Summary
Her beskriver vi live-celle Bildeteknikker å kvantitativt mål for overføring og invasjonen av glioblastom hjerne svulst stamceller over tid og flere behandling vilkår.
Abstract
Glioblastom (GBM) er en aggressiv hjernesvulst som er dårlig kontrollert med de tilgjengelige behandlingstilbud. Nøkkel vise egenskaper av GBMs inkluderer raske spredningen og gjennomgripende invasjonen i normal hjernen. Regelmessighet er antatt å skyldes tilstedeværelse av radio - og kjemoterapi-resistant hjerne svulst stamceller (BTSCs) som invadere fra første kreft massen, og dermed unngå kirurgisk resection. Derfor kan behandling som BTSCs og deres invasiv evner forbedre ellers dårlig prognose av denne sykdommen. Vår gruppe og andre har etablert og preget BTSC kulturer fra GBM pasientprøvene. Disse BTSC kulturer demonstrere grunnleggende kreft stamcelleforskningen egenskaper som clonogenic selvtillit fornyelse, flere avstamning differensiering og svulst innvielse i immun mangelfull mus. For å forbedre de gjeldende terapeutiske metoder for GBM, er en bedre forståelse av mekanismer for BTSC overføring og invasjonen nødvendig. I GBM er studiet av migrasjon og invasjonen begrenset, delvis på grunn av begrensningene av eksisterende teknikker som ikke fullt ut forklares vekst i vitro egenskapene til BTSCs vokst som neurospheres. Her beskriver vi rask og kvantitativ live-celle tenkelig analyser for å studere både overføring og invasjonen egenskapene for BTSCs. Den første metoden beskrevet er BTSC overføring analysen som måler overføringen mot chemoattractant gradering. Den andre metoden beskrevet er BTSC invasjon analysen der bildene og kvantifiserer en mobilnettet invasjon fra neurospheres i en matrise. Analyser beskrives her brukes for kvantifisering av BTSC overføring og invasjonen over tid og vilkår forskjellig behandling.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den vanligste og aggressiv kreft i hjernen og til tross for den gjeldende terapien som involverer kirurgisk resection etterfulgt av stråling og kjemoterapi, median overlevelse av pasientene er bare 15 måneder1. GBM er invasiv, svært resistente, og til slutt en uhelbredelig sykdom som krever fortsatte forskningen i sin iboende biologi for å identifisere romanen terapeutiske veier. Den høye dødeligheten av GBM pasienter er hovedsakelig forårsaket av omfattende mobilnettet invasjonen i tilstøtende normal hjernevevet og overføringen langs blodkar, noe som fører til en gjentakelse av sykdommen etter behandling2,3 . En gruppe celler, kalles hjerne svulst stilk celler (BTSCs), som er trege sykling og terapeutisk motstandsdyktig, har vært antatt føre til sykdom regelmessighet. GBM BTSCs vise egenskaper clonogenic selvtillit fornyelse, multipotency og svulst-starte potensielle4,5,6. BTSCs også beholde den genetiske molekylære og fenotypiske heterogenitet deres overordnede GBM svulster7,8,9,10. Disse egenskapene gjør BTSCs en svært nyttig modellsystem for studier av GBM og for å utforske romanen strategier. I vivo, disse stammen som cellene er i stand til tumor formasjon, vekst og invasjonen når implantert i hjernen av neonatal rotter11 ikke-obese diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NIKKER/SCID) mus4. Evnen til å BTSCs til gjentatte ganger invasjonen svulst i vivo recapitulate mobilnettet og histologiske kjennetegner deres opprinnelige tumorer sterkt støtter sin rolle som svulst-starte celler12.
Romanen terapeutiske metoder blir utviklet til målet BTSCs og forbedre om langsiktig utkom for GBM pasienter. Det er foreløpig begrenset forståelse av mobilnettet migrasjon og invasjonen prosessene som er tilknyttet terapeutiske motstand og regelmessighet. Migrasjon og invasjonen er tydelig fenomen; migrasjon er prosessen underliggende regissert bevegelsen av celler og innebærer omorganiseringen av cytoskjelett, vedheft molekyler og montering/demontering av fokal kontaktpunkter, mens invasjonen krever også fysisk ødeleggelse av barrierer som en ekstracellulær matrix13. En allment akseptert metode av celle migrasjon og invasjonen er den Boyden Chamber analysen14,15. For denne teknikken fylt en dobbel kammer med medier, med media i bunnen kammeret supplert med en chemoattractant. Chemotaxis utløses bruker bestemte vekstfaktorer eller cytokiner eller fosterets bovin serum som en uspesifisert chemoattractant. Etter gradient av chemoattractant overføre celler gjennom porøs membran. På sluttpunktet, kan migrerte cellene visualisere og kvantifisert på undersiden av membran av flekker med fargemaskin eller fluorescerende fargestoffer. Boyden overføring analysen kan endres til en invasjon analysen av belegg den porøse filtrere med ekstracellulær matrix komponenter som type jeg kollagen eller en kjeller membran som matrise. Invasiv celler fornedre matrix, bla gjennom nederst i porøse filteret og kan kvantifiseres på en lignende måte til overføring analysen. Andre brukte migrasjon analyser inkluderer scratch sår og celle sonen søk13. Scratch såret analysen utføres av skrape et hull i en mobilnettet monolayer og observere migrering av celler fra kanten av såret av tenkelig regelmessig til scratch lukkes. I celle utelukkelse analysen, en fysisk barriere til å opprette en celle-fri sone før Såing av celler. Barrieren er fjernet når cellene er confluent og migrering av cellene i celle-fri sone er fotografert regelmessig16.
