Summary
Qui, descriviamo le tecniche di imaging di cellule vive per misurare quantitativamente la migrazione e l'invasione delle cellule staminali tumorali di glioblastoma del cervello nel corso del tempo e sotto condizioni multiple di trattamento.
Abstract
Glioblastoma (GBM) è un tumore aggressivo cerebrale che è scarsamente controllato con le opzioni di trattamento attualmente disponibili. Caratteristiche principali di GBMs includono rapida proliferazione e pervasiva invasione nel cervello normale. Ricorrenza è pensato per derivare dalla presenza di radio - e chemio-resistenti del cervello di cellule staminali tumorali (BTSCs) che invadono lontano la massa cancerosa iniziale e, quindi, eludere la resezione chirurgica. Quindi, le terapie destinate a BTSCs e le loro capacità invasiva possono migliorare la prognosi altrimenti povera di questa malattia. Il nostro gruppo e altri hanno correttamente stabilito e caratterizzato culture BTSC da campioni di pazienti di GBM. Queste culture BTSC dimostrano proprietà di cellule staminali del cancro fondamentali quali clonogenic auto-rinnovamento, multi-lignaggio differenziazione e l'inizio del tumore in topi immune-carenti. Al fine di migliorare gli attuali approcci terapeutici per GBM, una migliore comprensione dei meccanismi di BTSC migrazione e l'invasione è necessaria. In GBM, lo studio della migrazione e l'invasione è limitato, in parte, a causa delle limitazioni tecniche esistenti che non tengono conto pienamente le caratteristiche di crescita in vitro di BTSCs cresciuta come neurosfere. Qui, descriviamo saggi imaging rapidi e quantitative cellule vive per studiare la migrazione e l'invasione di proprietà di BTSCs. Il primo metodo descritto è il test di migrazione di BTSC che misura la migrazione verso una sfumatura chemoattractant. Il secondo metodo descritto è l'analisi di invasione BTSC quali immagini e quantifica un'invasione cellulare da neurosfere in una matrice. I saggi qui descritti sono utilizzati per la quantificazione di BTSC migrazione e invasione nel corso del tempo e sotto diverse condizioni di trattamento.
Introduction
Glioblastoma (GBM) è la forma più comune e più aggressiva di cancro al cervello e, malgrado la terapia attuale che coinvolge la resezione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia, la sopravvivenza mediana dei pazienti è un mero 15 mesi1. GBM è dilagante, altamente resistente alla droga, e in ultima analisi, una malattia incurabile che richiede continuò la ricerca in biologia inerente allo scopo di identificare nuove vie terapeutiche. L'elevata mortalità dei pazienti GBM è causato principalmente dalla vasta invasione cellulare nel tessuto normale adiacente del cervello e la migrazione lungo i vasi sanguigni, che conduce a una recidiva della malattia dopo trattamento2,3 . Un sottoinsieme delle cellule, chiamato cervello di cellule staminali tumorali (BTSCs), che sono lente in bicicletta e terapeuticamente resistente, sono stati supposti per condurre alla ricorrenza di malattia. GBM BTSCs visualizzare le proprietà di clonogenic auto-rinnovamento, multipotenza e d'inizio potenziale4,5,6. BTSCs, inoltre, mantengono l'eterogeneità genetica, molecolare e fenotipica del loro genitore GBM tumori7,8,9,10. Queste proprietà rendono BTSCs un sistema estremamente utile modello per lo studio di GBM e per esplorare nuove strategie terapeutiche. In vivo, queste cellule simil-staminali sono in grado di formazione del tumore, la crescita e l'invasione volta impiantate nel cervello dei ratti neonatali11 e combinati non obesi diabetici/grave immunodeficienza (NOD/SCID) topi4. La capacità di BTSCs di ripetutamente formano tumori dilaganti in vivo che ricapitolano le caratteristiche istologiche e cellulari dei loro tumori originale fortemente supporta il loro ruolo di cellule d'inizio12.
Approcci terapeutici stanno sviluppandi per destinazione BTSCs e contribuire a migliorare il risultato a lungo termine per i pazienti GBM. Attualmente, c'è limitata comprensione dei processi di migrazione e invasione cellulari che sono associati con resistenza terapeutica e ricorrenza. Migrazione e invasione sono fenomeni distinti; la migrazione è il processo alla base del movimento diretto delle cellule e comporta la riorganizzazione del citoscheletro, molecole di adesione e montaggio/smontaggio dei punti di contatto focale, mentre invasione richiede anche la distruzione fisica delle barriere ad esempio una matrice extracellulare13. Una metodologia ampiamente accettata di studiare l'invasione e la migrazione cellulare è la camera di Boyden saggio14,15. Per questa tecnica, a doppia camera è riempita con i media, con i media nel vano inferiore completato con un fattore chemiotattico. Chemiotassi viene attivato utilizzando specifici fattori di crescita, citochine o siero bovino fetale come un chemoattractant aspecifici. Seguendo il gradiente del chemoattractant, le cellule migrano attraverso la membrana porosa. All'endpoint le cellule migrate possono essere visualizzate e quantificate sul fondo della membrana mediante colorazione con coloranti citologici o fluorescente. Boyden test di migrazione può essere modificato per un'analisi di invasione da rivestimento la porosa filtro con componenti della matrice extracellulare come tipo I collagene o una matrice del tipo di membrana basale. Cellule invasive degradano la matrice, spostarsi verso il basso del filtro poroso e possono essere quantificate in modo simile per il test di migrazione. Altri saggi di migrazione comunemente usati includono il graffio della ferita e la zona di esclusione di cella saggi13. Il test di graffiatura ferita viene fatto graffiare un gap in un monostrato cellulare e osservando la migrazione delle cellule dal bordo della ferita da formazione immagine a intervalli regolari fino a quando il graffio è chiuso. Nell'analisi di esclusione della cella, una barriera fisica viene utilizzata per creare una zona libera da cella prima la semina delle cellule. La barriera è rimosso una volta che le cellule sono confluenti e la migrazione delle cellule nella zona senza cellula è ripreso regolarmente16.
Questi precedentemente stabilito dosaggi frequentemente vengono utilizzati per studiare la migrazione o l'invasione di popolazioni di cellule aderenti e omogeneo ma posa considerevoli svantaggi quando si studia GBM BTSCs o altre popolazioni di cellule tumorali eterogenee. L'analisi della camera di Boyden può generare solo endpoint misure contro una valutazione cinetica del movimento cellulare. Un'osservazione nel corso del tempo è di grande rilevanza per la misura della migrazione BTSC, dato che le cellule provenienti da diverse culture spesso migrano ai tassi differenti. Come tale, le condizioni e la temporizzazione del dosaggio deve essere ottimizzato per ogni tipo di cultura e richiede tempo-intenso lavoro di campionatura adeguata e di quantificazione. L'esclusione di graffio e cella saggi non sono adatti a culture BTSC come, anche quando BTSCs sono coltivate in condizioni di monostrato su piastre rivestite con laminina, abbiamo osservato che BTSCs sembrano resistere movimento nello spazio aperto e preferiscono rimanere nel chiudere vicinanza ad altre cellule. Inoltre, questi stabiliti saggi di migrazione non consentono la visualizzazione e il monitoraggio delle singole celle in tutto un esperimento. Il monitoraggio delle singole celle nel corso del tempo è prezioso per la valutazione della migrazione nelle popolazioni eterogenee delle cellule come BTSCs. ulteriori svantaggi dei saggi Boyden chamber, graffio e cella-esclusione zona per culture BTSC sono che essi richiede relativamente numeri alti delle cellule, può essere laborioso da configurare, e sia rapidamente equilibrare o non hanno una sfumatura chemoattractant. Come tale, queste analisi non sono ideali da usare per le popolazioni delle cellule rare o crescita lenta o per lo screening di stupefacenti. Inoltre, queste analisi non sono adatti per la misurazione di un'invasione in formato tridimensionale (3D), che è particolarmente importante per BTSCs coltivate in condizioni neurosphere.
Qui, descriviamo saggi appositamente modificate per l'osservazione e la quantificazione della migrazione per singoli BTSCs e per l'invasione di GBM BTSCs coltivate come neurosfere. Il primo descrive un adattamento di analisi dell'alloggiamento di Boyden utilizzando cellule vive time-lapse imaging e un piatto di migrazione di chemiotassi per misurare chemiotattica delle cellule migrazione13. Imaging di cellule vive in un formato multi-pozzetto permette per la visualizzazione e la quantificazione della migrazione cellulare in molteplici condizioni di trattamento. Il secondo test descritto qui è un sferoide invasione dosaggio13,17, che misura le proprietà invasive di BTSCs coltivate in condizioni neurosphere e incorporati in una matrice extracellulare 3D sotto vario trattamento condizioni. Nel complesso, queste analisi sono molto più compatibile rispetto precedentemente descritte metodologie per studiare le proprietà migratori e invasive delle culture BTSC eterogenee. Sono inoltre dotati di migliori opportunità per la ricerca di nuove strategie terapeutiche a destinazione migrazione e invasione, che contribuiscono significativamente alla ricorrenza di malattia e mortalità.
Protocol
1. messa in coltura di cellule staminali tumorali cerebrali precedentemente derivate da campioni di Glioblastoma umano
Nota: Culture BTSC precedentemente sono state stabilite da umano GBM campioni6,7,8,9,10.
- Scongelare una fiala di BTSCs criogenicamente conservato in un becher contenente etanolo al 70%, collocato all'interno di un bagno di acqua a 37 ° C, fino a quando l'ultimo del ghiaccio si è sciolto. Diluire le cellule sciolte in 10 mL di media in una provetta conica da 15 mL e centrifugare le cellule a 150 forza centrifuga relativa (RCF) per 7 min.
Nota: Nel corso di questi protocolli, media completo si riferiscono a supporti standard utilizzati per cultura BTSCs (precedentemente descritto da Kelly et al.) 6, in genere con fattori di crescita presenti. Media senza fattori di crescita si riferiscono ai media base con tutti i componenti ma senza alcuni fattori di crescita integrati. - Aspirare i media, risospendere le cellule in 8 mL di multimediale completo e trasferire le cellule e i media in un pallone di T25.
- Dopo 1 settimana di coltura in condizioni di non-aderenti, monitorare quotidianamente la beuta e integrare i contenuti con 1-2 mL di terreno completo come necessario, se i media comincia a esaurire o inizia a diventare acide come indicato da un cambiamento di colore giallo-arancio. Cellule di passaggio quando la neurospheres raggiunge un diametro di circa 250 μm, in genere tra 10-14 d (Figura 1).
