Summary
Nous décrivons ici les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour mesurer quantitativement la migration et l’invasion du glioblastome cerveau tumeur des cellules souches au fil du temps et dans plusieurs conditions de traitement.
Abstract
Glioblastome (GBM) est une tumeur au cerveau agressif qui est mal contrôlée avec les options thérapeutiques actuellement disponibles. Principales caractéristiques du GBM comprennent une prolifération rapide et invasion généralisée dans le cerveau normal. Récurrence est censée résulter de la présence de radio-chimio résistant et cerveau cellules souches tumorales (BTSCs) qui envahissent loin la masse cancéreuse initiale et, ainsi, se soustraire à la résection chirurgicale. Par conséquent, thérapies qui ciblent les BTSCs et leurs capacités invasives peuvent améliorer la sinon mauvais pronostic de cette maladie. Notre groupe et autres ont avec succès établi et caractérisé les cultures BTSC d’échantillons de patients de GBM. Ces cultures BTSC démontrent des propriétés de cellules souches cancer fondamentaux comme clonogéniques autorenouvellement, lignées multiples différenciation et initiation tumorale chez des souris immunodéficientes. Afin d’améliorer les approches thérapeutiques actuelles pour GBM, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de migration BTSC et invasion. Dans GBM, l’étude de la migration et l’invasion est limitée, en partie, en raison des limites des techniques existantes qui n’expliquent pas entièrement les caractéristiques de la croissance in vitro de BTSCs cultivés comme neurospheres. Nous décrivons ici rapides et quantitatives cellules vivantes des tests d’imagerie afin d’étudier les propriétés de la migration et l’invasion de BTSCs. La première méthode décrite est le test de migration BTSC qui mesure la migration vers un gradient chimiotactique. La deuxième méthode décrite est le dosage d’invasion BTSC Quelles images et quantifie une invasion cellulaire de neurospheres dans une matrice. Les tests décrits ici sont utilisées pour la quantification du BTSC migration et invasion dans le temps et dans des conditions de traitement différent.
Introduction
Glioblastome (GBM) est la forme la plus courante et agressive de cancer du cerveau et, malgré le traitement en cours impliquant la résection chirurgicale suivie de radiations et la chimiothérapie, la survie médiane des patients est une peine de 15 mois1. GBM est envahissante, très résistant à la drogue, et en fin de compte, une maladie incurable qui nécessite poursuit des recherches sur sa biologie inhérente afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Le taux élevé de mortalité des patients GBM est principalement causé par l’invasion cellulaire étendue dans le tissu cérébral normal adjacent et la migration le long des vaisseaux sanguins, ce qui conduit à une récidive de la maladie après traitement2,3 . Un sous-ensemble de cellules, appelé cerveau tumeur des cellules souches (BTSCs), qui sont lentes, cyclisme et thérapeutiquement résistant, ont émis l’hypothèse pour mener à la récurrence de la maladie. GBM BTSCs afficher les propriétés de clonogéniques autorenouvellement, multipotentialité et déclenchant les tumeur potentiel4,de5,6. BTSCs conservent aussi l’hétérogénéité génétique, moléculaire et phénotypique de leur parent GBM tumeurs7,8,9,10. Ces propriétés font de BTSCs un système modèle extrêmement utile pour l’étude du GBM et pour explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques. In vivo, ces cellules souches sont capables de la formation de tumeurs, la croissance et invasion lorsqu’elles sont implantées dans le cerveau des rats néonatals11 et non obèses diabétiques/sévère combinée d’immunodéficience (NOD/SCID) souris4. La capacité des BTSCs à plusieurs reprises pour former des tumeurs invasives en vivo qui récapitulent les caractéristiques de leurs tumeurs d’originales cellulaires et histologiques fortement prend en charge leur rôle de cellules tumorales qui lance12.
Nouvelles approches thérapeutiques sont en cours d’élaboration pour la cible BTSCs et aident à améliorer les résultats à long terme pour les patients GBM. Il est actuellement limitée à comprendre les processus de migration et invasion cellulaires qui sont associées à la résistance thérapeutique et la répétition. Migration et invasion sont des phénomènes distincts ; la migration est le processus qui sous-tendent le mouvement dirigé des cellules et implique la réorganisation du cytosquelette, molécules d’adhérence et montage/démontage du focales points de contact, alors que l’invasion exige également la destruction physique des barrières comme une matrice extracellulaire13. Une méthodologie largement acceptée d’étudier l’invasion et la migration cellulaire est la chambre de Boyden test14,15. Pour cette technique, une chambre double est remplie avec les médias, avec les médias dans le bas du réservoir additionné d’un facteur chimiotactique. La chimiotaxie est déclenchée à l’aide de sérum de veau fœtal ou cytokines ou des facteurs de croissance spécifiques comme un facteur chimiotactique indéterminé. La suite de la pente de la chemoattractant, cellules migrent à travers la membrane poreuse. Au point de terminaison, les cellules migrés peuvent être visualisés et quantifiées sur la partie inférieure de la membrane par coloration avec colorants cytologiques ou fluorescents. La Boyden, test de migration peut être modifiée pour un dosage d’invasion en enduisant la poreux filtre avec des composants de la matrice extracellulaire tels que type j’ai collagène ou une matrice de type membrane basale. Cellules envahissantes dégradent la matrice, parcourir vers le bas du filtre poreux et peuvent être quantifiés de manière similaire à l’analyse de la migration. Autres essais de migration couramment utilisées incluent le zéro blessure et analyses de la zone d’exclusion de cellule13. L’analyse de la plaie gratter est réalisée en gratter une lacune dans une couche cellulaire et en observant la migration des cellules du bord de la plaie par imagerie à intervalles réguliers jusqu'à ce que le zéro est fermé. Dans l’analyse d’exclusion de cellules, une barrière physique est utilisée pour créer une zone sans cellule avant l’ensemencement des cellules. La barrière est supprimé une fois que les cellules sont confluentes et la migration des cellules dans la zone acellulaire est imagé régulièrement16.