Disse etablerte analyser brukes ofte for å studere migrering eller invasjon av tilhenger og homogen celle populasjoner, men utgjør betydelig ulemper ved å studere GBM BTSCs eller andre heterogene kreft celle populasjoner. Boyden kammeret analysen kan bare generere endepunktet mål mot en kinetisk vurdering av cellen bevegelse. En observasjon over tid er høy relevans for måling av BTSC migrasjon, gitt at celler fra ulike kulturer ofte migrere til ulike priser. Som sådan, betingelsene og tidspunktet for analysen må være optimalisert for hver kultur og krever tidkrevende arbeid for tilstrekkelig prøvetaking og kvantifisering. Bunnen og celle utelukkelse analyser ikke er velegnet til BTSC kulturer som, selv når BTSCs er kultivert under monolayer forhold på laminin-belagt plater, vi har observert at BTSCs synes å motstå bevegelse i den åpne plassen og foretrekker å bo i lukke nærhet til andre celler. Videre etablerte disse migrasjon analyser ikke tillater for visualisering og overvåking av enkeltceller i et eksperiment. Overvåking av individuelle celler over tid er verdifull for vurderingen for heterogene celle populasjoner som BTSCs. ekstra ulemper ved de Boyden kammer, bunnen og celle-ekskludering sone analyser for BTSC kulturer er som de krever relativt høyt tall, kan være tidkrevende å definere, og enten raskt equilibrate eller har ikke chemoattractant gradering. Som sådan, er disse analyser ikke ideelt å bruke for sjeldne eller sakte voksende celle populasjoner eller narkotikarelaterte screening. Videre er disse analyser ikke egnet for å måle en invasjon i en tredimensjonal (3D) format, som er spesielt viktig for BTSCs vokst under neurosphere forhold.
Her beskriver vi analyser spesielt modifisert for observasjon og kvantifisering av overføringen for individuelle BTSCs og invasjonen av GBM BTSCs kultivert som neurospheres. Første analysen beskriver en tilpasning av Boyden kammeret analysen bruker live-celle tidsinnstilt bildebehandling og chemotaxis migrasjon plate for å måle chemotactic celle migrasjon13. Live-celle bildebehandling i flere godt format gjør at visualisering og kvantifisering av celle migrasjon under flere behandling forhold. Andre analysen beskrevet her er en spheroid invasjonen analysen13,17, som måler egenskapene invasiv BTSCs kultivert under neurosphere forhold og innebygd i en 3D ekstracellulær matrix under ulike behandling forhold. Samlet er disse analyser mye mer kompatibel enn tidligere beskrevet metoder for å studere vandrende og invasive egenskapene for heterogene BTSC kulturer. De tilbyr også bedre muligheter for etterforskningen av romanen strategier mot både overføring og invasjon, som bidrar betydelig til sykdommen tilbakefall og dødelighet.
Protocol
1. dyrking hjerne svulst stamceller tidligere avledet fra menneskelige glioblastom eksemplarer
Merk: BTSC kulturer tidligere opprettet fra menneskelige GBM pasientprøvene6,7,8,9,10.
- Tine ampuller med cryogenically bevarte BTSCs i et beaker med 70% etanol, plassert inne i et vannbad ved 37 ° C, like før sist isen har tint. Fortynne tinte cellene i 10 mL av medier i et 15 mL konisk rør og sentrifuge cellene på 150 relative sentrifugalkraften (RCF) i 7 min.
Merk: Gjennom disse protokollene komplett refererer til standard mediet kultur BTSCs (tidligere beskrevet av Kelly et al.) 6, vanligvis med vekstfaktorer finnes. Media uten vekstfaktorer refererer til base media med alle komponentene, men uten noen vekst faktorer supplert. - Sug opp media resuspend cellene i 8 mL komplett og overføre celler og media til en T25 kolbe.
- Etter en uke med dyrking vilkår ikke-tilhenger, overvåke kolbe daglig og supplere innholdet med 1-2 mL komplett behov, hvis media begynner å utarme eller begynner å bli syrlig som indikert av en oransje-gul fargeendring. Passasjen celler når neurospheres når en diameter på ca 250 μm, vanligvis mellom 10-14 d (figur 1).
