אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.
Abstract
במהלך העשורים האחרונים, מחלות נישאות וקטור מחדש, מורחב-מדאיגה המחירים, גורם משמעותי התחלואה והתמותה ברחבי העולם. חיסונים נרחב זמין ויעיל חסרים עבור רוב המחלות האלה, המחייב הפיתוח של אסטרטגיות להפחתת הסיכון למחלות הרומן. למטרה זו, שדרה מבטיח שליטה במחלה כולל מיקוד microbiome וקטור, הקהילה של חיידקים המאכלסים את הווקטור. Microbiome וקטור ממלא תפקיד מרכזי ב- dynamics הפתוגן, מניפולציות של microbiome הובילו שידור שפע או פתוגן וקטור מופחתת על קומץ של מחלות נישאות וקטור. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לתוך המחלה בקרת יישומים דורש הבנה מעמיקה של וקטור אקולוגיה מיקרוביאלית, מבחינה היסטורית מוגבל על-ידי הטכנולוגיה לא מספיק בתחום זה. כניסתו של הדור הבא רצפי גישות אפשרה רצף מהיר, מקבילים ביותר של קהילות שונות מיקרוביאלי. פילוח הגן rRNA והתפאורה מאוד מטוסי אף-16 הנחתה את אפיוני של חיידקים מתנה בתוך וקטורים תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים. טכניקה זו כוללת הגברה של הגן rRNA מטוסי אף-16, דוגמת barcoding באמצעות PCR, טעינה בדגימות אל תא זרימה עבור רצף, ואת ביואינפורמטיקה הגישות כדי להתאים את רצף נתונים עם מידע פילוגנטי. מין או סוג ברמת זיהוי עבור מספר גבוה של משכפל יכולה בדרך כלל להיות מושגת באמצעות גישה זו, ובכך לעקוף את האתגרים של זיהוי נמוך, רזולוציית הפלט culturing מסורתיים, מיקרוסקופ או צביעת היסטולוגית טכניקות. לכן, בשיטה זו הוא מתאים היטב אפיון וקטור מיקרובים בתנאים מגוונים אך כעת לא יכול לספק לכם מידע אודות הפונקציה מיקרוביאלי, מיקום בתוך וקטור, או התגובה לטיפול אנטיביוטי. בסך הכל, מטוסי אף-16 הדור הבא רצפי היא טכניקה עוצמה להבנת טוב יותר את הזהות ואת התפקיד של חיידקים וקטור ב dynamics המחלה.
Introduction
התחייה של התפשטות מחלות נישאות וקטור בעשורים האחרונים מהווים איום רציני לבריאות האדם וחיות גלובלית. חיסונים יעילים חסרים עבור רוב המחלות האלה, מאמצי הבקרה הם מוגבל בשל האופי ביולוגי המורכב של וקטורים ואינטראקציות וקטור-פונדקאי. להבין את התפקיד של אינטראקציות חיידקים בתוך וקטור הפתוגן בשידור שיכולים לאפשר הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות אשר לעקוף האתגרים הללו. בפרט, אינטראקציות בין וקטור-הקשורים commensals מיקרוביאלי, אנחנו חיים איתם בסמביוזה פתוגנים, המכונה של microbiome, עשויות להיות השלכות חשובות לשידור הפתוגן. ראיות רבות עכשיו תומך קביעה זו, עם דוגמאות הדגמת קישור בין וקטור microbiome הקוד עבור מחלות כמו מלריה, Zika וירוס ומחלת ליים1,2,3. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לאסטרטגיות לבקרת מחלות דורש הבנה הרבה יותר מפורטת של מבנה, תפקוד, מקורם של וקטור microbiomes. זיהוי ואפיון של הקהילה מיקרוביאלי וקטור תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים מהווים נתיב חשוב קדימה בתחום זה.
הליך של זיהוי תושבי מיקרוביאלי וקטור הפתוגן מסופק כאן על ידי ניצול המערבי שחור-רגלי השניה, Ixodes pacificus, זן וקטור של המחלה מחלת ליים Borrelia burgdorferi. בעוד קרציות הנמל סוגים נוספים של פתוגנים האנושית מאשר כל פרוקי-רגליים, יחסית מעט מאוד ידוע על האקולוגיה ביולוגיה והקהילה של שנתות microbiomes4. זה מתבטא קרציות הנמל מערך מגוון של וירוסים, חיידקים, פטריות, protozoans, הכוללים commensals, endosymbionts ו-5,תושבים מיקרוביאלי ארעי4. עבודה מוקדמת הוכיחה וריאציות חזקה ב- microbiomes Ixodes המשויך גאוגרפיה, מינים, מין, שלב חיים וארוחת דם מקור6,7,8. עם זאת, המנגנונים וריאציה זו עדיין לא ידועים ומתחייב שמפורט יותר חקירות של המקור והרכבה של קהילות אלה חיידקים. קרציות יכול לרכוש חיידקים באמצעות שידור אנכי, קשר עם מארחים, ספיגת מן הסביבה דרך spiracles, הפה, נקבובית אנאלי9. הבנת הגורמים בעיצוב את היווצרות ראשונית והפיתוח של microbiome שנתות, במיוחד את התרומה היחסית של השידור האנכי וסביבתיים, חשוב להבנת דפוסי הטבעי של וריאציות של שנתות microbiome המגוון ואת האינטראקציה של קהילות אלה במהלך השידור הפתוגן, עם היישומים האפשריים כדי לשלוט במחלה או וקטור.