Il a déjà été établie dosages sont fréquemment utilisés pour l’étude de la migration ou l’invasion des populations de cellules adhérentes et homogène, mais pose des désavantages considérables lors de l’étude GBM BTSCs ou autres populations de cellules de cancer hétérogènes. Le dosage de la chambre de Boyden peut générer uniquement endpoint mesures contre une évaluation cinétique du mouvement cellulaire. Une observation au fil du temps est d’une grande pertinence pour la mesure de la migration de BTSC, étant donné que les cellules provenant de cultures différentes migrent souvent à des vitesses différentes. Par conséquent, les conditions et le moment du test doivent être optimisées pour chaque type de culture et nécessite beaucoup de temps de travail d’échantillonnage adéquat et de quantification. L’exclusion de zéro et la cellule dosages ne sont pas bien adaptés aux cultures BTSC que, même lorsque les BTSCs sont cultivées dans des conditions de monocouche sur plaques d’enduit de laminine, nous avons observé que les BTSCs semblent bien résister aux mouvements dans l’espace ouvert et préfèrent rester en étroite proximité à d’autres cellules. En outre, ces établi des essais de migration ne permettent pas pour la visualisation et le contrôle des cellules individuelles dans une expérience. La surveillance des cellules individuelles au fil du temps est précieuse pour l’évaluation de la migration de populations de cellules hétérogènes tels que BTSCs. inconvénients supplémentaires les essais Boyden chambre, aux rayures et cellule-exclusion zone de cultures BTSC sont qu’ils exiger relativement numéros de cellulaire élevée, peut prendre beaucoup de temps à mettre en place, et soit équilibrer rapidement ou n’ont pas un gradient chimiotactique. À ce titre, ces tests ne sont pas idéales à utiliser pour les populations cellulaires rares ou à croissance lente ou pour le dépistage des drogues. En outre, ces tests ne sont pas adaptés pour mesurer une invasion dans un format tridimensionnel (3D), qui est particulièrement important pour BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère.
Nous décrivons ici les essais spécialement modifiés pour l’observation et la quantification de la migration pour BTSCs individuels et pour l’invasion de GBM BTSCs cultivés sous neurospheres. Le premier décrit une adaptation de l’essai de chambre de Boyden en utilisant l’imagerie de cellules vivantes Time-lapse et une plaque de migration de chimiotactisme pour mesurer chimiotactique cell migration13. Imagerie de cellules vivantes dans un format multipuit permet la visualisation et la quantification de la migration cellulaire dans les conditions de traitement multiples. Le deuxième essai décrit ici est un sphéroïde invasion dosage13,17, qui mesure les propriétés invasives des BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère et incorporés dans une matrice extracellulaire 3D sous traitement divers conditions. Dans l’ensemble, ces tests sont bien plus compatibles que la méthodologie décrite précédemment pour étudier les propriétés migratoires et envahissantes des cultures BTSC hétérogènes. Ils offrent également de meilleures possibilités pour la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cibler la migration et invasion, qui contribuent de manière significative à la récurrence de la maladie et la létalité.
Protocol
1. mise en culture des cellules souches cérébrales tumeur précédemment dérivé de spécimens de glioblastome humain
Remarque : Les cultures BTSC ont déjà été établies entre humains GBM échantillons de patients6,7,8,9,10.
- Décongeler un flacon de BTSCs cryogéniquement conservés dans un bécher contenant de l’éthanol 70 %, placée dans un bain d’eau à 37 ° C, jusqu'à ce que le dernier de la glace a dégelé. Diluer les cellules décongelées dans 10 mL de médias dans un tube conique de 15 mL et centrifuger les cellules à 150 force centrifuge relative (RCF) pendant 7 minutes.
Remarque : Tout au long de ces protocoles, médias complet se réfère à des supports standard utilisés pour la culture BTSCs (précédemment décrites par Kelly et al.) 6, généralement avec des facteurs de croissance présents. Médias sans facteurs de croissance se réfère aux médias base avec tous les composants, mais sans tout facteur de croissance complétée. - Aspirer les médias, remettre en suspension les cellules de 8 mL de support complet et transférer les cellules et les médias dans une fiole de T25.
- Après 1 semaine de culture dans des conditions non adhérents, contrôler le ballon au quotidien et de compléter le contenu avec 1 à 2 mL de médias complet selon les besoins, si les médias commence à s’épuiser ou commence à devenir acide comme indiqué par un changement de couleur jaune-orange. Cellules de passage lorsque les neurospheres atteint un diamètre d’environ 250 μm, généralement entre 10-14 j (Figure 1).
