Neutrofila extracellulära fällor som genereras av låg densitet neutrofiler erhållits från Peritoneal Lavage vätska medla tumör celltillväxt och fastsättning
Summary
Här presenterar vi en metod där mänskliga låg densitet neutrofiler (LDN), återhämtat sig från postoperativ peritoneal lavage vätska, producerar massiva neutrofila extracellulära fällor (nät) och effektivt fälla gratis tumörceller som därefter växer.
Abstract
Aktiverade neutrofiler release neutrofila extracellulära fällor (nät), som kan fånga och förstöra mikrober. Nygjorda studier föreslår att nät är inblandade i olika sjukdomsprocesser, såsom autoimmuna sjukdom, trombos och tumör metastaser. Här visar vi en detaljerad i vitro -teknik för att upptäcka NET aktivitet under fångst av gratis tumörceller, som växer efter fastsättning nät. Först samlade vi låg densitet neutrofiler (LDN) från postoperativ peritoneal lavage vätska från patienter som genomgick laparotomies. Kortsiktiga odling av LDN resulterade i massiva NET formation som var visualiserat grön fluorescerande kärnkraft med kromosomen motfärg. Efter samtidig inkubering av mänskliga gastric cancer cellinjer MKN45, OCUM-1 och NUGC-4 med nät, var många tumörceller instängda av näten. Därefter, den bifogade filen upphävdes helt av nedbrytningen av nät med DNAS I. Time-lapse video avslöjade att tumörceller fångade av näten inte dog men istället ökade kraftigt i en kontinuerlig kultur. Dessa metoder kan tillämpas vid påvisande av självhäftande interaktioner mellan nät och olika typer av celler och material.
Introduction
Polymorph nukleära neutrofiler i cirkulerande blod separeras vanligtvis från mononukleära celler via metoden täthet lutning förberedelse. Men är vissa neutrofiler som kallas låg densitet neutrofiler (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) och CD14(-) fenotyper, samtidig renat med mononukleära celler. Det relativa antalet LDN ökar markant i olika sjukliga tillstånd inklusive autoimmuna sjukdomar1,2, sepsis3och cancer4,5. Tidigare studier har visat att LDN är en fenotypiskt och funktionellt distinkta klass av neutrofiler6. Det bör noteras att LDN i cirkulerande blod är mer benägna att producera neutrofila extracellulära fällor (nät) än normala täthetsfunktionen neutrofiler2,7. Näten är web-liknande strukturer består av nukleinsyror, histoner, proteaser och granulat och cytosoliska proteiner, och de kan effektivt snärja och förstöra patogener8.
NETs har nyligen visat att fånga inte bara mikrober, men också trombocyter och cirkulerande tumörceller som kan bistå tromb bildas9 och tumören metastaser10,11. De molekylära mekanismerna bakom de självhäftande interaktioner mellan nät och trombocyter eller tumörceller är dock fortfarande oklart. Mer nyligen, ett i vitro adhesion test visade att myeloisk leukemiceller (K56212) och lung carcinom celler (A54913) fäster nät via β1 och β3 integriner. Författarna använde nettostock isolerade från neutrofiler och aktiveras av phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) som den vidhäftning substrat14. Denna analys kan upptäcka verkliga interaktioner med NET komponenter i avsaknad av neutrofiler, är det tveksamt huruvida de ”cell-free nettostock” isolerad av höghastighetståg centrifugering behåller den molekylära strukturen som är identisk med nät som producerade i vivo. Nyligen hittade vi denna peritoneal lavage vätska efter bukkirurgi innehöll många mogna LDN, som genererade massiva nät och bifogas tumörceller orsakar peritoneal metastaser15. I denna studie undersökte vi framgångsrikt adhesionen av tumörceller till intakt nät utan någon fysisk manipulation. Här visar vi Detaljer för en teknik för att upptäcka självhäftande interaktioner mellan nät och gratis tumörceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare studier har rapporterat att cirkulerande tumörceller kan vara fångade av NET substrat i vivo10,11. Metastaserande bröstcancer cancerceller har visat sig stimulera neutrofiler och inducera bildandet av nät, som bistår i tumör celltillväxt i målet orgel17. Vi hittade dessutom att kortsiktiga kulturer av LDN från postoperativ lavage vätska produceras massiva nät som effektivt kan snärja tumörceller utan ytterlig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ms. J. Shinohara och I. Nieda för teknisk- och kontorsarbete. Vi tackar också, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina och Kazuya Takahashi för deras samarbete för provtagning i operationssalen. Detta arbete stöds av ett bidrag för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport, och kultur i Japan och Japan Society för främjande av vetenskap (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
