Здесь мы представляем протокол следующего поколения последовательности для 16S рРНК последовательности, которая дает возможность идентификации и характеризации микробных сообществ в рамках векторов. Этот метод включает извлечения ДНК, усиления и штриховое кодирование образцов через PCR, виртуализации на поток клеток и биоинформатики соответствует последовательности данных в филогенетических информации.
В последние десятилетия трансмиссивных заболеваний вновь возникли и расширена с угрожающей скоростью, вызывая значительные заболеваемости и смертности во всем мире. Для большинства этих заболеваний, что обусловливает необходимость разработки стратегий смягчения последствий новых болезней отсутствуют эффективные и широко доступны вакцины. С этой целью перспективным направлением контроля заболеваний включает в себя ориентации вектора микрофлора, сообщества микробов, обитающих вектор. Вектор микрофлора играет ключевую роль в динамике патогена, и манипуляции микрофлора, привели к сокращению вектор изобилия или патогена передачи для горстки трансмиссивных заболеваний. Однако переводя эти выводы в болезни управления приложения требует глубокого понимания вектор микробной экологии, исторически ограничивается недостаточным технологии в этой области. С появлением следующего поколения последовательности подходов позволила быстрый, высоко параллельной последовательности различных микробных сообществ. Ориентация весьма сохраняется 16S рРНК гена способствовала характеристики микробов присутствует в векторы в различных экологических и экспериментальных условиях. Этот метод включает амплификацию гена 16S рРНК, штриховое кодирование образца через PCR, Загрузка образцов на ячейку потока для виртуализации, и биоинформатики подходов к последовательности данные сопоставить с филогенетической информации. Видов или род уровень идентификации для большого числа реплицирует обычно может быть достигнуто через этот подход, таким образом обходя проблемы низкой обнаружения, резолюции и вывода из традиционного культивирования, микроскопии или гистологических пятнать методы. Таким образом этот метод хорошо подходит для характеризующие вектор микробов в различных условиях, но в настоящее время не может предоставлять информацию о микробной функции, расположение внутри Вектор, или ответ на лечение антибиотиками. В целом 16S секвенирование нового поколения – это мощный метод для лучшего понимания личности и роли векторных микробов в динамике болезни.
Возрождение и распространение трансмиссивных заболеваний в последние десятилетия представляют серьезную угрозу для глобального здоровья человека и дикой природы. Для большинства этих заболеваний отсутствуют эффективные вакцины, и усилия управления препятствуют сложные биологической природы векторов и вектор хост взаимодействий. Понимание роли микробных взаимодействий внутри вектор в передаче возбудителя может позволить для разработки новых стратегий, позволяющих обойти эти проблемы. В частности взаимодействия между связанный вектор Комменсалами микроорганизмов, симбионтами и патогенов, именуемый микрофлора, могут иметь важные последствия для передачи возбудителя. Подавляющее большинство доказательств теперь поддерживает это утверждение, с примерами, демонстрируя связь между вектор микрофлора и компетентности для таких заболеваний, как малярия, вирус Зика и болезни Лайма1,2,3. Однако переводя эти выводы в стратегии по контролю за заболеваниями требует гораздо более глубокое понимание структуры, функции и происхождение векторных microbiomes. Определение и характеристика вектор микробной сообщества в различных экологических и экспериментальных условиях составляют важный путь вперед в этой области.
Процедуры выявления микробной жители возбудителя вектора предоставляется здесь, используя западные черный legged клеща, Ixodes pacificus, вектор, видов возбудителя болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Хотя клещей гавани больше типов патогенов человека, чем любых других членистоногих, относительно мало известно о биологии и сообщество экологии тик microbiomes4. Очевидно, что клещи гавани разнообразных вирусов, бактерий, грибков и простейших, которые включают Комменсалами, endosymbionts и переходные микробной жителей5,4. Предыдущие работы продемонстрировал сильные колебания Ixodes microbiomes, связанные с география, видов, секс, стадия жизни и крови еды источник6,,78. Однако механизмы, лежащие в основе этого различия остаются неизвестными и гарантируете, что более подробные расследования происхождения и Ассамблеи этих микробных сообществ. Клещи могут приобрести микробов путем вертикальной передачи, контакт с хостов и поглощение из окружающей среды через дыхальца, рот и анальный поры9. Понимание факторов, определяющих первоначального формирования и развития клеща микрофлора, специально относительный вклад вертикальных и окружающей среды передачи, имеет важное значение для понимания физических моделей и вариации в тик микрофлора разнообразие и как эти общины взаимодействуют во время передачи возбудителя, с возможным приложениями для управления заболеванием или вектор.
Мощные молекулярные методы, такие как секвенирование нового поколения, теперь для выявления микробных сообществ существуют и могут быть использованы характеризовать вектор microbiomes в различных условиях окружающей среды или экспериментальных. До появления этих подходов высокопроизводительного секвенирования выявление микробов полагались преимущественно на микроскопии и культуры. В то время как микроскопии — это быстрый и простой метод, Морфологические методы для идентификации микробов по своей сути субъективный и грубый и ограничивается низкой чувствительностью и обнаружения10. Методы на основе культуры широко используются для идентификации микроорганизмов и может использоваться для определения чувствительности микробов к наркотиков лечения11. Однако этот метод также страдает от низкой чувствительностью, как было подсчитано, что меньше, чем 2% экологических микробов может культивировали в лаборатории, установив12. Гистологические окрашивание подходы также были использованы для обнаружения и локализации конкретных микробов в векторы, включить расследования различных дистрибутивов таксонов в пределах клеща и исследование гипотезы о микробных взаимодействий. Однако предварительное знание микробного идентификации необходим для выбора соответствующего пятна, что делает этот подход плохо подходит для микробиологических характеристик и идентификации. Кроме того гистологические пятнать это очень много времени, трудоемкий процесс и не подходит для больших выборок. Традиционные Молекулярные подходы например Сэнгер, секвенирование аналогичным образом ограничены в их чувствительность и обнаружения различных микробных сообществ.
Секвенирование нового поколения позволяет для быстрой идентификации микробов из большого числа проб. Наличие стандартных маркерных генов и справочных баз данных дальнейшем позволяет повысить таксономических резолюции, часто до уровня рода или вида. Для достижения этой цели, с 16S рРНК чаще связано с наличием сохраняемой и переменных регионов в рамках гена, что позволяет для создания универсальных грунты с уникальными ампликонов для каждого бактериального часто используются малые Субблок рибосомной РНК виды,1314. В настоящем докладе подробно процедуру для определения таксонов в тик микрофлора через 16S рРНК секвенирование нового поколения. В частности этот протокол подчеркивает шаги, необходимые для подготовки образцов для виртуализации. Более обобщенные сведения о виртуализации и биоинформатики шаги предоставляются, как есть множество виртуализации платформ и программ анализа имеющихся в настоящее время, каждый с обширной существующей документации. Общая осуществимости этого подхода секвенирование нового поколения продемонстрировал, применяя его к расследованию микробных Ассамблеи в рамках ключевых болезнь векторного.
Секвенирование нового поколения 16S рРНК стал стандартным подходом для микробного идентификации и включено изучение как вектор microbiomes влияют на передачи возбудителя. Протокол, изложенные здесь подробности использования этого метода расследовать микробных Ассамблеи в I. pacificus, век?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд предоставляет а.с. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |