Summary
Этот протокол предоставляет метод для оценки протеолитической активности протеаз неразрывно низкой активности, один оборот в сотовой связи. В частности этот метод применяется для оценки протеолитической активности PCSK9, ключевым фактором липидного обмена, чьи протеолитической активности требуется для его конечной употреблением функции.
Abstract
Proprotein конвертазы Субтилизин/kexin тип 9 (PCSK9) — сингл оборот протеазы, который регулирует сыворотке крови липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и, следовательно, сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя PCSK9 Протеолиз требуется для его полной повышенным эффектом, оценки его протеолитического функции сложной: PCSK9 известна только само прилепится, проходит только один оборот и после протеолиза, сохраняет ее субстрат в ее активные сайт как auto ингибитора. Представленные здесь методы описывают assay который преодолевает эти проблемы. Assay фокусируется на межмолекулярных протеолиза в ячейки на основе контекста и успешных расщепления ссылки секретируемые Люцифераза деятельности, которые могут быть легко прочитаны в среде с кондиционерами. Через последовательные шаги мутагенеза, переходных transfection и индикация Люцифераза, assay может зонд PCSK9 Протеолиз в условиях либо генетических и молекулярных возмущений в духе высокой пропускной способности. Эта система хорошо подходит для обоих биохимической оценки клинически выявленных Миссенс сингл-полиморфизмы нуклеотидов (ОНП), а также что касается скрининга мелкомолекулярных ингибиторы протеолиза PCSK9.
Introduction
PCSK9 цели рецепторов ЛПНП (ЛПНП-R) для деградации, поднимая LDL холестерина (LDL-C) и вождения атеросклеротического заболевания сердца1,2. Терапии таргетинга PCSK9 решительно снизить LDL-C и улучшить сердечно-сосудистые исходы для пациентов, даже при добавлении агрессивный липидов понижая терапии статинами3,4. Однако, в настоящее время утвержденных терапии ограничены подходы на основе антител и страдают от отсутствия экономичности5,6. Чтобы решить эту проблему, необходимы менее дорогостоящим терапевтической альтернативы, средства для выявления больных, скорее всего получить более значительные выгоды, или оба.
Мелкомолекулярных подходы могут целевых внутриклеточных PCSK9, обеспечивают улучшение маршрут администрации и сокращения расходов, что делает их «Святой Грааль» в этой области7. Однако PCSK9 оказалось трудно наркотиков в малых молекул. Как протеазы ориентация протеолитических функция PCSK9 является привлекательной стратегией, как self протеолиза тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания8 и является обязательным для максимального эффекта на ЛПНП-R9. На сегодняшний день, однако, эта стратегия не удалось, вероятно из-за PCSK9 в уникальный биохимии: PCSK9 расщепляет только сам10, выполняя один оборот реакции, и после self расщепление, остается связанным на активном узле как PCSK9 prodomain Авто ингибитор11, предотвращая индикация любой дальнейшей активности протеаз.
Эта статья представляет метод для оценки PCSK9 протеолитической функция в высок объём моды8. Через сайт направленного мутагенеза следователи можно использовать этот assay зонда эффекты кодирования ОНП в клинике для оценки их воздействия на протеолиза, тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания. Кроме того этот метод будет полезна в разработке экранов высокой пропускной способностью для выявления модуляторы протеолиза PCSK9, которые, как ожидается, в конечном итоге сорвать презентация PCSK9 ЛПНП-r (и модулировать PCSK9 повышенным эффектом) . Наконец этот протокол может быть адаптирована к другим протеаз с неразрывно низкая активность, условии, что i) конкретного субстрата протеазы пара можно найти, и ii) привязку подходящего внутриклеточных могут быть установлены для субстрата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. сайт Направленный мутагенез протеазы вектора
- Дизайн и порядок обычай синтезированных олигонуклеотиды для установки мутация интерес с помощью модификации стандартного сайта Направленный мутагенез протоколы12. Стандартный обессоленной грунтовки (без дополнительной очистки) вполне приемлемо.
Примечание: Общий подход к конструкции праймера предполагает создание частично перекрывающихся грунты, как указано в таблице 1, на калькуляторе плавления температура (Tm) для полимеразы интерес. - Настройка цепной реакции полимеразы (PCR) для сайта Направленный мутагенез на льду, как указано в таблице 2.