Merk: Ulike BTSC kulturer dobling tid varierer. Neurosphere størrelse kan måles med en okulær mikrometer. - For å passasje BTSCs, samle media og neurospheres av pipettering media ned overflaten av flasken for å samle alle neurospheres og overføre dem til en 15 mL konisk rør og sentrifuge røret i 7 min på 150 RCF.
Merk: Kolber kan bli sjekket under et mikroskop for å sikre at alle neurospheres er samlet. En ekstra vask med 5 mL fosfat bufret saltvann (PBS) eller media kan utføres for å samle alle gjenværende neurospheres etter behov. - Hvis du vil oppheve tilknytningen BTSC neurospheres i enkeltceller, Sug opp media og legge 1 mL av forvarmes cell avdeling løsningen og ruge at ved 37 ° C i 7 min. Triturate BTSC suspensjon 40 x med en P1, 000 brønnene satt til 800 μL.
Merk: Celler kan være ruges lenger på 37 ° C hvis neurospheres ikke oppheve tilknytningen. - Legge til 5 mL av PBS (med antibiotika penicillin og streptomycin) avstand BTSCs og sentrifuge cellene på 150 RCF i 7 min.
- Sug opp nedbryting og resuspend BTSCs i 1-4 mL komplett medier, avhengig av det cellen pellet.
Merk: Cellen suspensjon må fortynnes ytterligere hvis konsentrasjonen er nøyaktig påvisning grensen for nøyaktig celle opptelling. - Bruker et fargestoff som utelukker døde celler, for eksempel trypan blå, antall levedyktige cellers og frø av BTSCs inn i flasken eller plate av interesse-vanligvis 200 000-300.000 celler i 8 mL komplett medier i en T25 bolle.
2. hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon analysen
- Frø 200.000 celler i en T25 bolle i 8 mL komplett medier 1-2 uker før du planlegger å utføre en overføring analysen.
Merk: Tiden mellom plating og utfører analysen vil variere avhengig av veksten av BTSC kulturen brukes.- For å teste effekten av en behandling på migrasjon, pretreat cellene med aktuelle kjøretøyet, som DMSO og stoff av interesse ved å legge til gjeldende mengder kjøretøy eller narkotika lager direkte i separate brønner medietyper som inneholder cellene.
- Klargjør chemotaxis migrasjon platen (figur 2A) ved belegg det med et tynt lag av kollagen.
- Beregne antall ble en 96-brønns chemotaxis plate må være belagt med kollagen. Inkluder minst tre Repliker brønner for hvert vilkår.
- Fortynne 5 mg/mL av aksjer i skriver jeg kollagen å 0,2 mg/mL i ren eddiksyre utvannet til 0.14% i kultur klasse vann.
- Pipetter 0,2 mg/mL av kollagen både membran sett inn brønnene og bunnen reservoaret brønnene som brukes.
Merk: Bunnen reservoarene av platen krever 225 µL og membran sett inn brønnene krever 75 µL av kollagen for en skikkelig belegg. - Sted migrasjon platen i en inkubator på 37 ° C for 1 h. Sug opp kollagen løsningen fra brønnene uten å skrape den kollagen belegget.
- Vask brønnene 2 x med sterilt 1 x PBS. Hvis platen ikke brukes umiddelbart, Sug opp PBS og lagre den på 4 ° C 2 uker. Før bruk, varme chemotaxis migrasjon platen til romtemperatur.
- Forberede bunnen reservoaret av chemotaxis migrasjon plate.
- Pipetter 225 µL av media (uten vekstfaktorer), supplert med 10% FBS som en chemoattractant, bunnen reservoaret fordelt av chemotaxis migrasjon plate.
- Forsiktig plassere membran innsatsen i bunnen reservoaret på vinkel for å unngå å skape bobler.
- Plate cellene i membranen sett av chemotaxis migrasjon plate.
- Resuspend skilt BTSCs i media (uten vekstfaktorer) på en celle tetthet på 50 000 celler/mL. Legge til narkotika til media hvis vurdere migrasjon ved ulike behandlinger. Eventuelt frø lik antall pre-behandlet cellene og kontroll, mens den endelige narkotika konsentrasjonen når plating.
- Plate 50 µL av BTSCs fra trinn 2.4.1 i hver brønn av migrasjon plate under ønsket behandling forhold.
- Bilde chemotaxis overføringen.
- Plasser chemotaxis migrasjon platen inn i live-celle tenkelig system og angi den automatiserte bildebehandlingsprogramvare hente mikroskopiske bilder av platen hver 1-2 h for opptil 72 h. bruke kommersiell programvare (se Tabell for materiale), høyreklikk på den tidslinje og sette skanning intervallet til hver 2t for 24 timer.
