af migration og invasion assays er at de er nemme at sætte op, de arbejder i en 96-brønds format, og data, der er kvantificerbare over tid.
Samlet, for at forhindre efterbehandling GBM gentagelse, det er vigtigt at udvikle metodologier, som kan lette undersøgelsen af BTSC migration og invasion. Migration protokollen beskrevet her tilbyder mange fordele i forhold til tidligere etablerede migration assays, især til undersøgelse af GBM BTSCs. Denne forbedrede migration protokol omfatter miljøomkostningerne BTSCs kulturperler neurosphere betingelser og plating enkelt celler i en 96-brønd kollagen-belagt chemotaxis migration plade. Ved hjælp af en live-celle imaging system kan migration af BTSCs overvåges og kvantificeres over tid. Invasion analysen beskrives her giver mulighed for overvågning af BTSC invasioner fra neurospheres ind i en matrix. Denne analyse indebærer, integrering af neurospheres på en kollagen matrix, eller et andet protein-rige ekstracellulære matrix, i en 96-brønd plade. Billeddannelse af pladen med en live-celle time-lapse imaging system giver mulighed for analyse af BTSC invasioner under forskellige behandling forhold over tid. Disse assays, dermed, giver et værdifuldt redskab til forskerne håber at bedre at forstå de mekanismer BTSC migration og invasion.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Rozina Hassam og Orsolya Cseh for deres tekniske support. Dette forskningsprojekt blev delvist understøttet af tilskud fra Canada Foundation for Innovation (til H. Anna Luchman og Samuel Weiss) og Stem Cell netværk i Canada (også til H. Anna Luchman og Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