- Цикл PCR, как указано в таблице 3.
- Запустить 2-5 мкл каждого ПЦР на геле агарозы 1% и визуализировать продукции для подтверждения успешного амплификации.
Примечание: Успешного PCR покажет один, видные группы ДНК на приблизительный размер маркера шаблона (~7.8 kB). - 0.5 мкл (за 25 мкл реакции) ДПНИ и Проинкубируйте образцы при 37 ° C в течение 1 ч.
- Преобразуйте 2 мкл реакции в химически сведущее Escherichia coli.
Примечание: Быстро растущий штамм E. coli уменьшит время инкубации, но любой клонирования штамм будет приемлемым. - Пластина преобразований на агар Бертани Лурия (LB), содержащие 50-100 мкг/мл carbenicillin. Инкубировать пластины на ночь при 37 ° C.
- Выберите 2-4 колонии растут в небольших культуры (2-5 мл среды фунтов с carbenicillin 50-100 мкг/мл). Инкубируйте культуры при 37 ° C на 220 об/мин, до тех пор, пока это мутная.
- Изолируйте плазмидной ДНК из клеток с использованием комплекта плазмида ДНК очистки (то есть, «алкалический») согласно инструкциям производителя. Количественно определить концентрацию eluted используя спектрофотометр microvolume ДНК.
- Последовательность плазмидной ДНК, широко используя Сэнгер службы виртуализации (например, ядро или коммерческого объекта). Подготовка образцов ДНК согласно спецификации службы. Праймеры успешно используется в предыдущих последовательности реакций отмечены в таблице 4.
Примечание: Из-за ПЦР-амплификации всего плазмида, последовательность всего региона кодирования PCSK9 рекомендуется для каждого мутант.
2. высокой пропускной способностью на основе Люцифераза протеолиза Assay
-
Мобильный покрытие (день 0)
- Используйте низкий проход HEK293T клетки для экспериментов и культуры в Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Выполнить все ячейки работу в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном до готовности к assay Люцифераза деятельности. Оцените количество скважин и пластин, необходимых для проведения эксперимента, ожидая, что transfections будет выполняться в трех экземплярах для каждого условия испытания.
- Отделить HEK293T клеток из родительского колбу, рассматривая их с минимальным объемом 0,05% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для покрытия клетки. Инактивирует трипсина ЭДТА с 2 тома DMEM, дополненная 10% FBS и передачи ячеек в стерильную пробирку. Подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика (и окрашивание с Трипановый синий). Центрифуга трубки на 500 x g 5 минут для восстановления клеток.
- Аспирационная трипсина содержащих среднего и воссоздания клетки в культуре средне концентрации 2 x 105 кл/мл. С помощью многоканальных дозаторов, передачи 100 мкл клеток в каждой скважине белый (непрозрачный внизу) 96-луночных плиты, которая дает окончательного заполнения концентрации 2 х 104 клетки/хорошо.
Примечание: Для первоначальных экспериментов, он может быть полезным дополнительно семян сестра, 96-луночных ясно-днище, с тем чтобы контролировать соблюдение протокола и руководство будущих неполадок и рост клеток. - Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
- Подготовка мастер плита плазмид в 96-луночных формате. Развести каждого плазмида в Элюирующий буфер (Tris-HCl, рН 8,5) до 50 нг/мкл в индивидуальных хорошо 96-луночных плиты.
- Подготовьте 4 скважины для положительный контроль (WT) плазмида8, плазмида отрицательного контроля (S386A)8и плазмида бесплатная буфер (для макет transfections). Если наркотики или другие процедуры, основанные на сотовых планируются, а затем подготовить основной пластины с плазмида положительный контроль (WT) в каждой скважине, наряду с 4 скважины каждый из плазмида отрицательного контроля (S386A) и плазмиды бесплатная буфер.
-
Трансфекция (1 день)
- Подготовьте смесь трансфекции в формате 96-луночных пластины с использованием глубокой скважины 96-луночных пластины. Выполните transfections в трех экземплярах, будучи уверенным, чтобы подготовить достаточное количество реагентов для учета потерь закупорить и передачи.