Merk: Tidsintervall og totale tiden vil variere mellom BTSC kulturer brukes; Start med 2t intervaller for 72 h til erfaring har fått med individuelle BTSC og kulturer. Hvis et automatisert tenkelig system er tilgjengelig, så bilder av samme synsfelt kan skaffes manuelt med et mikroskop og et kamera koblet til tenkelig programvare. - Når bildet oppkjøpet er fullført, få bildene for hele eksperimentet og opprette en behandling definisjon ved hjelp av analyseprogramvare som skiller celler fra bakgrunnen membranen og migrasjon porene (figur 2B, rød maske) . Bruk av kommersiell programvare (se Tabell for materiale), Velg en Ny behandling definisjon og angi behandling definisjon innstillingene for BTSCs en frø terskelen av 52, en vokse terskelen av 85, størrelse (piksler) -1 og et minimum området 200 μm2. Bruk denne behandlingen definisjonen på undersiden av membranen. Endre denne analysen hvis det ikke nøyaktig skiller celler fra bakgrunnen membranen.
- Samle data cellen overflaten på undersiden av membranen for hver av de tre Repliker brønnene, som bare teller cellene som har vandret gjennom porene. Graf migrering av cellene i μm2 (celleområde overført) over tid (figur 2 C, Figur 3).
Merk: Kontroller at den relative antallet celler belagt og telles på overflaten av membranen på første gang-punktet er like (mindre enn 20% variasjon mellom alle brønnene) mellom alle behandling forhold å unngå eventuelle effekter av ujevn plating. Data samling ved hjelp av kommersiell programvare (se Tabell for materiale) kan utføres ved å lansere behandling definisjonen opprettet i trinn 2.5.2, klikke på beregninger, deretter på grafen/eksport, og deretter på for dataeksport .
- Plasser chemotaxis migrasjon platen inn i live-celle tenkelig system og angi den automatiserte bildebehandlingsprogramvare hente mikroskopiske bilder av platen hver 1-2 h for opptil 72 h. bruke kommersiell programvare (se Tabell for materiale), høyreklikk på den tidslinje og sette skanning intervallet til hver 2t for 24 timer.
3. hjerne svulst stilk cellen Neurosphere invasjon analysen
- Frø 200.000 cellene i 8 mL komplett medier i en T25 bolle 1-2 uker før du planlegger å utføre en invasjon analysen.
Merk: Timing fra plating å utføre analysen vil avhenge spredning prisen BTSC kultur brukes.- For forbehandlet celler, legge til sammensatt interesse kolbe på ønsket konsentrasjonen for forhåndsbestemt tid kurs før neurospheres er klar til å være belagt for invasjon.
- Vent til gjennomsnittlig neurosphere er ca 150-200 μm; vanligvis tar dette 7-14 d, avhengig av BTSC kulturen brukes.
Merk: Det er vanlig å observere en fordeling av kule størrelser i flasken. - Tips og forsiktig blanding flasken med en pipette og flytte 500 μL BTSC neurospheres til en 1,5 mL konisk rør for hver behandling tilstand; Dette vil bli brukt til plate tre Repliker brønner.
Merk: Trinn 3.3.1 - 3.3.2 er valgfritt, men anbefales for første invasjon forsøket på en ny BTSC kultur.- For å bestemme tettheten av neurospheres som vil ende opp i brønnen, forberede en 1,5 mL tube som i trinn 3.3. Forsiktig blanding av neurospheres og flytte 100 μL til en separat 96-brønns plate og la neurospheres betale av tyngdekraften for 5 min.
- Sjekk av neurospheres under mikroskop for å sikre flere neurospheres er i regionen i brønnen som blir vist uten overbefolkning det.
Merk: Invaderende neurospheres krever plass med tredobbelt diameter uten samspill med nabokommunene neurospheres. Antall neurospheres per brønn kan justeres ved å telle antall neurospheres per brønn og legge til flere eller færre neurospheres fra T25 kolbe til 1,5 mL konisk røret i trinn 3.3.
- Sett 1,5 mL konisk røret med celler fra trinn 3.3 på is og fremgangsmåten 3.5-3.7 på is.
- La neurospheres slå av tyngdekraften til bunnen av 1,5 mL konisk røret på 5 min og prechill en merket 96-brønns plate på is.
- Resuspend neurospheres på ekstracellulær matrix proteiner.
- Forberede 500 μL en 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen løsning på is for hver behandling betingelse: 459 μL media (uten vekstfaktorer), 40 μL 5 mg/mL kollagen lager løsningen og 0,92 μL sterilt 1N NaOH (tabell 1).
Merk: 500 μL kollagen løsningen kreves per behandling betingelse: 100 μL av hver av de tre Repliker brønnene og 200 μL av overskytende. Medikamentelle behandlinger må legges til her på ønsket endelige konsentrasjonen, trekkes fra media komponenten i løsningen. Denne protokollen beskriver bruken av skriver jeg kollagen som ekstracellulær matrix proteiner; men kan noen ekstracellulær matrix proteiner testes. I tillegg til BTSC kan kulturer som har lavere priser på invasjon, vekstfaktorer eller FBS suppleres i media for å øke frekvensen av invasjonen. - Etter neurospheres fra trinn 3.5 har avgjort, Sug opp så mye av media som mulig uten å miste det neurosphere pellet som har avgjort på bunnen. Forsiktig resuspend neurospheres i 500 μL kollagen løsningen i trinn 3.6.1.