Remarque : Le temps de doublement des différentes cultures BTSC varie considérablement. Neurosphère taille peut être mesurée à l’aide d’un micromètre oculaire. - Pour BTSCs, ramassez les médias et les neurospheres en pipettant également, les médias vers le bas de la surface du ballon afin de recueillir toutes les neurospheres et transférez-les sur un tube conique de 15 mL et centrifuger le tube pendant 7 min à 150 RCF.
Remarque : Flacons peuvent être vérifiées au microscope pour s’assurer que tous les neurospheres ont été collectés. Un lavage supplémentaire avec 5 mL de phosphate buffered saline (PBS) ou les médias peuvent être effectuées pour recueillir toute neurospheres restant si nécessaire. - Pour dissocier la neurospheres BTSC en cellules individuelles, aspirer les médias et ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire préchauffé et incuber qu’à 37 ° C pendant 7 min. broyer les BTSC suspension 40 x avec une P1, micropipette 000 fixé à 800 μL.
Remarque : Les cellules peuvent être incubés plus à 37 ° C si les neurospheres ne pas dissocier. - Ajouter 5 mL de PBS (avec la pénicilline antibiotiques et streptomycine) dans les BTSCs dissociées et centrifuger les cellules à 150 RCF pendant 7 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les BTSCs en 1 à 4 mL de médias complets, selon la taille du culot cellulaire.
Remarque : La suspension cellulaire doit être plus dilué si la concentration dépasse la limite de détection précise pour le comptage des cellules précises. - En utilisant un colorant qui exclut les cellules mortes, telles que le bleu trypan, compter le nombre de cellules viables et les BTSCs des graines dans le flacon ou la plaque d’intérêt — en général, 200 000-300 000 cellules dans 8 mL de médias complet dans une fiole de T25.
2. cerveau tumeur Stem Cell Migration test
- Cellules de semence 200 000 dans une fiole de T25 à 8 mL de médias complet 1-2 semaines avant l’intention d’effectuer un test de migration.
Remarque : Le temps entre le placage et la réalisation de l’essai variera selon le taux de croissance de la culture BTSC utilisé.- Pour tester l’effet d’un traitement médicamenteux sur les migrations, pré-traiter les cellules avec le véhicule approprié, comme le DMSO et drogues d’intérêt en ajoutant des volumes il y a lieu du stock de véhicule ou de la drogue directement dans les puits séparés des supports contenant les cellules.
- Préparer la plaque de migration de chimiotactisme (Figure 2 a) en recouvrant d’une fine couche de collagène.
- Calculer le nombre de puits d’une plaque de 96 puits chimiotactisme qui devront être recouvertes de collagène. Inclure au moins trois puits répétées pour chaque condition.
- Diluer 5 mg/mL de stock du collagène de type I à 0,2 mg/mL dans l’acide acétique pur diluée à 0,14 % en eau de qualité de la culture.
- Pipetter 0,2 mg/mL de collagène à la fois les puits d’insert membrane et les puits de réservoir de fond qui sont utilisés.
Remarque : Les réservoirs de fond de la plaque nécessitent 225 µL et les puits d’insert membrane nécessitent 75 µL de collagène pour un revêtement adéquat. - Place la plaque de la migration dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h. aspirer la solution de collagène provenant des puits sans rayer le revêtement de collagène.
- Laver les puits 2 x avec du PBS stérile 1 x. Si la plaque n’est pas utilisée tout de suite, aspirer le PBS et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. Avant utilisation, réchauffer la plaque de migration de chimiotactisme à température ambiante.
- Préparer le réservoir en bas de la plaque de migration de chimiotactisme.
- Pipetter 225 µL de médias (sans facteurs de croissance), additionné de 10 % SVF comme un facteur chimiotactique, dans les puits de réservoir du bas de la plaque de migration de chimiotactisme.
- Placez délicatement l’insertion de la membrane dans le réservoir du bas à un angle pour éviter de créer des bulles.
- Plaque des cellules dans l’insert de la membrane de la plaque de migration de chimiotactisme.
- Remettre dissocié BTSCs dans les médias (sans facteurs de croissance) à une densité cellulaire de 50 000 cellules/mL. Ajouter les médicaments aux médias si évaluer la migration dans le cadre de traitements médicamenteux différents. Alternativement, les semences un nombre égal de cellules pré-traitées et contrôle, tout en maintenant la concentration du médicament final lors de l’ensemencement.
- Plaque de 50 µL des BTSCs de l’étape 2.4.1 dans chaque puits de la plaque de migration dans les conditions de traitement désiré.
- Image de la migration de chimiotactisme.
- Placer la plaque de migration de chimiotactisme dans le système d’imagerie de cellules vivantes et définissez le logiciel d’imagerie automatisé d’acquérir des images microscopiques de la plaque tous les 1-2 h pendant jusqu'à 72 h à l’aide des logiciels commerciaux (voir Table des matières), faites un clic droit sur le chronologie et jeu de l’intervalle de balayage à toutes les 2 h pendant 24 h.