טכניקות מולקולריות רבי עוצמה, כגון הדור הבא רצפי, כעת קיים לזיהוי קהילות מיקרוביאלי, יכול להיות מועסק כדי לאפיין וקטור microbiomes תחת מגוון תנאים סביבתיים או ניסיוני. לפני כניסתו של גישות אלה רצף תפוקה גבוהה, זיהוי חיידקים הסתמך בעיקר על מיקרוסקופ ותרבות. בעוד מיקרוסקופ היא טכניקה מהירה וקלה, מורפולוגיים שיטות לזיהוי חיידקים הם מטבעם סובייקטיבי, גס, מוגבל על-ידי רגישות נמוכה, זיהוי10. שיטות מבוססות-תרבות נמצאים בשימוש נרחב עבור זיהוי חיידקים והוא יכול לשמש כדי לקבוע את הרגישות של חיידקים סמים טיפולים11. עם זאת, שיטה זו סובל גם רגישות נמוכה, כאשר ההערכה היא כי פחות מ 2% של הסביבה חיידקים יכולים להיות תרבותי במעבדה הגדרת12. גישות מכתימים היסטולוגית יש גם כבר מועסקים לזהות לשפה חיידקים ספציפיים בתוך וקטורים, לאפשר חקירות של הפצות שונות taxa בתוך השניה ושל לימוד היפותזות על אינטראקציות מיקרוביאלי. עם זאת, ידיעה מוקדמת זהות מיקרוביאלי נדרש לבחירת שהכתמים המתאים, ביצוע גישה זו נועד עבור זיהוי ואפיון מיקרוביאלי. יתר על כן, צביעת היסטולוגית הוא תהליך מאוד אינטנסיבית, מייגעת, אינה סקיילבילית טוב עבור מדגמים גדולים. הגישות המסורתיות מולקולרי כגון סנגר רצף מוגבלות באופן דומה שלהם רגישות וזיהוי של קהילות מיקרוביאלי מגוונות.
הדור הבא רצפי מאפשר זיהוי מהיר של חיידקים מן מספר רב של דוגמאות. הנוכחות של גנים הסמן הרגיל ומאפשר התייחסות מסדי נתונים נוספים משופרת ברזולוציה בטקסונומיה, לעיתים קרובות לשלב סוג או מין. יחידת משנה קטנים ribosomal RNAs משמשים לעתים קרובות כדי להשיג מטרה זו, עם 16 rRNA להיות הנפוצה ביותר בשל נוכחותם של אזורים שנשמרת ומשתנה בתוך הגן, המאפשר היצירה של צבעי בסיס אוניברסלי עם amplicons ייחודי עבור כל בקטריאלי מינים13,14. דו ח זה מפרט הליך של זיהוי taxa, microbiome שנתות באמצעות מטוסי אף-16 rRNA הדור הבא רצפי. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש את השלבים הכרוכים בהכנת הדגימות רצף. כללית יותר פרטים על הרצף ומסופקים שלבים ביואינפורמטיקה, שכן ישנם מגוון רחב של פלטפורמות רצף ניתוח תוכניות זמין כעת, כל אחד עם קיים תיעוד נרחב. הכדאיות הכוללת של גישה זו הדור הבא רצפי מומחש החלתו על חקירה של הקהילה מיקרוביאלי הרכבה בתוך וקטור מחלת מפתח.
Protocol
Representative Results
Discussion
רצף הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA להפוך בגישה סטנדרטית לזיהוי חיידקים, התומך חקר כיצד וקטור microbiomes להשפיע על השידור הפתוגן. פרוטוקול שמפורטות כאן פרטים על השימוש בשיטה זו כדי לחקור את מכלול קהילה מיקרוביאלי אני pacificus, זן וקטור עבור מחלת ליים; עם זאת, ניתן בקלות להחיל אותה ללמוד שנתות מינים א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מעניקה A.S. (דב #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