Nota: Il tempo di raddoppiamento delle diverse culture BTSC varia ampiamente. Neurosphere dimensione può essere misurata utilizzando un micrometro oculare. - Per passaggio BTSCs, raccogliere i media e neurosfere pipettando i media verso il basso la superficie del pallone al fine di raccogliere tutte le neurosfere e trasferirli in una provetta conica da 15 mL e centrifugare la provetta per 7 min a 150 RCF.
Nota: Boccette possono essere verificati sotto un microscopio per garantire che tutti i neurospheres sono stati raccolti. Un ulteriore lavaggio con 5 mL di fosfato tampone salino (PBS) o media può essere eseguita per raccogliere qualsiasi neurosfere rimanenti se necessario. - Per dissociare il neurosfere BTSC in singole celle, aspirare i media e aggiungere 1 mL di soluzione di distacco delle cellule pre-riscaldato e incubare che a 37 ° C per un minimo di 7 triturare la BTSC sospensione 40 x con un P1, 000 micropipetta fissato a 800 μL.
Nota: Le cellule possono incubate più a 37 ° C se non dissociare la neurosfere. - Aggiungere 5 mL di PBS (con gli antibiotici penicillina e streptomicina) il BTSCs dissociate e centrifugare le cellule a 150 RCF per 7 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il BTSCs in 1-4 mL di completa per i media, a seconda della dimensione del pellet cellulare.
Nota: La sospensione cellulare deve essere ulteriormente diluito se la concentrazione è oltre il limite di rilevazione accurata per il conteggio accurato delle cellule. - Utilizzando un colorante che esclude le cellule morte, come il blu di trypan, contare il numero di cellule vitali e il BTSCs del seme nella boccetta o il piatto di interesse — in genere, 200.000-300.000 cellule in 8 mL di completa per i media in una boccetta di T25.
2. analisi di migrazione cervello del tumore delle cellule staminali
- Cellule di seme 200.000 in una beuta, T25 in 8 mL di multimediale completo 1-2 settimane prima di pianificare l'esecuzione di un test di migrazione.
Nota: Il tempo tra la placcatura e il dosaggio variano a seconda del tasso di crescita della cultura BTSC utilizzato.- Per testare l'effetto di un trattamento farmacologico sulla migrazione, pretrattare le cellule con il veicolo appropriato, ad esempio DMSO e farmaco di interesse aggiungendo volumi applicabile dello stock veicolo o droga direttamente in pozzetti separati di supporto contenente le celle.
- Preparare la piastra di migrazione di chemiotassi (Figura 2A) ricoprendolo con un sottile strato di collagene.
- Calcolare il numero di pozzetti di una piastra a 96 pozzetti chemiotassi che dovranno essere rivestiti con collagene. Includere almeno tre pozzi replicare per ogni condizione.
- Diluire 5 mg/mL di stock di collagene di tipo I a 0,2 mg/mL nell'acido acetico puro, diluito a 0,14% in acqua di grado di cultura.
- Pipettare 0,2 mg/mL di collagene sia i pozzi di inserto di membrana e i pozzi di serbatoio di fondo che vengono utilizzati.
Nota: I serbatoi di fondo della piastra richiedono 225 µ l e i pozzi di inserto di membrana richiedono 75 µ l di collagene per un rivestimento adeguato. - Posizionare la piastra di migrazione in un incubatore a 37 ° C per 1 h. aspirare la soluzione di collagene dai pozzi senza graffiare il rivestimento di collagene.
- Lavare i pozzetti 2 x con PBS 1X sterile. Se la piastra non viene utilizzata subito, aspirare il PBS e conservarlo a 4 ° C fino a 2 settimane. Prima dell'uso, riscaldare la piastra di migrazione di chemiotassi a temperatura ambiente.
- Preparare il serbatoio inferiore della piastra di migrazione di chemiotassi.
- 225 µ l di media (senza fattori di crescita), supplementato con 10% FBS come un chemoattractant, dei pozzetti di serbatoio inferiore della piastra di migrazione di chemiotassi.
- Posizionare delicatamente l'inserto di membrana nel serbatoio inferiore ad un angolo per evitare di creare bolle.
- Piastra di inserire le cellule nella membrana della piastra di migrazione di chemiotassi.
- Risospendere dissociata BTSCs in media (senza fattori di crescita) ad una densità di cella di 50.000 cellule/mL. Aggiungere farmaci ai media se valutando la migrazione durante trattamenti farmacologici diversi. Alternativamente, seme uguale numero di cellule pre-trattate e le cellule di controllo, pur mantenendo la concentrazione di farmaco finale quando placcatura.
- Piastra 50 µ l di BTSCs dal punto 2.4.1 in ciascun pozzetto della piastra migrazione sotto le condizioni di trattamento desiderato.
- Immagine della migrazione di chemiotassi.
- Posizionare la piastra di migrazione di chemiotassi nel sistema di imaging di cellule vive e impostare il software di imaging automatizzato per acquisire immagini microscopiche della piastra ogni 1-2 h per fino a 72 h. Using software commerciale (Vedi Tabella materiali), tasto destro del mouse sul Timeline e imposta un intervallo di scansione per ogni 2 h per 24 h.