- Forberede 500 μL en 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen løsning på is for hver behandling betingelse: 459 μL media (uten vekstfaktorer), 40 μL 5 mg/mL kollagen lager løsningen og 0,92 μL sterilt 1N NaOH (tabell 1).
- Tilsett 100 μL av kollagen og neurosphere blandingen tre Repliker brønner i 96-brønnen plate is. Tillate neurospheres å bosette seg på is til 5 minutter.
- Overføre 96-brønns platen til en 37 ° C inkubator for 5 min å tillate kollagen polymerisasjon.
- Umiddelbart forberede å image 96-brønns platen.
- Plass 96-brønns platen i skuffen på en live-celle tenkelig system eller på scenen i et mikroskop for å skaffe et bilde som referanse for neurosphere størrelsen på tidspunktet for plating, før invasjonen begynner.
- Hente bilder hver time til frekvensen av invasjonen har plateaued; Dette oppstår vanligvis innen 24 timer.
Merk: Bildebehandling intervallet kan endres avhengig av utstyret som brukes. Tenkelig intervall og total medgått tid kan også endres for BTSC kulturer som har ulike priser for invasjon.
- Bestemme økende areal på BTSCs som de invadere matrisen over tid.
Merk: Arealet av celler ved plating, beregnet som gjennomsnittet av tre Repliker brønner, må være lik (mindre enn 20% variasjon mellom alle brønnene) mellom ulike behandling-forhold for å sikre forskjellene i BTSC invasjonen ikke er sterkt påvirket av antall eller størrelsen på neurospheres belagt.- For live-celle analyse systemet, bruker et 10 X mål for bilde oppkjøpet og kjøpe fire bilder per brønn for tre gjenskape brønner. For å bestemme relative celle areal, representert som prosent samløpet av brønnen satt opp en behandling definisjon som spesielt fremhever cellene over bakgrunnen av brønnen. Bruk av kommersiell programvare (se Tabell for materiale), velger du en ny definisjon for behandling og sette segmentering justeringen til 0.8, området minst 300 μm2og eksentrisiteten maksimum til 0,99. Endre denne analysen hvis det ikke nøyaktig skiller celler fra bakgrunnen.
Merk: Hvis bruker andre metoder for bildet neurosphere invasjon over tid, er det anbefalt å hente flere synsfelt for tre gjenskape brønner over tid. Men vil ikke tenkelig nøyaktig samme synsfelt på hvert intervall øke standardfeilen for de innsamlede dataene. Programvare kan brukes til å måle areal invaderende cellene i hvert bilde. - Samle data overflaten for total-cellen (relativ eller absolutt) for hver godt på hvert tidspunkt og finne gjennomsnittet av tre Repliker. Graf invasjonen av BTSCs ved å plotte økende celle området over tid.
Merk: Datainnsamling ved hjelp av kommersiell programvare (se Tabell for materiale) kan utføres ved å lansere behandling definisjonen opprettet i trinn 3.10.1, klikke på beregninger, og deretter på grafen/eksport, og deretter på dataeksport .
- For live-celle analyse systemet, bruker et 10 X mål for bilde oppkjøpet og kjøpe fire bilder per brønn for tre gjenskape brønner. For å bestemme relative celle areal, representert som prosent samløpet av brønnen satt opp en behandling definisjon som spesielt fremhever cellene over bakgrunnen av brønnen. Bruk av kommersiell programvare (se Tabell for materiale), velger du en ny definisjon for behandling og sette segmentering justeringen til 0.8, området minst 300 μm2og eksentrisiteten maksimum til 0,99. Endre denne analysen hvis det ikke nøyaktig skiller celler fra bakgrunnen.
Representative Results
Her beskriver vi eksempler som kan oppnås ved hjelp av live-celle tenkelig analyser BTSC overføring og invasjon. BTSCs er belagt som enkeltceller og kan dyrkes som frittflytende neurospheres (figur 1). Vi viser at BTSCs enzymene og belagt i brønnene av membran sette i en chemotaxis migrasjon plate som er belagt med et tynt lag av typen kollagen (figur 2A). Personlige BTSCs er jevnt spredt på membran innsatsen i begynnelsen av analysen. Over en periode av 24-72 h, celler overholder membran, flytte langs kollagen-belagt overflaten og vandrer gjennom en av de 96 små porene til undersiden av membranen, mot en chemoattractant i reservoaret også. Etter utheving cellene på membranen i gult, porene i blått og cellene i bunnen av membranen i rødt, celler kan bli sett inn pore øverst (gul celle nærmer seg en blå pore) og avslutter pore nederst (røde celle utgang ing blå pore) (Figur 3). Viktigere, kan celler være narkotika-behandlet og belagt i samme chemotaxis migrasjon plate som kjøretøy-behandlet kontroll celler å studere effekten av terapeutisk intervensjon på BTSC overføring (figur 2B). Chemotaxis migrasjon platen tillater avbilding av celler både på toppen og bunnen av membran sette. Derfor er kvantifisering av celle migrasjon over tid mulig ved å telle celler som har migrert til undersiden av membranen (figur 2C).