Примечание: Следующие вычисления подготовить достаточно реагент для запуска одну плиту 96-луночных в трех экземплярах (по консервативным оценкам 420 скважин).- Сделайте мастер смеси разреженных липидов трансфекции реагента, добавив 50.4 мкл реагента к 2050 мкл сокращение сыворотке среды. Сделайте мастер смесь ДНК precomplexation реагент, добавив 33,6 мкл реагента в 1730 мкл сокращение сыворотке среды.
- С помощью многоканальные пипетки, аликвота 16.8 мкл разбавленные смеси реагентов precomplexation ДНК в каждой скважине штанхглубинных пластины.
- С помощью многоканальных дозаторов, аликвота 3.2 мкл (160 нг) из каждого плазмиды от главной пластины в каждой скважине штанхглубинных пластины.
- С помощью многоканальных дозаторов, аликвота 20 мкл разбавленного липидов трансфекции реагент смеси для каждого хорошо пластины и смешать содержимое каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов. Накладки и пусть они сидят при комнатной температуре (RT) для 10-15 мин до формы липидов: ДНК комплексы.
Примечание: После трансфекции, окончательный компоненты на хорошо будет следующим: 40 нг ДНК, 0.12 мкл Реагента transfection и 0,08 мкл Реагента pre комплексообразования ДНК и содержание каждого хорошо будет 10 мкл в общем объеме (сокращение сыворотке средний).
- Аккуратно обмениваться средство на 293T клетки в 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов, стараясь не нарушить клетки. Заменить средство без наддува с 95 мкл DMEM дополнена 10% FBS.
Примечание: Это будет подходящее время для лечения клетки с любой препарат интерес. - 10 мкл трансфекции смеси, для каждого соответствующего хорошо через многоканальные пипетки. Аккуратно водоворот пластину смешать содержимое в скважинах. Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 24 часа.
Примечание: Окончательный объем лунки доходит до 105 мкл, для учета испарения более 24 ч.
- Подготовьте смесь трансфекции в формате 96-луночных пластины с использованием глубокой скважины 96-луночных пластины. Выполните transfections в трех экземплярах, будучи уверенным, чтобы подготовить достаточное количество реагентов для учета потерь закупорить и передачи.
-
Проба (день 2)
- Подготовить раствор для целентеразин реагентов: [растворяют в фосфат амортизированное saline (PBS), свеже] Аскорбат натрия 3 M, 5 M NaCl, 10 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА; растворяют в PBS, свеже) и 2 мм Целентеразин (растворяют в Подкисленные метанола, содержащие 200 мкл 3 N HCl 10 мл).
Примечание: Целентеразин 2 мм могут храниться на 2 недели, когда он хранится при температуре-80 ° C и в отсутствие света. - Готовить 2 x coelenterazine реагенты для считывания Люцифераза, с отдельной реагент каждый для клетки и средних, согласно таблице 5. Смешать все реагенты сохранить целентеразин во-первых, через фильтр шприц 0,22 мкм фильтр смесь, а затем добавьте целентеразин. Защите от света реагентов, до тех пор, пока они готовы быть добавлены к пластинам.
Примечание: Из-за потери раствора от фильтрации, сделать достаточно реагент для учета обоих потери от фильтрации, а также трансферы. Таблица 5 показывает конечная концентрация реагентов 2 x (а также количество Стоковый раствор добавить зачитать один 96-луночных плита с одной реагента). - Удалите ячейки из инкубатора 24 ч после transfection. С помощью многоканальных дозаторов, передачи 50 мкл кондиционером среды от каждой скважины свежий, белый дном (непрозрачный) 96-луночных пластины.
- Ярлык пластины относительно ли они содержат средний или клетки. Если более чем одна пластина 96-луночных был transfected, ярлык пластины с тем чтобы обеспечить, что каждый средне содержащие пластину в паре с ее родительской пластины клеток.
- С помощью многоканальных дозаторов, 50 мкл 2 x не литических целентеразин реагента к пластине, содержащие только кондиционером среднего. Мягко рок или встряхнуть пластину в отсутствие света для 5-10 мин на RT.