Nota : L’intervalle de temps et le temps total écoulé variera entre BTSC cultures utilisées ; commencer avec 2 h d’intervalle pendant 72 h, jusqu'à ce que l’expérience a été acquise avec différentes cultures BTSC. Si un système d’imagerie automatisé n’est pas disponible, alors les images du même champ de vision peuvent être acquises manuellement avec un microscope et une caméra connectée au logiciel d’imagerie. - Une fois que l’acquisition d’image est terminée, obtenir les images pour l’expérience entière et créer une définition de la transformation en utilisant le logiciel d’analyse qui différencie des cellules de l’arrière-plan de la membrane et les pores de la migration (Figure 2 b, masque rouge) . À l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières), sélectionnez une Nouvelle définition de traitement et de définir les paramètres de définition de traitement pour BTSCs à un seuil de graine de 52, un seuil de croître de 85, réglage de la taille (pixels) de -1 et une superficie minimale de 200 μm2. Appliquer cette définition de la transformation à la face inférieure de la membrane. Modifier cette analyse si il ne distingue pas avec précision les cellules de la membrane de l’arrière-plan.
- Collecter des données comme la surface de la cellule sur la face inférieure de la membrane pour chacun des trois puits répétés, qui ne compte que les cellules qui ont migré à travers les pores. Graphique de la migration des cellules de μm2 (zone de cellules migré) au fil du temps (Figure 2 C, Figure 3).
Remarque : Assurez-vous que le nombre relatif de cellules plaqué et a compté sur la surface supérieure de la membrane au premier temps-point est similaire (moins de variation de 20 % dans tous les puits) entre toutes les conditions de traitement afin d’éviter tout effet de placage irrégulier. Collecte des données à que des logiciels commerciaux (voir la Table des matières) peuvent être exécuté en lançant la définition de traitement créée à l’étape 2.5.2, en cliquant sur paramètres, puis sur graphique/exporter, puis sur Data export .
- Placer la plaque de migration de chimiotactisme dans le système d’imagerie de cellules vivantes et définissez le logiciel d’imagerie automatisé d’acquérir des images microscopiques de la plaque tous les 1-2 h pendant jusqu'à 72 h à l’aide des logiciels commerciaux (voir Table des matières), faites un clic droit sur le chronologie et jeu de l’intervalle de balayage à toutes les 2 h pendant 24 h.
3. cerveau tumeur cellules souches Neurosphère Invasion Assay
- Cellules de semence 200 000 8 mL de médias complet dans une fiole de T25 1-2 semaines avant l’intention d’effectuer un test d’invasion.
Remarque : Le moment de placage à la réalisation de l’essai dépendra le taux de prolifération de la culture BTSC utilisé.- Pour les cellules prétraitées, ajouter le composé d’intérêt dans le ballon à la concentration désirée pour le cours de temps prédéterminé avant que les neurospheres sont prêts à être plaqué à l’invasion.
- Attendez jusqu'à ce que la taille moyenne Neurosphère est environ 150-200 μm ; en général, cela prend 7-14 d, selon la culture BTSC utilisée.
Remarque : Il est typique pour observer une distribution de tailles de sphère dans la fiole. - Astuce et délicatement mélanger le flacon avec une pipette et déplacer 500 μL de la neurospheres BTSC dans un tube conique de 1,5 mL pour chaque condition de traitement ; cela servira à trois puits répétées sur plaque.
Remarque : Étapes 3.3.1 - 3.3.2 sont facultatif, mais recommandé pour la première expérience d’invasion sur une nouvelle culture BTSC.- Pour déterminer la densité de la neurospheres qui se retrouveront dans le puits, préparer un tube de 1,5 mL comme au point 3.3. Doucement, mélanger le neurospheres et amener 100 μL dans une plaque à 96 puits distincte et laisser le neurospheres de régler par gravité pendant 5 min.
- Vérifier le nombre de neurospheres au microscope pour s’assurer de multiples neurospheres est dans la région du puits qui sont projeté sans surpopulation il.
Remarque : Neurospheres envahisseurs nécessitent un espace suffisant pour le triple de diamètre sans interagir avec les voisins neurospheres. Le nombre de neurospheres / puits peut être ajusté en comptant le nombre de neurospheres par puits et en ajoutant plus ou moins neurospheres du flacon T25 au tube conique 1,5 mL à l’étape 3.3.
- Placer le tube conique de 1,5 mL avec les cellules de l’étape 3.3 sur glace et effectuez les opérations 3,5 à 3,7 sur la glace.
- Laisser les neurospheres reposer par gravité vers le bas du tube conique 1,5 mL pendant 5 min et utiliser son préalable d’une plaque à 96 puits marquée sur la glace.
- Resuspendre le neurospheres dans la protéine de la matrice extracellulaire.
- Préparer 500 μL d’un 0,4 mg/mL de type I solution de collagène sur la glace pour chaque condition de traitement : ajoutez 459 μL de médias (sans facteurs de croissance), 40 μL de la solution mère de collagène de 5 mg/mL et 0,92 μL de stérile 1N NaOH (tableau 1).
Nota : 500 μL de la solution de collagène est exigé par la condition de traitement : 100 μl de chacune des trois puits de répliquer et 200 μL d’excès. Les traitements médicamenteux doivent être ajoutés ici à la concentration finale souhaitée, soustraite le composant de média de la solution. Ce protocole décrit l’utilisation de collagène de type I comme la protéine de la matrice extracellulaire ; Cependant, les protéines de la matrice extracellulaire peuvent être testés. En outre, pour BTSC cultures ayant des taux plus lents de facteurs de croissance, d’invasion ou de FBS peuvent être complétés dans les médias pour augmenter le taux d’invasion. - Après que les neurospheres de l’étape 3.5 se sont installés, aspirer aussi bien des médias que possible sans perdre le granulé Neurosphère qui a réglé au fond. Resuspendre doucement le neurospheres dans 500 μL de la solution de collagène préparée à l’étape 3.6.1.
- Préparer 500 μL d’un 0,4 mg/mL de type I solution de collagène sur la glace pour chaque condition de traitement : ajoutez 459 μL de médias (sans facteurs de croissance), 40 μL de la solution mère de collagène de 5 mg/mL et 0,92 μL de stérile 1N NaOH (tableau 1).
- Ajouter 100 μl du mélange collagène et Neurosphère à trois puits répétées de la plaque à 96 puits sur la glace. Permettre le neurospheres de s’installer sur la glace pendant 5 min.
- Transférer la plaque 96 puits dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min permettre la polymérisation de collagène.
- Préparer immédiatement à l’image de la plaque à 96 puits.
- Placer la plaque à 96 puits dans le bac d’un système d’imagerie de cellules vivantes ou sur la scène d’un microscope pour acquérir une image de référence pour la taille Neurosphère au moment de l’ensemencement, avant le début de l’invasion.
- Acquisition d’images toutes les heures jusqu'à ce que le taux d’invasion a atteint un plateau ; en général, cela se produit dans les 24 heures.
Nota : L’intervalle d’imagerie peut être modifié selon l’équipement utilisé. L’imagerie intervalle et total écoulé peuvent également être modifié pour les cultures BTSC qui ont différents taux d’invasion.
- Déterminer la superficie croissante de BTSCs qu’ils envahissent la matrice au fil du temps.
Remarque : La surface des cellules au moment de l’électrodéposition, calculée comme la moyenne des trois puits répétées, doit être similaire (moins de variation de 20 % dans tous les puits) entre les conditions de traitement différent pour les différences dans l’invasion de BTSC ne soient pas fortement affectée par le nombre ou la taille de la neurospheres plaqué.- Pour le système d’analyse de cellules vivantes, utiliser un objectif 10 X pour l’acquisition d’image et d’acquérir quatre images / puits pour répliquent les trois puits. Pour déterminer la surface de cellule relative, représentée sous la forme du pourcentage confluent du puits, mis en place une définition de traitement spécifiquement met en évidence les cellules sur le fond du puits. À l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières), sélectionnez une définition de traitement nouveau et effectuez le réglage de la segmentation à 0,8, la zone minimale de 300 μm2et l’excentricité maximale à 0,99. Modifier cette analyse si il ne distingue pas précisément les cellules de l’arrière-plan.
Remarque : Si vous utilisez d’autres méthodes d’invasion Neurosphère image au fil du temps, il est recommandé d’obtenir plusieurs champs de vision pour répliquent les trois puits au fil du temps. Toutefois, l’imagerie ne pas l’exacte même champ de vision à chaque intervalle augmentera l’écart-type des données recueillies. Logiciel utilisable pour aider à mesurer la surface des cellules envahisseurs dans chaque image. - Recueillir des données comme la cellule total superficie (relative ou absolue) pour chaque cupule à chaque instant et déterminer la moyenne des trois puits de répliquer. Graphique de l’invasion des BTSCs en traçant la zone cellule croissante au fil du temps.
Note : Collecte de données à l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières) peut être exécuté en lançant la définition de traitement créée à l’étape 3.10.1, en cliquant sur paramètres, puis sur graphique/export, et ensuite sur Data export .
- Pour le système d’analyse de cellules vivantes, utiliser un objectif 10 X pour l’acquisition d’image et d’acquérir quatre images / puits pour répliquent les trois puits. Pour déterminer la surface de cellule relative, représentée sous la forme du pourcentage confluent du puits, mis en place une définition de traitement spécifiquement met en évidence les cellules sur le fond du puits. À l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières), sélectionnez une définition de traitement nouveau et effectuez le réglage de la segmentation à 0,8, la zone minimale de 300 μm2et l’excentricité maximale à 0,99. Modifier cette analyse si il ne distingue pas précisément les cellules de l’arrière-plan.
Representative Results
Nous décrivons ici les exemples de données qui peuvent être obtenues à l’aide de tests d’imagerie de cellules vivantes pour étudier l’invasion et la migration de BTSC. BTSCs sont plaqués comme cellules individuelles et peuvent être cultivés comme flottant neurospheres (Figure 1). Nous montrons que les BTSCs peuvent être dissociés et plaqué dans les puits de l’insertion de la membrane dans une plaque de migration de chimiotactisme qui est recouvert d’une fine couche de type I de collagène (Figure 2 a). BTSCs individuels sont réparties sur le dessus de l’insert membrane au début de l’essai. Sur une période de 24 à 72 heures, cellules adhèrent à la membrane, se déplacent le long de la surface enduite collagène et migrent à travers l’un des 96 petits pores à la face inférieure de la membrane, vers un facteur chimiotactique dans le réservoir bien. Après avoir sélectionner les cellules sur le dessus de la membrane dans les cellules sur la partie inférieure de la membrane en rouge, les pores en bleu et jaune, des cellules peuvent être vu en entrant dans le pore sur le dessus (cellule jaune approchant un pore bleu) et la sortie du pore sur le fond (sortie de globules rouges ING le pore bleu) (Figure 3). Ce qui est important, les cellules peuvent être traités et plaqués dans la même assiette de migration de chimiotactisme comme cellules de véhicule témoin pour étudier l’effet des interventions thérapeutiques sur les migrations BTSC (Figure 2 b). La plaque de migration de chimiotactisme permet l’imagerie de cellules aussi bien sur le dessus et sur le fond de l’insert de la membrane. Quantification de la migration cellulaire au fil du temps est donc possible de compter les cellules qui ont migré vers la face inférieure de la membrane (Figure 2).