Nota: L'intervallo di tempo e il tempo totale trascorso variano tra culture BTSC utilizzate; iniziare con intervalli di 2 h per 72 h fino a quando è stata acquisita esperienza con culture BTSC individuali. Se non è disponibile un sistema di imaging automatizzato, quindi immagini dello stesso campo di vista possono essere acquisite manualmente con un microscopio e una telecamera collegata al software di imaging. - Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, ottenere le immagini per l'intero esperimento e creare una definizione di elaborazione utilizzando il software di analisi che differenzia le cellule dallo sfondo della membrana e i pori di migrazione (Figura 2B, maschera rossa) . Utilizzando il software commerciale (Vedi Tabella materiali), selezionare una Nuova definizione di elaborazione e impostare le impostazioni di definizione di elaborazione per BTSCs ad una soglia di seme di 52, un crescere la soglia di 85, regolazioni delle dimensioni (pixel) da -1 e una superficie minima di 200 μm2. Applicare questa definizione di elaborazione al lato inferiore della membrana. Modificare questa analisi se non distinguere con precisione le cellule dalla membrana sfondo.
- Raccogliere dati come l'area della superficie delle cellule sul lato inferiore della membrana per ciascuno dei tre pozzi replicati, che conta solo le celle che hanno migrato attraverso i pori. La migrazione delle cellule in μm2 del grafico (area delle cellule migrate) nel corso del tempo (Figura 2 C, Figura 3).
Nota: Assicurarsi che il numero relativo di cellule placcato e contato sulla superficie superiore della membrana nel primo tempo-punto è simile (meno di 20% variazione tra tutti i pozzetti) tra tutte le condizioni di trattamento per evitare eventuali effetti di placcatura irregolare. Raccolta di dati mediante che il software commerciale (Vedi Tabella materiali) può essere eseguito avviando la definizione di trasformazione creata nel passaggio 2.5.2, facendo clic sulle metriche, quindi sul grafico/Esporta, quindi su esportazione dati .
- Posizionare la piastra di migrazione di chemiotassi nel sistema di imaging di cellule vive e impostare il software di imaging automatizzato per acquisire immagini microscopiche della piastra ogni 1-2 h per fino a 72 h. Using software commerciale (Vedi Tabella materiali), tasto destro del mouse sul Timeline e imposta un intervallo di scansione per ogni 2 h per 24 h.
3. cervello tumore delle cellule staminali Neurosphere analisi di invasione
- Cellule di seme 200.000 in 8 mL di completa per i media in una boccetta di T25 1-2 settimane prima di pianificare l'esecuzione di un test di invasione.
Nota: I tempi di cromatura per eseguire il dosaggio dipenderà il tasso di proliferazione della cultura BTSC utilizzato.- Per le cellule pretrattate, aggiungere il composto di interesse nel matraccio alla concentrazione desiderata per il corso di tempo predeterminato prima la neurospheres sono pronti a essere placcato per invasione.
- Attendere fino a quando la dimensione di neurosphere medio è di circa 150-200 μm; in genere, questo richiede 7-14 d, a seconda della cultura BTSC utilizzata.
Nota: È tipico per osservare una distribuzione delle dimensioni della sfera nel pallone. - Suggerimento e delicatamente mescolare il pallone con una pipetta e spostare 500 μL della neurospheres BTSC in una provetta conica da 1,5 mL per ciascuna condizione di trattamento; Questo servirà ai tre pozzi replicare di targa.
Nota: Passaggi 3.3.1 - 3.3.2 sono facoltativi ma consigliati per il primo esperimento di invasione su una nuova cultura BTSC.- Per determinare la densità di neurosfere che finirà nel pozzo, preparare una provetta da 1,5 mL come descritto al punto 3.3. Delicatamente mescolare la neurospheres e spostare 100 μL in una piastra a 96 pozzetti separata e lasciare il neurosfere depositarsi per gravità per 5 min.
- Controllare il numero di neurosfere sotto il microscopio per garantire più neurosfere è nella regione del pozzo che verrà essere imaged senza sovraffollamento.
Nota: Invasori neurosfere richiedono abbastanza stanza tripla di diametro senza interagire con la vicina neurosfere. Il numero di neurosfere per pozzetto può essere regolato contando il numero di neurosfere per pozzetto e aggiungendo più o meno neurosfere dal pallone T25 al tubo conico 1,5 mL nella fase 3.3.
- Mettere la provetta conica da 1,5 mL con le cellule dal punto 3.3 sul ghiaccio e procedere 3.5-3.7 sul ghiaccio.
- Lasciate la neurospheres depositarsi per gravità verso il basso del tubo conico 1,5 mL per 5 min e prechill una piastra a 96 pozzetti con etichetta sul ghiaccio.
- Risospendere il neurosfere nella proteina della matrice extracellulare.
- Preparare 500 μL di 0,4 mg/mL di soluzione di collagene tipo I sul ghiaccio per ciascuna condizione di trattamento: aggiungere 459 μL dei media (senza fattori di crescita), 40 μL di soluzione di riserva di 5 mg/mL collagene e 0.92 μL di sterile 1N NaOH (tabella 1).
Nota: 500 μL della soluzione di collagene è richiesto per ogni condizione di trattamento: 100 μL per ciascuno dei tre pozzi replicati e 200 μL di eccesso. Trattamenti farmacologici devono essere aggiunti qui alla concentrazione finale desiderata, sottratta dal componente multimediale della soluzione. Questo protocollo descrive l'uso di collagene di tipo I come la proteina della matrice extracellulare; Tuttavia, può essere verificata alcuna proteina della matrice extracellulare. Inoltre, per BTSC culture che hanno tassi più lenti di invasione, fattori di crescita o FB possono essere integrate nei media per aumentare il tasso di invasione. - Dopo che si sono stabiliti i neurospheres da passo 3.5, aspirare come gran parte dei media come possibile senza perdere il pellet neurosphere che ha depositato nella parte inferiore. Risospendere delicatamente il neurosfere in 500 μL della soluzione di collagene preparata al punto 3.6.1.
- Preparare 500 μL di 0,4 mg/mL di soluzione di collagene tipo I sul ghiaccio per ciascuna condizione di trattamento: aggiungere 459 μL dei media (senza fattori di crescita), 40 μL di soluzione di riserva di 5 mg/mL collagene e 0.92 μL di sterile 1N NaOH (tabella 1).
- Aggiungere 100 μL di miscela di collagene e neurosphere a replicati tre pozzetti della piastra 96 pozzetti sul ghiaccio. Consentire la neurospheres a stabilirsi sul ghiaccio per 5 min.
- Trasferimento della piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per 5 min consentire per la polimerizzazione di collagene.
- Preparare immediatamente all'immagine la piastra a 96 pozzetti.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel vassoio di un sistema di imaging di cellule vive o sul palco di un microscopio per acquisire un'immagine come riferimento per le dimensioni di neurosphere al momento della placcatura, prima dell'inizio dell'invasione.
- Acquisire immagini ogni ora fino a quando il tasso di invasione ha stabilizzato; in genere, ciò si verifica entro 24 h.
Nota: L'intervallo di imaging può essere modificato a seconda del materiale utilizzato. Il tempo trascorso imaging di intervallo e totale può essere modificato anche per culture BTSC che hanno differenti tassi di invasione.
- Determinare l'area della superficie aumentante di BTSCs che avevano invaso la matrice nel corso del tempo.
Nota: L'area della superficie delle cellule al momento della placcatura, calcolato come la media dei tre pozzi replicare, deve essere simile (meno di 20% variazione tra tutti i pozzetti) tra le condizioni di trattamento diverso per garantire le differenze nell'invasione BTSC non sono fortemente influenzato dal numero o dimensione di neurosfere placcato.- Per il sistema di analisi di cellule vive, utilizzare un obiettivo 10x per l'acquisizione di immagini e di acquisire quattro immagini per pozzetto per replicano i tre pozzi. Per determinare l'area della superficie cellulare relativa, rappresentato dalla confluenza delle percentuali del pozzo, impostare una definizione di elaborazione che evidenzia in particolare le celle sopra il fondo del pozzo. Utilizzando il software commerciale (Vedi Tabella materiali), selezionare una nuova definizione di elaborazione e impostare la regolazione di segmentazione a 0,8, l'area minima a 300 μm2e l'eccentricità massima a 0,99. Modificare questa analisi se non accuratamente distinguere cellule dallo sfondo.
Nota: Se utilizzando altri metodi per invasione neurosphere immagine nel tempo, si consiglia di ottenere molteplici campi di vista per i tre pozzi di replicare nel corso del tempo. Tuttavia, l'imaging non l'esatta stesso campo di vista a ogni intervallo aumenterà l'errore standard dei dati raccolti. Software per computer può essere utilizzato per aiutare a misurare l'area della superficie delle cellule d'invasione in ogni immagine. - Raccogliere dati come l'area della superficie totale delle cellule (assoluto o relativo) per ogni pozzetto in ogni momento e determinare la media dei tre pozzi replicati. Rappresentare graficamente l'invasione di BTSCs tracciando l'area di celle crescenti nel tempo.
Nota: Raccolta di dati utilizzando software commerciali (Vedi Tabella materiali) possono essere eseguito avviando la definizione di trasformazione creata nel passaggio 3.10.1, facendo clic sulle metriche, quindi il grafico/esportazione, e quindi il esportazione dati .
- Per il sistema di analisi di cellule vive, utilizzare un obiettivo 10x per l'acquisizione di immagini e di acquisire quattro immagini per pozzetto per replicano i tre pozzi. Per determinare l'area della superficie cellulare relativa, rappresentato dalla confluenza delle percentuali del pozzo, impostare una definizione di elaborazione che evidenzia in particolare le celle sopra il fondo del pozzo. Utilizzando il software commerciale (Vedi Tabella materiali), selezionare una nuova definizione di elaborazione e impostare la regolazione di segmentazione a 0,8, l'area minima a 300 μm2e l'eccentricità massima a 0,99. Modificare questa analisi se non accuratamente distinguere cellule dallo sfondo.
Representative Results
Qui, descriviamo alcuni esempi di dati che possono essere ottenuti usando analisi di imaging di cellule vive per studiare BTSC migrazione e invasione. BTSCs sono placcati come singole cellule e può essere coltivata come digalleggiante neurosfere (Figura 1). Indichiamo che BTSCs possono essere dissociate e placcato nei pozzi dell'inserto della membrana in un piatto di migrazione di chemiotassi che è rivestito con un sottile strato di tipo collagene (Figura 2A). BTSCs individuali sono uniformemente dispersi nella parte superiore dell'inserto di membrana all'inizio del test. Per un periodo di 24-72 h, le cellule aderiscono alla membrana, muovono lungo la superficie rivestita con collagene e migrano attraverso uno dei 96 pori piccoli al lato inferiore della membrana, verso un chemoattractant nel serbatoio bene. Dopo aver evidenziato le celle nella parte superiore della membrana in giallo, i pori in blu e le cellule sul fondo della membrana in rosso, le cellule possono essere visto entrare nel poro in alto a sinistra (cella gialla si avvicina un poro blu) e uscendo il poro sulla parte inferiore (globulo rosso uscita ing il poro blu) (Figura 3). D'importanza, le cellule possono essere droga trattato e cromato nello stesso piatto chemiotassi migrazione come cellule di controllo veicolo-trattato per studiare l'effetto degli interventi terapeutici sulla migrazione BTSC (Figura 2B). La piastra di migrazione di chemiotassi consente l'imaging delle cellule sia sulla parte superiore e sulla parte inferiore dell'inserto della membrana. Pertanto, la quantificazione della migrazione cellulare nel corso del tempo è possibile contando le cellule che hanno migrato al lato inferiore della membrana (Figura 2).