- С помощью многоканальных дозаторов, добавьте 50 мкл реагента 2 x литические целентеразин к пластине, содержащие клетки. Мягко рок или встряхнуть пластину в отсутствие света для 5-10 мин на RT.
- После инкубации зачитал люминесценции средне только пластины на пластину читателя. Затем зачитал люминесценции клетки содержащих пластины в же читатель пластины.
- Отменить пластины и сохранять файлы для анализа данных.
- Подготовить раствор для целентеразин реагентов: [растворяют в фосфат амортизированное saline (PBS), свеже] Аскорбат натрия 3 M, 5 M NaCl, 10 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА; растворяют в PBS, свеже) и 2 мм Целентеразин (растворяют в Подкисленные метанола, содержащие 200 мкл 3 N HCl 10 мл).
3. анализ данных
- Выполните анализ исходных данных с использованием программного обеспечения электронной таблицы. Создайте таблицу, содержащую результаты из клетки и средних плит.
- Вручную проверяйте данные из ячейки пластины для выявления плохо transfected скважин. Скважины, которые показывают < 5% - 10% индикация плазмида отрицательного контроля (S386A) следует рассматривать как плохо transfected, делая толкованием этих данных подозреваемого.
- Рассчитайте средняя фоновая люминесценции каждой пластины с макет transfected скважин. Вычитание фона каждой пластины из значений что пластины.
Примечание: Это значение может быть незначительным в зависимости от читателя плита используется. - Процесс данных путем вычисления доли Люцифераза активности в среде, по сравнению с общей активности Люцифераза для каждой скважины. Потому что клетки табличка содержит оба кондиционером среднего помимо клетки, и средне только табличка содержит столько же, сколько условных среды пластину ячейки, следует использовать следующее уравнение:
Здесь, RLU = относительная люминесценции единиц, фон вычитается Индикация от читателя пластины. - Вычислите среднее секретируемые Люцифераза положительный контроль (WT) и отрицательный контроль (S386A) скважин.
- Оценивают общее качество эксперимент путем вычисления Z-фактор13:
Примечание: Активные значения берутся из позитивного управления (WT) и неактивные значения берутся из отрицательного контроля (S386A) скважин. Значения ближе к 1 показывают более высокое качество экспериментальной. Попробуйте повторить эксперимент или оптимизации рабочего процесса, если значение меньше 0. - Перенесите данные из программы электронных таблиц в программное обеспечение для анализа научных данных.
- Нормализуют деятельность выделяется Люцифераза на средние значения позитивного управления (WT) и отрицательных (S386A), установка положительный контроль как 1 и отрицательный контроль как 0.
- Очистка данных для промахов с помощью метода регрессии и выброс удаления (маршрут), установив скорость максимальная ложных обнаружения до 1%.
- Оценки для статистически значимых различий путем сравнения данных для каждого мутант условие (или мутант) означает WT активности (нормализованное значение 1). Выполните несколько непарных t-тесты, исправление для нескольких сравнений с использованием метода Holm-Sidak и α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высок объём протеолиза assay полагается на преодоление три основные проблемы. Во-первых чтобы преодолеть неразрывно низкий выход один оборот PCSK9 протеазы, PCSK9 протеазы, отсутствует ингибирующее prodomain используется, с последовательностью расщепление на хвост prodomain связан с Люцифераза, который может быть выделяется14. Во-вторых чтобы удовлетворить потребность протеазы сложить комплекс с его тормозной prodomain, два полипептидов, coexpressed в транс в сотовой связи15,16, через bicistronic вектора. В-третьих чтобы дифференцировать рассеченного от uncleaved субстрата, PCSK9 протеазы усекается на C678, который предотвращает выход PCSK9 комплекс из эндоплазменный ретикулум (ER), но не влияет на функции протеолитических17,18 . Взятые вместе, это позволяет для оценки секретируемые Люцифераза как прокси для наличие и степень протеолиза PCSK9 (рис. 1A). Общие сроки assay короткий, с дискретностью сайта Направленный мутагенез пробирного вектора (дни 1 - 2) следуют переходных трансфекции (день 3) и Люцифераза индикация (день 4) все так быстро, как 4 дней, с минимальными «практический» время (завершена в Рисунок 1B).