Nous avons trouvé que si BTSCs ne sont pas complètement dissociées, puis les cellules ne pas migrer à travers les pores et restent comme petit neurospheres (Figure 4 a). Il est également important à plaque de pas plus de 2 500 BTSCs/bien que cela entraîne dans la cellule agglomérante plutôt que dans la migration vers la face inférieure de la membrane (Figure 4 b). Enfin, il est indispensable d’éviter de faire des bulles dans la membrane insérer puits lorsque le placage des cellules et placer la membrane lorsque Insérez sur le réservoir du bas, car ceci empêcherait une imagerie précise et quantification (Figure 4).
Ensuite, nous montrons qu’invasion BTSC, de neurospheres dans la matrice environnante, peut être imagée et quantifiée au fil du temps dans un format de plaque à 96 puits (Figure 5 a). Invasion peut être mesurée en quantifiant la surface des cellules qu’ils envahissent la matrice au fil du temps. À l’aide de logiciels d’analyse image, une définition de traitement a été appliquée que superpositions un masque sur la cellule surface habitable, ce qui permet une quantification automatique au fil du temps (Figure 5 b). Vidéos time-lapse des invasions BTSC peuvent également être créées, afin d’observer facilement l’ensemble du processus d’invasion BTSC (Figure 6). En outre, microscopie fluorescente peut servir d’image BTSCs qui expriment des protéines fluorescentes, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) ou protéine fluorescente rouge (DP). Ici, nous avons créé une vidéo en Time-lapse de BTSCs exprimant une forme cytosolique de GFP pour aider à suivre les BTSCs individuels comme ils envahissent une matrice de type membrane basale (Figure 7). Cet essai d’invasion Neurosphère BTSC permet également de traitements médicamenteux à ajouter dans le puits de répliquer directement évaluer leurs effets sur l’invasion de BTSC de neurospheres dans une matrice (Figure 8 a). La quantification des neurospheres multiples dans les puits répétées peut être calculée et représenté graphiquement au fil du temps afin d’évaluer l’effet des médicaments à des concentrations multiples (Figure 8 b).
Ne pas respecter le protocole décrit ci-dessus peut entraîner l’incapacité d’obtenir des données fiables et précises. Enrobage neurospheres BTSC qui sont trop grands, d’un diamètre supérieur à 200 µm, conduit à un plan de mise au point qui est trop grand pour quantifier avec précision toutes les sphères dans un champ de vision (Figure 8). De même, incapacité à maintenir la matrice à 4 ° C tout en intégrant la neurospheres peut également mener aux sphères qui ne sont pas sur le même plan de mise au point et d’une matrice extracellulaire qui se solidifie pas uniformément, ce qui empêche la collecte de données précises (Figure 8 ).
Figure 1 : cultivation BTSCs. Ces panneaux sont un exemple représentatif de BTSCs issues de cellules individuelles à neurospheres sur une période de 14 jours en culture. Les neurospheres présentés ici au jour 14 sont d’un montant approprié pour le passage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : imagerie de cellules vivantes d’une migration de BTSC. (A) c’est un exemple d’une plaque de 96 puits chimiotactisme migration enduit d’une couche mince de type collagène avant d’effectuer le test de migration avec BTSCs. Les images montrent i) une plaque avec les trois parties (couvercle, insertion de la membrane et réservoir) placés ensemble, séparés, iii) une image de gros plan de la vue de dessus de l’insertion de la membrane, iv) une image de gros plan de la vue du dessous de l’insert membrane ii) chacune des trois parties et v) une image en gros plan du réservoir inférieur. (B) ce sont des images représentatives d’une migration de BTSC au début de l’expérience (0 h) et à 24 h. La mise au point de l’image est sur le dessus de l’insert membrane où les cellules ont été initialement plaqués. Les cellules qui ont migré vers le bas de la plaque de migration de la chimiotaxie sont surlignées en rouge. À 0 h, quelques cellules ont migré vers la face inférieure de la membrane. Après 24h, le nombre de cellules migrés a augmenté considérablement. La comparaison des images à 24h pour les cellules traitées avec un véhicule vs médicament X montre que le traitement de la toxicomanie diminue migration BTSC. L’échelle barres représentent 600 µm. (C), ce panneau montre la quantification d’une migration de BTSC après prétraitement avec un véhicule ou un médicament X. Le graphique montre que le traitement de la toxicomanie a un effet puissant sur la migration des BTSCs. Les points de données sont la moyenne des trois puits techniques de répliquer, et les barres d’erreur représentent déviation standard (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