Abbiamo trovato che se BTSCs non sono completamente dissociato, quindi le cellule non migrano attraverso i pori e rimangono come piccolo neurosfere (Figura 4A). È anche importante non piastra più di 2.500 BTSCs/pozzetto come questo risultati nella cella che ragruppa, piuttosto che nella migrazione verso il lato inferiore della membrana (Figura 4B). Infine, è essenziale per evitare di fare le bolle nella membrana inserire pozzi quando placcatura cellule e ponendo la membrana quando inserisce sul serbatoio inferiore, come in questo modo accurato imaging e quantificazione (Figura 4).
Successivamente, indichiamo che invasione BTSC, da neurosfere nella matrice circostante, può essere imaged e quantificato nel corso del tempo in un formato di piastra a 96 pozzetti (Figura 5A). L'invasione può essere misurata quantificando l'area della superficie delle cellule che avevano invaso la matrice nel corso del tempo. Utilizzando software di analisi di immagine, una definizione di elaborazione è stata applicata che sovrapposizioni una maschera nella cella la superficie che permette per la quantificazione automatica nel corso del tempo (figura 5B). Video time-lapse di invasioni BTSC possono essere creati, per osservare facilmente il processo generale di invasione BTSC (Figura 6). Inoltre, microscopia fluorescente può essere utilizzato per immagine BTSCs che esprimono le proteine fluorescenti, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP) o la proteina fluorescente rossa (RFP). Qui, abbiamo creato un video time-lapse di BTSCs che esprimono una forma citosolica di GFP per tenere traccia dei singoli BTSCs che avevano invaso una matrice del tipo di membrana basale (Figura 7). Questa analisi di invasione neurosphere BTSC permette anche per trattamenti farmacologici essere aggiunto a replicare wells di valutare direttamente i loro effetti sull'invasione BTSC da neurosfere in una matrice (Figura 8A). La quantificazione di neurosfere più pozzi replicare possa essere calcolata e rappresentati graficamente nel tempo per valutare l'effetto delle droghe alle concentrazioni multiple (Figura 8B).
Il mancato rispetto del protocollo descritto sopra può portare ad un'incapacità di ottenere dati affidabili e precisi. L'incorporamento di neurosfere BTSC che sono troppo grandi, con un diametro maggiore di 200 µm, conduce ad un piano di messa a fuoco che è troppo grande per quantificare con precisione tutte le sfere in un campo di vista (Figura 8). Allo stesso modo, l'incapacità di mantenere la matrice a 4 ° C mentre l'incorporamento della neurospheres può anche portare a sfere che non sono sullo stesso piano di messa a fuoco e una matrice extracellulare che non si è solidificato in modo uniforme, che impedisce la raccolta di dati accurati (Figura 8 ).
Figura 1: coltura BTSCs. Questi pannelli sono un esempio rappresentativo di BTSCs cresciuta da singole cellule di neurosfere in un periodo di 14-d nella cultura. I neurosfere mostrati qui al giorno 14 sono di dimensioni adeguate per il passaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: formazione immagine di cellule vive di una migrazione di BTSC. (A) questo è un esempio di un piatto di migrazione di chemiotassi di 96 pozzetti rivestiti con un sottile strato di tipo I collagene prima di eseguire il test di migrazione con BTSCs. Le immagini mostrano i) un piatto con tutte le tre parti (coperchio, inserimento di membrana e serbatoio) messi insieme, ii) tutte le tre parti separate, iii) un'immagine ravvicinata di vista superiore dell'inserto della membrana, iv) un'immagine ravvicinata della vista inferiore dell'inserto della membrana e v) un'immagine di primo piano del bacino inferiore. (B) Queste sono immagini rappresentative di una migrazione di BTSC all'inizio (0h) dell'esperimento e a 24 h. Il focus di immagine è sulla parte superiore dell'inserto di membrana dove le cellule erano originariamente cromate. In rosso sono evidenziate le celle che sono migrati verso il fondo della piastra di migrazione di chemiotassi. A 0 h, alcune cellule sono migrati al lato inferiore della membrana. Dopo 24 h, il numero di cellule migrate è aumentato drammaticamente. Il confronto delle immagini a 24 h per cellule trattate con un veicolo vs farmaco X dimostra che il trattamento farmacologico riduce la migrazione BTSC. La scala bar rappresentano 600 µm. (C), questo pannello mostra la quantificazione di una migrazione di BTSC dopo pre-trattamento con un veicolo o una droga X. Il grafico mostra che il trattamento farmacologico ha un forte effetto sulla migrazione di BTSCs. I punti dati sono la media di tre pozzi di replicare tecniche, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Animati figura 3: video time-lapse di migrazione BTSC. Questo video mostra la migrazione di BTSCs utilizzando un tipo ho collagene-rivestito piastra di migrazione di chemiotassi. In giallo sono evidenziate le celle nella parte superiore dell'inserto di membrana, le cellule che hanno migrato verso il basso dell'inserto della membrana sono evidenziate in rosso e i pori nella membrana sono evidenziati in blu. Il piano di messa a fuoco è impostato su celle di immagine sul lato inferiore della membrana. Il video è stato creato utilizzando Time-lapse immagini prese ogni ora per 51H e compilato a 4 fotogrammi al secondo. La barra della scala rappresenta 200 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Figura 4: esempi di errori