В целом этот assay позволяет для одновременной оценки PCSK9 Протеолиз в различных условиях, с индикацией, проделанную Люцифераза пробирного. После сбора и обработки данных могут быть визуализированы в табличном формате или тепла карта. В частности мутационного анализ кодирования SNPs хорошо подходят для этого подхода. Рисунок 2 показывает тепловую карту библиотеки мутагенеза насыщения, оценки специфика последовательности расщепление PCSK9 протеазы на участках P6 субстрата через P6'. Результаты показывают, что оптимальная расщепления последовательность является по существу так же, как последовательность WT (SSVFAQ | SIPWNL). В частности, мутации P6 или P4 через P1' остатков плохо переносится протеазы, согласуется с резьбой мелкой, гидрофобные привязки для этих позиций в кристаллической структуре зрелых, расщепляется PCSK9. С точки зрения развития ингибитор этот профиль специфика узкие последовательность является полезным вывод, как он предполагает, что не идеализированной подражательный субстрата может переиграть эндогенного расщепления последовательности. Рисунок 3 показывает относительную расщепления активность (по сравнению с WT) библиотеки Миссенс SNPs описанные в клинике, наметили после первичной структуры PCSK9. Из 84 SNPs оценены свыше половины показали значительные изменения в активности по сравнению с WT протеазы. Эти результаты позволяют предположить, что изменения в PCSK9 протеолитической активности действительно довольно часто встречаются в клинической населения, и такие изменения могут помочь объяснить изменчивость уровня холестерина ЛПНП, видели в клинике.
Рисунок 1: Общая схема высокой пропускной способности в транс PCSK9 расщепление assay. (A) Эта группа схематическая биохимического анализа, представленные здесь. Субстрат, состоит из последовательности сигнал PCSK9 (темно-серый) и prodomain (красный) связан с Люцифераза, который может быть секретируемых PCSK9 расщепление последовательности (желтый) (NLuc, зеленый). Протеазы состоит из последовательность сигнала (темно-серый), стимулирующую домена (светло-серый) и хвоща гистидина богатые (КПЧ) домен, содержащий C679X усечения. Субстрат протеазы пара coexpressed стехиометрические сумм на основе 2A bicistronic вектора, поддается генетической манипуляции. После ИССЛЕДОВАНИџ протеазы и субстрат совместно складывать и оставаться поглощенным в эндоплазматический ретикулум (ER). С активностью расщепления Люцифераза освобождены от комплекса и секретным, где он может быть обнаружен Люцифераза assay кондиционером среды. Потенциальные возмущения для расщепления деятельности включают, но не ограничиваются, генетические манипуляции (возмущений A) или присутствие малых молекул (возмущений B). (B) Эта группа показывает временной шкале для общего анализа. Сайт Направленный мутагенез на WT плазмида осуществляется на дни -1 и 0, следуют трансфекции на 1 день и Люцифераза пробу на 2 день, для общей шкалы на 4 дня. Эта цифра была адаптирована из чорба и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: последовательность специфика PCSK9 протеазы. (A) этого тепла карта показывает активность протеолиза, нормированный фон и WT, для каждого одной аминокислоты мутант насыщения мутагенеза библиотеки P6 через P6' расщепления последовательности. Идентификатор последовательности WT отображается в нижней части, с значения для последовательности WT показано на верхней и отмеченные белыми прямоугольниками. Значение 0 (черный) указывает фоновой активности и значение + 1 (зеленый) указывает значение WT. (B) этого тепла карта показывает стандартное отклонение протеолиза значения из той же библиотеки мутагенеза насыщения, с более низкими значениями в черный и выше значения красным. Значения, изложенные в белой пунктирные прямоугольники представляют мутантов, которые показали значительно отличаются протеолиза значения от того WT протеазы, как определяется Holm-Sidak исправлены, непарные t-тесты с α < 0,05. Данные являются от 3 независимых экспериментов, каждая из которых содержит 3 реплицирует. Эта цифра была адаптирована из чорба и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: последствия PCSK9 полиморфизмов протеолитических функции. (A) Эта группа показывает первичной структуры PCSK9, содержащий последовательность сигнала (SS; черный контур), prodomain (красный контур), стимулирующую домена (серый контур) и хвоща гистидина богатых домена (CHR; синий контур). (B) Эта группа показывает расположение 84 клинических SNP (желтые прямоугольники с черным контуры) помещены в assay протеолиза, на первичной структуры. (C) Эта группа показывает значения 47 SNPs с значительно изменены протеолитической активности по сравнению с WT протеазы, как определяется Holm-Sidak исправлены непарных t-тесты с α < 0,05. Значения сопоставляются первичной структуры PCSK9, значение-1 (красный), указывающее не протеолитической активности и значение + 1 (голубой), указывающее 2 раза улучшение над WT протеазы. Эта цифра была адаптирована из чорба и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: сайт направленных мутагенных конструкции праймера PCR. Праймеры PCR были частично перекрывающимися последовательностями, согласно дизайн, показанный. Ниже таблице приведен пример успешного грунтовка пары. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Компонент | Фондовая | Объем (мкл) | Окончательное |
| Сверхчистый H2O | 17.5 | до 25 мкл общего объема | |
| Буфер реакции полимеразы | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (дНТФ) | 200 МКМ | 0.5 | 4 МКМ |
| Шаблон (одичал тип (WT)) | 2 нг/мкл | 0.5 | 1 нг (всего) |
| Грунтовки (передний) | 20 МКМ | 0.625 | 500 Нм |
| Грунтовки (откр.) | 20 МКМ | 0.625 | 500 Нм |
| Высокая точность ДНК-полимераза | 2 U/МКЛ | 0.25 | 0,5 U (всего) |
Таблица 2: компоненты ПЦР для сайта Направленный мутагенез. Компоненты должны быть добавлены в том порядке, в котором они перечислены, со смесью, хранится на льду, пока Реакция начинается.
| Шаг | Температура (° C) | Время | |
| Первоначальный денатурации | 1 | 98 | 30 s |
| Денатурация | 2 | 98 | 10 s |
| Отжиг | 3 | (Шаблон mT) * + 1 | 20 s |
| Расширение | 4 | 72 | 30 s/kilobase (КБ) (4 min) |
| Велоспорт | 5 (перейдите к шагу 2, 35 циклов всего) | ||
| Окончательное расширение | 6 | 72 | 5 мин |
| Удерживайте | 7 | 12 | Удерживайте |
| * - Выбрать нижний Tm шаблон пары праймера | |||
Таблица 3: предлагаемые Велоспорт параметры для ПЦР. Предлагаемые параметры являются хорошей отправной точкой, но может потребоваться оптимизация.
| Грунтовка | Отжиг местоположение | Последовательность (5' к 3') |
| 1 | ЦМВ промоутер | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-конечная остановка NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Таблица 4: проверяются Праймеры для секвенирования. Каждый грунт успешно использовался в последовательности кодирвоания плазмид, ссылки в этом методе.
| Компонент (сток) | Не литических (средний) | Литических (клетки) | Сумма для 96 Уэллс (1 пластина) |
| Аскорбат натрия (3 M) | 300 мм | 300 мм | 700 МКЛ |
| NaCl (5 М) | 5 мм | 5 мм | 7 МКЛ |
| BSA (10 мг/мл, 1%) | 0,10% | - | 700 МКЛ |
| X-100 Тритон | - | 0,10% | 7 МКЛ |
| PBS | До 50 мкл/хорошо | До 50 мкл/хорошо | До 7000 мкл |
| Фильтрация через мембрану 0,22 мкм и передачи 5880 мкл фильтрата в свежие трубки | |||
| Целентеразин (2 мм) | 40 МКМ | 40 МКМ | 120 МКЛ |
| Общий объем: 6000 мкл | |||
Таблица 5: компоненты 2 x coelenterazine реагентов для Люцифераза отсчетов. Не литических и литические реагентов, необходимых для каждой скважины, которая анализируется, с тем чтобы оценить отдельно кондиционером среднего и transfected клеток. Реагенты смешиваются и фильтруется перед добавлением целентеразин. После добавления целентеразин Защищайте реагент от света до готовности для использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные выше экспериментальной процедуры представляют способ преодолеть неразрывно низкой активности протеаз сингл оборот PCSK9 и оценить его протеолитического функция на надежной основе. Ключевая концепция assay полагается на преобразования одного оборота событий в ферментационно индикация. Сильные стороны assay включают относительно короткие сроки и простота использования Люцифераза репортер, а также его масштабируемость высок объём подходов. Кроме того анализ оценивает протеолиза в его родной, сотовой связи. Кроме того с этот assay, клинически выявленных SNPs может оцениваться по их воздействию на PCSK9 Протеолиз без необходимости для любого человека или больного ткани; необходимо лишь знание генотип интерес.