D’animation Figure 3 : vidéo Time-lapse de migration BTSC. Cette vidéo montre la migration des BTSCs à l’aide d’un type j’ai collagène-enduit plaque de migration de chimiotactisme. Sur le dessus de l’insert de la membrane des cellules sont surlignés en jaune, les cellules qui ont migré vers le bas de l’insertion de la membrane sont surlignés en rouge et les pores de la membrane sont surlignées en bleu. Le plan d’action a la valeur des cellules d’image sur la face inférieure de la membrane. La vidéo a été créée à l’aide de Time-lapse images prises toutes les heures pendant 51 h et mise à jour à 4 images par seconde. La barre d’échelle représente 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 4 : exemples d’erreurs dans la configuration de test de migration. (A), ce tableau montre un exemple de BTSCs qui ne sont pas complètement dissociés avant la culture sur l’insertion de la membrane supérieure de la plaque de migration de chimiotactisme. En raison de la grande taille des sphères et la petite taille des pores membranaires, les cellules sont incapables de migrer vers le réservoir inférieur. (B) ce panneau montre un exemple d’un test de migration où trop de cellules ont été plaqués. L’agglutination des cellules interfère avec la migration cellulaire et altère la quantification. (C) ce panneau montre un exemple de la formation de bulles sur l’insertion de la membrane où BTSCs ont été plaqués. Bulles donner lieu à une mauvaise qualité d’image et de prévenir une quantification précise de la migration. Les barres d’échelle représentent 600 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : test d’invasion Neurosphère BTSC. Ces panneaux montrent un exemple de BTSCs envahir d’un Neurosphère dans un type de 0,4 mg/mL, j’ai matrice de collagène sur une période de 6 h. Ici, images de contraste de phase (A) à chaque point de temps sont affichés (B) avec le masque quantitatif représentatif superposé, comme décrit en détail à l’étape 3 de la protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : vidéo Time-lapse d’invasion Neurosphère BTSC en collagène de type I. Cette vidéo montre une invasion de BTSCs depuis un Neurosphère dans un 0,4 mg/mL (également représenté par des images fixes à la Figure 5 a) de matrice de collagène de type I. Les images ont été acquises en utilisant un objectif 10 X chaque heure pendant 12 h et sont compilées à 4 images par seconde. La barre d’échelle représente 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 7 : vidéo Time-lapse d’invasion Neurosphère BTSC dans une matrice de la membrane basale comme. Cette vidéo montre une invasion de BTSCs, que GFP express cytosolique, partir un Neurosphère dans une matrice de type membrane basale. Les images ont été recueillies à l’aide d’un objectif 4 X toutes les 30 min pendant 48 h et ont été compilés à 8 images par seconde. La barre d’échelle représente 800 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 8 : BTSC Neurosphère invasion dosage avec traitement. (A) BTSC neurospheres ont été noyées dans une matrice de type membrane basale préparée avec le véhicule ou les concentrations indiquées du médicament X. Images ont été acquises par heure ; montré ici sont des images prises au moment de l’électrodéposition et après 16 h. La barre d’échelle représente 200 µm. (B) une invasion de BTSCs de neurospheres dans la matrice environnante a été quantifiée par heure, tel que décrit à l’étape 3 de la protocole. Les points de données sont la moyenne des trois puits techniques de répliquer, et les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM). (C), ce panneau affiche BTSC neurospheres incorporé dans type j’ai collagène avec une sphère qui est trop grande pour la quantification. La barre d’échelle représente 300 µm. (D) ce panneau montre BTSC neurospheres incorporé dans type collagène qui n’a pas entièrement défini. La barre d’échelle représente 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Préparation de solutions de collagène | |
| Stock [collagène] (mg/ml) | 5 |
| Finale [collagène] (mg/ml) | 0,4 |
| Nombre de puits nécessaires : | 5 |
| Volume total (μl) | 500 |
| Volume de stock collagène (μl) | 40 |
| Volume de NaOH 1N (μl) | 0,92 |
| Volume des médias (μl) | 459 |
Tableau 1 : préparation de la 0,4 mg/mL solution de collagène de type I. Énumérées sont connus de départ et la concentration finale souhaitée du type j’ai solution de collagène. Les volumes indiqués sont suffisants pour plaque neurospheres dans trois puits répétées, plus deux pour excès et peuvent inclure une condition de traitement unique, tel que décrit en détail à l’étape 3 de la protocole.
Discussion
Étant donné que les cellules cancéreuses sont multiplient activement, cela pose un défi technique potentiel pour l’étude de la migration cellulaire. Pour le test de migration décrit ici, BTSCs sont plaquées sans facteurs de croissance, qui limite la prolifération et le gradient chimiotactique de la plaque de la chimiotaxie ne pas entièrement équilibrer plus de 72 heures. En outre, comme les cellules sont surveillés en utilisant l’imagerie de cellules vivantes au fil du temps, les cellules peuvent être contrôlés visuellement afin d’assurer la division cellulaire généralisée ne se produit pas. Pour la réussite de l’essai de migration, il est important de dissocier le neurospheres complètement à des cellules individuelles et de compter avec précision le nombre de cellules avant la culture. Sphères de placage ou placage trop de cellules, qui se traduit par agglutination, peut empêcher les cellules de migrer à travers les petits pores (Figure 4 a et 4 b). Il est également important d’éviter de créer des bulles lorsque les cellules de la plaque de migration de chimiotactisme de placage ou lorsque vous placez l’insertion de la membrane sur le réservoir inférieur. Bulles peuvent modifier le plan de mise au point et une quantification précise (Figure 4). La plaque entière doit être recouvert d’une fine couche de collagène parce que cela donne des cellules une surface pour naviguer sur les pores de la plaque, car ce test nécessite de cellules d’adhérer au et puis migrer à travers une surface biologiquement pertinente vers le facteur chimiotactique.