nell'impostazione dell'analisi della migrazione. (A), questo pannello viene illustrato un esempio di BTSCs che non erano completamente dissociate prima della placcatura sull'inserto membrana superiore della piastra di migrazione di chemiotassi. Dovuto le grandi dimensioni delle sfere e le piccole dimensioni dei pori della membrana, le cellule sono in grado di migrare al serbatoio inferiore. (B) questo pannello mostra un esempio di un test di migrazione dove troppe cellule erano cromate. L'aggregazione delle cellule interferisce con la migrazione cellulare e altera la quantificazione. (C) questo pannello mostra un esempio di formazione di bolle sull'inserto membrana dove erano cromate BTSCs. Bolle di provocare scarsa qualità dell'immagine e prevenire una quantificazione accurata della migrazione. Le barre di scala rappresentano 600 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: analisi di invasione di BTSC neurosphere. Questi pannelli mostrano un esempio di BTSCs invadendo da un neurosphere in un tipo di 0,4 mg/mL ho matrice di collagene per un periodo di 6 h. Qui, immagini di contrasto di fase (A) in ogni momento sono indicati (B) con la maschera quantitativa rappresentanza sovrapposta, come descritto in dettaglio nel passaggio 3 di protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: video time-lapse con invasione di neurosphere BTSC in collagene di tipo I. Questo video mostra un'invasione di BTSCs da un neurosphere in un 0,4 mg/mL tipo matrice di collagene (indicato anche come immagini fisse in Figura 5A). Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10x ogni ora per 12 h e vengono compilate a 4 fotogrammi al secondo. La barra della scala rappresenta 300 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Figura 7: video time-lapse con invasione di neurosphere BTSC in una matrice del tipo di membrana dello scantinato. Questo video mostra un'invasione di BTSCs, quella express citosolico GFP, da un neurosphere in una matrice del tipo di membrana basale. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 4x ogni 30 min per 48 h e sono state compilate a 8 fotogrammi al secondo. La barra della scala rappresenta 800 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Figura 8: analisi di invasione neurosphere BTSC con trattamento. (A) BTSC neurosfere sono stati incorporati in una matrice di scantinato membrana-come preparata con veicolo o le concentrazioni indicate di droga X. immagini sono state acquisite ogni ora; mostrato qui sono immagini scattate al tempo di placcatura e dopo 16 h. La barra della scala rappresenta 200 µm. (B) un'invasione di BTSCs da neurosfere nella matrice circostante è stata quantificata ogni ora, come descritto nel protocollo passaggio 3. I punti dati sono la media di tre pozzi di replicare tecniche, e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). (C), questo pannello mostra BTSC neurosfere incorporato nel tipo I collagene con una sfera che è troppo grande per la quantificazione. La barra della scala rappresenta 300 µm. (D) questo pannello mostra BTSC neurosfere incorporato nel tipo I collagene che completamente non è stata impostata. La barra della scala rappresenta 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Preparazione soluzione di collagene | |
| Stock [collagene] (mg/ml) | 5 |
| Finale [collagene] (mg/ml) | 0.4 |
| Numero di pozzetti necessari: | 5 |
| Volume totale (μl) | 500 |
| Volume di stock collagene (μl) | 40 |
| Volume di NaOH 1N (μl) | 0.92 |
| Volume dei media (μl) | 459 |
Tabella 1: preparazione di 0,4 mg/mL soluzione di collagene di tipo I. Sono elencate le noti a partire e desiderate concentrazioni finali del tipo ho soluzione di collagene. I volumi elencati sono sufficienti per piastra neurosfere in tre pozzi replicare, più due per eccesso e possono includere una condizione di singolo trattamento, come descritto in dettaglio nel passaggio 3 di protocollo.
Discussion
Dato che le cellule tumorali proliferano attivamente, ciò pone una sfida tecnica per lo studio della migrazione cellulare. Per il dosaggio di migrazione descritto qui, BTSCs sono placcati senza fattori di crescita, che limita la proliferazione, ed il gradiente di chemoattractant della piastra chemiotassi non completamente equilibrare più di 72 ore. Inoltre, come le cellule vengono monitorate usando la formazione immagine di cellule vive nel tempo, le cellule possono essere visivamente monitorate per garantire diffusa la divisione cellulare non è in corso. Per il successo del test di migrazione, è importante dissociare la neurospheres completamente a cellule singole e contare con precisione i numeri di cellulare prima della placcatura. Sfere di placcatura o placcatura troppe cellule, che si traduce in aggregazione, può impedire alle cellule dalla migrazione attraverso i piccoli pori (Figura 4A e 4B). È anche importante evitare di creare bolle quando le cellule della piastra di migrazione di chemiotassi di placcatura o quando si posiziona l'inserto di membrana sul serbatoio inferiore. Bolle possono modificare il piano di messa a fuoco e prevenire la quantificazione accurata (Figura 4). L'intera piastra deve essere ricoperto con un sottile strato di collagene, perché questo dà cellule una superficie per navigare verso i pori nella piastra, come questo test richiede celle ad aderire e quindi eseguire la migrazione attraverso una superficie biologicamente rilevante verso il chemoattractant.