Существуют некоторые технические ограничения анализа. Хотя assay оценивает протеолиза в ячейку, необходимо также гиперэкспрессия вектора. Потому что assay требует переходных transfection HEK293T клеточной линии, эффективность трансфекции добавляет к внутренней изменчивости в скважины. В то время как PCSK9 S386A протеазы мертвый служит отрицательный контроль для протеолиза, она также служит положительный контроль для transfection сам, так как эти клетки производят функциональных, хотя и внутриклеточно ловушке, Люцифераза. Оценке необработанных данных сотовых плит помогает выявить те клетки с валовой вариациями в эффективность трансфекции и эти данные могут быть уничтожены (и эксперимент повторяется, если желаемого). Кроме того обработка данных для доли секретируемые Люцифераза из всего Люцифераза производится помогает настроить для небольших вариаций в плазмиду доставки и transcriptional вывода. Ожидается, что такие вариации будет аналогичным образом повлиять на выходы Люцифераза клеток и кондиционером среднего. Кроме того, векторы для этот assay поддаются формированию индуцибельной, isogenic стабильных клеточных линий с линией коммерчески доступных 293 Flp-In T-Rex, который работал с успехом как средство обойти требование липидов опосредованной Трансфекция. Это может быть привлекательной особенностью при применении assay мелкомолекулярных скрининг на PCSK9 ингибиторы протеолиза. На сегодняшний день, нет таких ингибиторов было выявлено, далее подчеркивает важность этот assay.
Инженерные PCSK9 протеазы также создает несколько биологических ограничений. Во-первых assay меры межмолекулярных PCSK9 Протеолиз, вместо того чтобы внутримолекулярной протеолиза, что происходит с WT PCSK9. Хотя обычно соотнести эти два мероприятия, маловероятно, что такое соотношение существует во всех ситуациях, биологические, и, таким образом, в некоторых ситуациях, проверка этих эффектов в раскол в СНГ PCSK9 анализа, вероятно, альтернативный метод Например, immunoblot могут быть необходимы. Кроме того assay может вычислять только Миссенс SNP (а не эффект некодирующих вариации). И наконец хотя PCSK9 Протеолиз тариф ограничивая шаг PCSK9 секреции, и ожидается, что сокращение PCSK9 Протеолиз вызвать функцию потерь PCSK9 вариант (относительно клинических холестерина фенотип), это не верно для всех ОНП, указывающий что по крайней мере некоторые мутации, дополнительные биология находится в игре8.
Полезность этого анализа заключается в его способности оценить функцию протеолитических неразрывно низким вывода протеазы. Эти концепции дизайна следует перевести протеаз, помимо PCSK9, которые страдают от аналогичных проблем. Для выполнения этого изменения, это нужно поддерживать связь между расщепления и Люцифераза секрецию. Стратегия, где субстрат — заменить тип мембраны якорь связан с Люцифераза через последовательность расщепления, специфичные для протеазы интерес должен удовлетворять это требование.
Таким образом этот протокол описывает метод для оценки PCSK9 Протеолиз в духе высокой пропускной способности. Этот метод будет полезным как для оценки влияние клинической ОНП на PCSK9 Протеолиз, так и для скрининга мелкомолекулярных ингибиторов PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят щедрой финансовой поддержке NHLBI/низ (K08 HL124068 и LRP HMOT1243), NCATS/низ через UCSF клинических и поступательного науки Института катализатор программы (УЛ1 TR000004), UCSF академического Сената, Хеллман фонд, Галааде наук исследования ученый премии, Pfizer ASPIRE сердечно-премии, (все для Джон S. чорба) и Говард Хьюз медицинский институт (до Galvan Adri м. и. м. Шокат Кеван).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