Vi har funnet at hvis BTSCs ikke er fullstendig atskilt, deretter celler ikke vandrer gjennom porene og forblir liten neurospheres (figur 4A). Det er også viktig å ikke platen mer enn 2500 BTSCs/godt som dette resulterer i celle clumping ikke i migrasjon til undersiden av membranen (figur 4B). Til slutt, er det viktig å unngå å gjøre bobler i membranen setter brønner når plating celler og når å plassere membranen sett inn på bunnen reservoaret, som dette forhindrer nøyaktig bildebehandling og kvantifisering (figur 4C).
Deretter viser vi at BTSC invasjon, fra neurospheres til omkringliggende matrisen, kan avbildes og kvantifisert over tid i 96-brønnen plate format (figur 5A). Invasjonen kan måles ved kvantifisere areal på cellene som de invadere matrisen over tid. Bruker analyseprogramvare, ble en behandling definisjon brukt som overlegg en maske på cellen overflaten området, som muliggjør automatisk kvantifisering over tid (figur 5B). Time-lapse videoer av BTSC invasjoner kan også opprettes for å observere prosessen til BTSC invasjon (figur 6). Fluorescerende mikroskopi kan i tillegg brukes til bilde BTSCs som uttrykker fluorescerende proteiner, som grønne fluorescerende protein (GFP) eller røde fluorescerende protein (RFP). Her har vi laget en time-lapse video av BTSCs uttrykke en cytosolic form for GFP for å spore individuelle BTSCs som de invadere en kjeller membran som matrise (figur 7). Denne BTSC neurosphere invasjon analysen kan også medikamentelle behandlinger legges i Repliker brønner å direkte vurdere deres effekter på BTSC invasjon fra neurospheres i en matrise (figur 8A). Kvantifisering av flere neurospheres i Repliker brønner kan beregnes og grafisk over tid å vurdere effekten av legemidler på flere konsentrasjoner (figur 8B).
Unnlatelse av å følge protokollen beskrevet ovenfor kan føre til en manglende evne til å få pålitelige og nøyaktige data. Embedding BTSC neurospheres som er for stor, fører med en diameter større enn 200 μm, til en flyet av fokus som er for stor til å tallfeste nøyaktig alle områder i en synsfelt (Figur 8 c). Tilsvarende kan beholde matrisen ved 4 ° C og innebygging av neurospheres også føre til kuler som ikke er det samme flyet av fokus og en ekstracellulær matrix som ikke har styrket jevnt, som hindrer samlingen av nøyaktige data (figur 8D ).
Figur 1: dyrking BTSCs. Disse sidene er et representativt eksempel på BTSCs vokst fra enkeltceller til neurospheres over en 14-d periode i kultur. Neurospheres vises her på dag 14 er en passende størrelse for passaging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Live-celle avbildning av en BTSC overføring. (A) Dette er et eksempel på en 96-brønns chemotaxis migrasjon plate belagt med et tynt lag av typen jeg kollagen før du utfører overføringen analysen med BTSCs. Bildene viser i) en plate med alle tre deler (lokk, membran insert og reservoar) plassert sammen ii) alle tre deler atskilt, iii) et nærbilde bilde av den øverste visningen av membran sette, iv) et nærbilde bilde av den nederste visningen av membran sette og v) et nærbilde bilde av bunnen reservoaret. (B) Dette er representativt bilder av en BTSC-overføring ved starten (0 h) av eksperimentet og på 24 h. Bildet fokuserer på membran innsatsen der cellene var opprinnelig belagt. Celler som har migrert til bunnen av chemotaxis migrasjon platen er uthevet i rødt. På 0 h, har noen celler migrert til undersiden av membranen. Etter 24 timer, har antall overførte celler økt dramatisk. Sammenligning av bildene på 24 h for cellene behandlet med et kjøretøy vs stoffet X viser at behandlingsapparatet reduserer BTSC overføring. Den skala barer representerer 600 µm. (C) dette panelet viser kvantifisering av en BTSC-overføring etter forbehandling med et kjøretøy eller stoffet X. Grafen viser at behandlingsapparatet har en sterk innvirkning på overføringen av BTSCs. Datapunktene er gjennomsnittet av tre tekniske Repliker brønner feilfeltene representerer standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Animert figur 3: BTSC overføring Intervallfoto. Denne videoen viser migrering av BTSCs med en type jeg kollagen-belagt chemotaxis migrasjon plate. Cellene på membran innsatsen utheves i gult, celler som har migrert til bunnen av membran sette er uthevet i rødt og porene i membranen er uthevet i blått. Flyet av fokus settes til bilde celler på undersiden av membranen. Videoen ble opprettet med time-lapse bilder tatt hver time 51 h og kompilert med 4 bilder per sekund. Baren skala representerer 200 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 4: eksempler på feil i overføring analysen oppsettet. (A) dette panelet viser et eksempel på BTSCs som ikke ble fullstendig atskilt før plating på topp membran innsatsen av chemotaxis migrasjon plate. Den store størrelsen av kulene og den lille størrelsen på membran porene er cellene kan ikke overføre til bunnen reservoaret. (B) dette panelet viser et eksempel på en overføring analysen hvor mange celler var belagt. Klumper av cellene forstyrrer celle migrasjon og svekker kvantifisering. (C) dette panelet viser et eksempel på boble formasjon på membran innsatsen der BTSCs var belagt. Bobler føre til dårlig bildekvalitet og hindre en nøyaktig kvantifisering av migrasjon. Skala stolpene angir 600 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: BTSC neurosphere invasjon analysen. Disse skjermbildene viser et eksempel på BTSCs invasjon fra en neurosphere til en 0,4 mg/mL type jeg kollagen matrise løpet 6 h. Her, vises (A) fase kontrast bilder på hver tidspunkt (B) med representant kvantitative maske kledde, som beskrevet i detalj i protokollen trinn 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: BTSC neurosphere invasjon time-lapse video i type I-kollagen. Denne videoen viser en invasjon av BTSCs fra en neurosphere til en 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen matrix (også vises som stillbilder i figur 5A). Bildene ble kjøpt med en 10 X mål hver time for 12t og kompileres på 4 bilder per sekund. Baren skala representerer 300 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 7: BTSC neurosphere invasjon time-lapse video i en kjeller membran som matrise. Denne videoen viser en invasjon av BTSCs, som uttrykker cytosolic GFP, fra en neurosphere i en kjeller membran som matrise. Bildene ble kjøpt med en 4 X målsetting enhver 30 min for 48 timer og ble kompilert med 8 bilder per sekund. Baren skala representerer 800 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 8: BTSC neurosphere invasjon analysen med behandling. (A) BTSC neurospheres ble bygd inn i en kjeller membran som matrise med kjøretøy eller angitte konsentrasjonen av narkotika X. bildene ble anskaffet per time. vist her er bilder tatt på plating og etter 16 h. Baren skala representerer 200 µm. (B) en invasjon av BTSCs fra neurospheres inn i omkringliggende matrix ble kvantifisert hver time, som beskrevet i protokollen trinn 3. Datapunktene er gjennomsnittet av tre tekniske Repliker brønner feilfeltene representerer standard feil av gjsnitt (SEM). (C) dette panelet viser BTSC neurospheres innebygd i type jeg kollagen med en kule som er for stor for kvantifisering. Baren skala representerer 300 µm. (D) dette panelet viser BTSC neurospheres innebygd i type jeg kollagen som ikke har helt satt. Baren skala representerer 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kollagen løsning forberedelse | |
| Lager [kollagen] (mg/ml) | 5 |
| Final [kollagen] (mg/ml) | 0,4 |
| Antall brønner nødvendig: | 5 |
| Totalt volum (μl) | 500 |
| Volumet av lager kollagen (μl) | 40 |
| Volumet av 1N NaOH (μl) | 0,92 |
| Volumet av media (μl) | 459 |
Tabell 1: Forberedelse av 0,4 mg/mL skriver jeg kollagen løsning. Oppført er kjent starter og ønsket endelige konsentrasjoner av typen jeg kollagen løsning. Volumene som er oppført er tilstrekkelig til platen neurospheres inn tre Repliker brønner, pluss to for overflødig, og kan inneholde en enkelt behandling tilstand, som beskrevet i detalj i protokollen trinn 3.
Discussion
Gitt at kreftceller er aktivt proliferating, utgjør dette en potensiell teknisk utfordring for studier av celle migrasjon. BTSCs er belagt uten vekstfaktorer, som begrenser spredning migrasjon analysen beskrevet her, og chemoattractant graderingen av chemotaxis platen fullt equilibrate ikke over 72 timer. I tillegg som cellene blir overvåket med live-celle imaging over tid, kan celler visuelt overvåkes for å sikre omfattende celledeling ikke skjer. For suksessen til overføring analysen er det viktig å distansere neurospheres helt til enkeltceller og å telle celle tall før plating. Kontaktflate kuler eller plating for mange celler, som resulterer i klumper, kan hindre cellene migrerer gjennom små porene (figur 4A og 4B). Det er også viktig å unngå å skape bobler når plating cellene i chemotaxis migrasjon platen eller plassere membran innsatsen på bunnen reservoaret. Bobler kan endre flyet av fokus og hindre nøyaktig kvantifisering (figur 4C). Hele platen må være belagt med et tynt lag av kollagen fordi dette gir cellene en overflate å navigere på porene på plate, som denne analysen krever cellene overholder og deretter overføre over en biologisk relevante overflate mot chemoattractant.
BTSC overføring protokollen beskrevet her gir kinetic vurdering av enkeltcelle overføring krever færre celler for å teste ulike behandling forhold sammenlignet med eksisterende protokoller. Dette er viktig for kulturer som vokser svært sakte, så det kan være vanskelig å samle et stort antall celler for eksperimentering. Lav pore tettheten av chemotaxis migrasjon platen gir en tregere balanse av chemoattractant gradient, større enn 72 h, og mer effektivt etterligner biologiske prosessen med chemotactic overføring over en lengre periode. Protokollen var optimalisert for å ha et meget tynt lag av kollagen belegg på chemotaxis migrasjon plate å sikre at analysen tiltak migrasjon og ikke invasjon. Den letter også bildebehandling og kvantifisering av enkeltceller som de overholder kollagen matrix belegg membran innsatsen. Imidlertid en begrensning av teknikken er at kvantifisering av overføringen over flere brønner over tid er sterkt forenklet og rask bruk av kommersiell programvare (se Tabell for materiale). En betydelig fordel av migrasjon analysen er som beskrevet her bredt tilpasningsevne protokollen til andre celletyper. Det vil være spesielt nyttig for kvantifisere chemotactic migrering av cellelinjer som enten langsom voksende, vanskelig å følge, eller overføre sakte.
For å sikre suksess for BTSC invasjon analysen, er det nødvendig å samle neurospheres før de blir større enn 200 µm. større kuler har en flyet av fokus som er for stor til å konsekvent bilde og kvantifisere (figur 5C). Videre kan neurospheres begynne å klumpen og samlet med andre neurospheres. Dette påvirker anskaffelsen av nøyaktig og konsekvent data. I tillegg er det viktig at neurospheres tillates å bosette seg på bunnen av brønnen kollagen er fortsatt på is, å tillate neurospheres å avbildes i en enkelt flyet av fokus (figur 5 d). På samme måte er det viktig at kollagen fullt installere uten å flytte platen som dette kan forstyrre dannelsen av en selv matrix, som kan negativt påvirke bildekvaliteten (figur 5 d). BTSC invasjon analysen beskrevet her, er en av de store fordelene at BTSCs kultivert som neurospheres kan vurderes for invasjon direkte, uten å bli dyrket adherently. Videre kan BTSC neurospheres være innebygd i noen ekstracellulær matrix, enten ved hjelp av individuelle komponenter av den ekstracellulære matrisen fra en bestemt vev eller en kommersielt tilgjengelig kjelleren membran blanding. Angi den ekstracellulære matrisen kan bidra til å identifisere eller teste spesifikke mekanismene for invasjon. For eksempel med denne protokollen er det mulig å vurdere effekten av målretting enkeltmedlemmer i matrise metallopeptidase familien av gener som er kjent for å svekke bestemt matrix komponenter. Selv om denne protokollen gjelder BTSC neurospheres, kan eventuelt celler dyrket som kuler brukes på en lignende måte. Eksempler inkluderer brystkreft celler kultivert som mammospheres eller primære tykktarmskreft celler kulturperler som tumorspheres; men begrenser dette teknikken til celletyper som kan vokse som kuler i en kultur. Andre fordeler av både overføring og invasjonen analyser er at de er enkle å definere, de arbeider i 96-brønnen format og dataene er kvantifiserbare over tid.
Samlet for å hindre etter behandling GBM regelmessig, er det viktig å utvikle metoder som lette etterforskningen av BTSC migrasjon og invasjon. Overføring protokollen beskrevet her gir mange fordeler over tidligere etablert migrasjon analyser, særlig for studier av GBM BTSCs. Denne forbedrede overføring protokollen innebærer dissociating BTSCs kultivert under neurosphere forhold og plating enkeltceller i en 96-brønns kollagen-belagt chemotaxis migrasjon plate. Med en live-celle tenkelig system, kan migrering av BTSCs overvåkes og kvantifisert over tid. Invasjonen analysen beskrevet her kan for overvåking av BTSC invasjoner fra neurospheres i en matrise. Denne analysen omfatter innebygging neurospheres i en kollagen matrise eller en annen proteinrik ekstracellulær matrix, i en 96-brønns plate. Avbildning av platen med en live-celle time-lapse tenkelig system tillater analyse av BTSC invasjoner vilkår forskjellig behandling over tid. Disse analyser, gir dermed et verdifullt verktøy for forskere håper å forstå mekanismene bak BTSC migrasjon og invasjon.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Rozina Hassam og Orsolya Cseh deres kundestøtte. Dette ble støttet delvis av tilskudd fra Canada grunnlaget for innovasjon (å H. Artee Luchman og Samuel Weiss) og Stem Cell nettverk i Canada (også til H. Artee Luchman og Samuel Weiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