Il protocollo di migrazione BTSC descritto qui consente la valutazione cinetica di migrazione delle cellule individuali, che richiedono meno cellule per la verifica delle condizioni di disparità di trattamento rispetto ai protocolli esistenti. Questo è importante per le colture che crescono molto lentamente, come può essere difficile raccogliere un gran numero di cellule per la sperimentazione. La densità bassa poro della piastra chemiotassi migrazione permette un'equilibrazione più lento della sfumatura chemoattractant, maggiore di 72 h e imita in modo più efficace il processo biologico di migrazione chemiotattica su un periodo più lungo di tempo. Il protocollo è stato ottimizzato per avere un sottilissimo strato di rivestimento di collagene sulla piastra chemiotassi migrazione per garantire che la migrazione di misure di test e non invasione. Facilita inoltre la formazione immagine e la quantificazione delle singole cellule che aderiscano alla matrice di collagene l'inserto di membrana di rivestimento. Tuttavia, una limitazione della tecnica è che la quantificazione della migrazione attraverso pozzi multipli nel corso del tempo è notevolmente semplificato e accelerato utilizzando software commerciali (Vedi Tabella materiali). Un notevole vantaggio del dosaggio migrazione come descritto qui è l'ampia adattabilità del protocollo per altri tipi di cellule. Sarà particolarmente utile per quantificare la migrazione chemiotattica delle varietà di cellula che sono entrambi a crescita lenta, difficile ad aderire, o migrare lentamente.
Per garantire il successo del dosaggio invasione BTSC, è necessario raccogliere neurosfere prima che diventino più grandi di 200 µm. sfere più grandi hanno un piano di messa a fuoco che è troppo grande per costantemente battuta e quantificare (Figura 5). Inoltre, neurosfere può cominciare a ciuffo e di aggregazione con altri neurosfere. Questo problema riguarda l'acquisizione di dati accurati e coerenti. Inoltre, è essenziale che i neurosfere possono depositarsi sul fondo del pozzo, mentre il collagene è ancora sul ghiaccio, per consentire la neurospheres essere imaged in un unico piano di messa a fuoco (Figura 5). Analogamente, è importante consentire il collagene impostare completamente senza spostare la piastra come ciò può interferire con la formazione di una matrice anche, che potrebbe influenzare negativamente la qualità dell'immagine (Figura 5). Per il dosaggio di invasione BTSC descritto qui, uno dei principali vantaggi è che, per invasione, BTSCs coltivate come neurosfere può essere valutata direttamente, senza la necessità di essere coltivata adherently. Inoltre, BTSC neurosfere può essere incorporato in qualsiasi matrice extracellulare, o uso dei singoli componenti della matrice extracellulare da un tessuto specifico o usando una miscela della membrana dello scantinato commercialmente disponibili. Specificando la matrice extracellulare può aiutare a identificare o test specifici meccanismi di invasione. Ad esempio, con questo protocollo, è possibile valutare l'effetto dei singoli membri della famiglia di metallopeptidase di matrice dei geni, che sono noti per degradare i componenti specifici della matrice di targeting. In alternativa, anche se questo protocollo è specifico di neurosfere BTSC, eventuali cellule coltivate come sfere possono essere utilizzate in modo simile. Gli esempi includono cellule di cancro al seno coltivate come mammospheres o cancro colorettale primario cellule coltivate come tumorspheres; Tuttavia, questo limita la tecnica per i tipi di cellule che possono crescere come sfere in una cultura. Altri vantaggi di saggi sia la migrazione e l'invasione sono che sono facili da impostare, lavorano in un formato a 96 pozzetti, e i dati sono quantificabili nel tempo.
Nel complesso, al fine di impedire la ricorrenza del GBM di post-trattamento, è essenziale sviluppare metodologie che agevolino le indagini di BTSC migrazione e invasione. Il protocollo di migrazione descritto qui offre molti vantaggi rispetto saggi di migrazione stabiliti in precedenza, soprattutto per lo studio di BTSCs di GBM. Questo protocollo migliorata migrazione coinvolge dissociando BTSCs coltivate in condizioni neurosphere e placcatura singole cellule in una piastra 96 pozzetti rivestite con collagene chemiotassi di migrazione. Utilizzando un sistema di imaging di cellule vive, la migrazione dei BTSCs può essere monitorata e quantificata nel corso del tempo. L'analisi di invasione qui descritto consente il monitoraggio delle invasioni BTSC da neurosfere in una matrice. Questo test implica l'incorporamento di neurosfere in una matrice di collagene, o un'altra matrice extracellulare ricca di proteine, in una piastra a 96 pozzetti. Formazione immagine del piatto con un sistema di imaging time-lapse di cellule vive permette l'analisi delle invasioni BTSC sotto diverse condizioni di trattamento nel corso del tempo. Queste analisi, pertanto, forniscono uno strumento prezioso agli scienziati sperando di comprendere meglio i meccanismi alla base di BTSC migrazione e invasione.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Rozina Hassam e Orsolya Cseh per il loro supporto tecnico. Questo progetto di ricerca è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della Fondazione del Canada per l'innovazione (di H. Carlo Luchman e Samuel Weiss) e le cellule staminali reti del Canada (anche in H. Carlo Luchman e Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
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