Le protocole de migration BTSC décrit ici permet l’évaluation cinétique de la migration de cellules individuelles, nécessitant moins de cellules pour les essais de traitement différent par rapport aux protocoles existants. Ceci est important pour les cultures qui poussent très lentement, car il peut être difficile de rassembler un grand nombre de cellules pour l’expérimentation. La densité de faible porosité de la plaque de migration de chimiotactisme permet une équilibration plus lente du facteur chimiotactique gradient, plu de 72 h et imite plus efficacement le processus biologique de la migration chimiotactique sur une longue période de temps. Le protocole a été optimisé pour avoir une très fine couche de revêtement de collagène dans l’assiette de migration de chimiotactisme pour s’assurer que le dosage des mesures migration et pas d’invasion. Il facilite également l’imagerie et la quantification des cellules individuelles qu’ils adhèrent à la matrice de collagène, l’insertion de la membrane de revêtement. Cependant, une des limites de la technique sont que la quantification de la migration dans les puits multiples au fil du temps est grandement simplifiée et accélérée à l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières). Un avantage notable de l’essai de migration telle que décrite ici est la large capacité d’adaptation du protocole pour les autres types de cellules. Il sera particulièrement utile pour quantifier la migration chimiotactique des lignées de cellules qui sont soit à croissance lente, difficile d’adhérer ou de migrer lentement.
Pour assurer le succès du test de l’invasion de BTSC, il est nécessaire de collecter neurospheres avant qu’ils deviennent plus de 200 µm. grandes sphères ont un plan d’action qui est trop grand pour toujours l’image et à quantifier (Figure 5). En outre, neurospheres peut commencer à s’agglutiner et regrouper avec d’autres neurospheres. Ceci affecte l’acquisition des données exactes et cohérentes. En outre, il est essentiel que les neurospheres sont autorisés à s’installer sur le fond du puits, tandis que le collagène est toujours sur la glace, pour permettre le neurospheres à être photographiée sur un seul plan de mise au point (Figure 5). De même, il est important de laisser le collagène définir entièrement sans déplacer la plaque car cela peut perturber la formation d’une même matrice, ce qui pourrait nuire à la qualité de l’image (Figure 5). Pour le dosage d’invasion BTSC décrit ici, un des principaux avantages est que BTSCs cultivés comme neurospheres peuvent être évaluées pour invasion directement, sans avoir besoin d’être cultivées adherently. En outre, BTSC neurospheres peuvent être incorporés dans une matrice extracellulaire, soit à l’aide de différents composants de la matrice extracellulaire d’un tissu spécifique ou un mélange des membranes basales disponibles dans le commerce. Spécifiant la matrice extracellulaire peut aider à identifier ou tester des mécanismes spécifiques de l’invasion. Par exemple, avec ce protocole, il est possible d’évaluer l’effet de viser des membres de la famille de metallopeptidase de matrice de gènes, qui sont connus pour dégrader les constituants de la matrice spécifique. Sinon, même si ce protocole est spécifique à neurospheres BTSC, des cellules cultivées comme des sphères peuvent être utilisés de manière similaire. On peut citer les cellules mammaires cancéreuses cultivées comme mammospheres ou cancer colorectal primitif cellules cultivées comme tumorspheres ; Cependant, ce qui limite la technique pour les types de cellules qui peuvent se développer comme des sphères dans une culture. Autres avantages de la migration et l’invasion des dosages sont qu’ils sont faciles à mettre en place, ils travaillent dans un format 96 puits et les données sont quantifiables au fil du temps.
Dans l’ensemble, afin de prévenir la récurrence de GBM après le traitement, il est essentiel de développer des méthodologies qui facilitent l’enquête de BTSC migration et invasion. Le protocole de migration décrit ici offre de nombreux avantages sur les essais de migration précédemment établies, en particulier pour l’étude des BTSCs de GBM. Le protocole de cette migration améliorés implique dissociant BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère et plaquant des cellules individuelles dans une plaque à 96 puits recouvert collagène chimiotactisme migration. À l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes, la migration des BTSCs peut être surveillée et quantifiée au fil du temps. Le dosage d’invasion décrit ici permet la surveillance des invasions BTSC de neurospheres dans une matrice. Ce test consiste à intégrer les neurospheres dans une matrice de collagène, ou une autre matrice extracellulaire riche en protéines, dans une plaque à 96 puits. Imagerie de la plaque avec un système d’imagerie Time-lapse de cellules vivantes permet l’analyse des invasions BTSC dans des conditions de traitement différent au fil du temps. Ces tests, par conséquent, fournissent un outil précieux pour les scientifiques dans l’espoir de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent les migrations de BTSC et invasion.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Rozina Hassam et Orsolya Cseh pour leur soutien technique. Ce projet de recherche a été financée en partie par des subventions de la Fondation canadienne pour l’Innovation (pour H. Artee Luchman et Samuel Weiss) et le réseaux de cellules souches du Canada (aussi à H. Artee Luchman et Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
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