इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शुद्ध मोल्ड आधारित विधि के लिए तीन आयामी पाड़-संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ मुक्त कार्डियक ऊतकों बनाने के लिए ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक उपंयास और आसान शुद्ध मोल्ड-विधि आधारित तीन आयामी (3-डी) अतिरिक्त पाड़ सामग्री के बिना हृदय के ऊतकों बनाने के लिए । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes (iPSC-सीएमएस), मानव कार्डियक fibroblasts (HCFs), और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) अलग कर रहे है और ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs के साथ एक सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । वे सह रहे है एक अल्ट्रा कम लगाव “फांसी ड्रॉप” प्रणाली है, जो एक समय में spheroids के सैकड़ों संघनित्र के लिए micropores शामिल में संस्कृति । कोशिकाओं को समग्र और अनायास सह के 3 दिनों के बाद spheroids पिटाई के रूप में संस्कृति । spheroids काटा, एक उपंयास मोल्ड गुहा में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और मशीन में एक शेखर पर संस्कृति । spheroids एक परिपक्व कार्यात्मक ऊतक लगभग 7 दिनों के बोने के बाद हो जाते हैं । परिणामी multilayered ऊतकों संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ जुड़े spheroids से मिलकर बनता है । इस नई विधि एक reproducible और लागत प्रभावी विधि के रूप में भविष्य में दिल की विफलता के उपचार के लिए इंजीनियर ऊतक बनाने के लिए क्षमता का वादा किया है ।
वर्तमान कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग के लक्ष्य के लिए एक चिकित्सा की जगह या संरचना और घायल रोधगलन1के समारोह की मरंमत के लिए विकसित करने के लिए है । 3-डी कार्डियक टिशू मॉडल बनाने के तरीके मूल कार्डियक ऊतक के महत्वपूर्ण सिकुड़ा और electrophysiological गुणों का प्रदर्शन तेजी से2,3का विस्तार किया गया है । रणनीतियों की एक किस्म का पता लगाया गया है और अध्ययन में इस्तेमाल किया4,5। इन तरीकों में विशिष्ट सिंथेटिक और प्राकृतिक जैव सक्रिय hydrogels के उपयोग से लेकर, जैसे जिलेटिन, कोलेजन, फाइब्रिन, और पेप्टाइड्स6, बायो-इंक साठा टेक्नोलॉजीज2 और प्रिंटिंग टेक्नोलॉजीज7.
यह दिखाया गया है कि पाड़ मुक्त तरीकों के रूप में तुलनीय ऊतकों का उत्पादन कर सकते है भौतिक आधारित तरीकों, विदेशी मचान सामग्री8शामिल की कमियां के बिना । Oren Caspi एट अल. प्रदर्शन किया है कि कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के शामिल उच्च संवहनी मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतक9की पीढ़ी में सक्षम बनाता है । चिन एट अल. spheroids से कार्डियक पैच निर्माण के लिए एक 3-डी मुद्रण पद्धति विकसित की है । परिणामस्वरूप पैच एक 70:15:15 अनुपात10में cardiomyocytes, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं से बना रहे हैं । Spheroids के लिए प्रभावी हो दिखाया गया है “निर्माण ब्लॉक” पाड़ के मुक्त कार्डियक ऊतक निर्माण, के रूप में वे हाइपोक्सिया के खिलाफ प्रतिरोधी रहे है और प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त यांत्रिक अखंडता के अधिकारी11,12। पिछले अध्ययनों से अंडाकार आकृति निर्माण के लिए कई निर्माण विधियों का प्रदर्शन किया है, फांसी छोड़ विधि के उपयोग सहित, स्पिनर कुप्पी13, microfluidic सिस्टम14, और गैर-अनुयाई संस्कृति बिना कोट या लेपित सतहों agarose माइक्रो मोल्ड्स15. इस प्रोटोकॉल में, हम हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस का उपयोग करते हैं, जिसमें एक समय में सैकड़ों spheroids के लिए micropores होते हैं ।
यह अध्ययन एक उपंयास और कुशल पाड़ कार्डियक ऊतक निर्माण, जो मैंयुअल रूप से एक वर्ग मोल्ड गुहा में spheroids बोने और परिपक्वता के लिए एक शेखर पर ऊतक मशीन शामिल करने के लिए मुक्त विधि प्रस्तुत करता है । हमेशा की तरह स्थिर संस्कृति की स्थिति के तहत, ऑक्सीजन प्रसार ऊतक निर्माण के बाहरी पहलुओं के लिए सीमित है, केंद्रीय परिगलन में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, नेट मोल्ड के साथ, सभी spheroids मोल्ड में वरीयता प्राप्त एक निरंतर द्रव गति के साथ मीडिया में डूबे हुए हैं, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की वृद्धि प्रसार के लिए अनुमति दी । इसके अतिरिक्त, इस सांचे में ढालना आधारित विधि अलग के एक साथ निर्माण के लिए अनुमति देता है-ंयूनतम मैनुअल प्रयास के साथ ऊतक पैच आकार और परिणामी ऊतक आसानी से मोल्ड से हटाया जा सकता है । इस उपंयास विधि पाड़ मुक्त, multilayered कार्डियक पैच के कुशल और reproducible निर्माण के लिए अनुमति देता है ।
इस विधि का महत्व इसके reproducibility और परिणामी multilayered कार्डियक ऊतक की प्रभावशीलता में निहित है । कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में, मौजूदा लक्ष्यों में से एक को धड़क रहा है, multilayered, और कार्यात्मक 3 डी कार्डिय?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक निंनलिखित धन स्रोत: जादू है कि हृदय अनुसंधान के लिए कोष मामलों स्वीकार करते हैं ।
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |