Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.
Abstract
סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.
Introduction
PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.
גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה תאיים PCSK9, מספקים נתיב משופרת של הממשל, לצמצם עלויות, שהופך אותם "הגביע הקדוש" זה באיזור7. עם זאת, PCSK9 הוכיח שקשה סמים על ידי מולקולות קטנות. כמו פרוטאז, מיקוד פונקציית הפרוטאוליטי של PCSK9 היא אסטרטגיית אטרקטיבי, כפי העצמי-proteolysis היא הצעד הגבלת קצב ההבשלה PCSK98 והוא נדרש לקבלת אפקט מקסימלי שלה ב- LDL-R9. עד כה, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היה מוצלח, ככל הנראה בגלל הביוכימיה הייחודית של PCSK9: PCSK9 cleaves רק עצמו10, ביצוע תגובה אחת-מחזור, לאחר העצמי-המחשוף, PCSK9 prodomain כבולים בתוך האתר הפעיל כמו auto-מעכב11, מונע את המדידה של כל פעילות נוספת פרוטאז.
מאמר זה מציג שיטה להעריך פונקציית הפרוטאוליטי PCSK9 אופנה תפוקה גבוהה8. דרך מוטגנזה, חוקרים יכולים להשתמש assay הזה כדי לחקור את ההשפעות של קידוד SNPs נמצאו במרפאה כדי להעריך אותם על ההשפעות על proteolysis, השלב הגבלת קצב ההבשלה PCSK9. בנוסף, שיטה זו תהיה שימושית בעיצוב של מסכי תפוקה גבוהה לזיהוי מאפננים של PCSK9 proteolysis, אשר נמצאים צפוי בסופו של דבר לשבש את המצגת של PCSK9 ה-LDL-r (ו לווסת את אפקט hypercholesterolemic של PCSK9) . לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים אחרים פרוטאזות עם פעילות מהותית נמוך, ובלבד i) זוג סובסטרט מסוים-פרוטאז ניתן למצוא, ii) עוגן תאיים מתאים יכול להתבסס על המצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מוטגנזה של וקטור פרוטאז
- עיצוב וסדר מסונתז מותאמת אישית oligonucleotides להתקין מוטציה של הריבית באמצעות שינוי של פרוטוקולים סטנדרטיים מוטגנזה12. תחל desalted רגיל (ללא טיהור נוסף) מקובלים לחלוטין.
הערה: הגישה הכללית של פריימר עיצובים כרוך ביצירת תחל חופפים חלקית, כמצוין בטבלה 1, באמצעות מחשבון טמפרטורה (Tm) ההיתוך ספיציפית פולימראז עניין. - להגדיר תגובות שרשרת של פולימראז (מותני) מוטגנזה בקרח, כמצוין בטבלה מס ' 2.
- מחזור את מותני כמצוין בטבלה3.
- לרוץ 2-5 µL של כל ה-PCR על 1% agarose ג'ל והמחש את המוצרים כדי לאשר הגברה מוצלחת.
הערה: PCR מוצלח יציגו להקה דנ א אחד, בולט ב דה מרקר בגודל המשוער של התבנית (~7.8 kB). - להוסיף 0.5 µL (לכל תגובה 25-µL) של DpnI, דגירה בדגימות ב 37 ° C עבור 1 h.
- להפוך µL 2 התגובה לתוך כשיר מבחינה כימית Escherichia coli.
הערה: זן e. coli בצמיחה מהירה תפחית הדגירה פעמים, אך כל זן שיבוט שיהיה מקובל. - צלחת העתקות על גבי אגר לוריא-Bertani (LB) המכיל 50-100 carbenicillin µg/mL. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 º C.
- בחר 2-4 מושבות לגדול בתרבות בקנה מידה קטן (2-5 מ ל LB בינוני עם 50-100 carbenicillin µg/mL). דגירה התרבות ב 37 ° C-220 סל"ד עד שזה עכורים.
- לבודד את פלסמיד ה-DNA של התאים באמצעות ערכת טיהור (קרי, "miniprep") דנ א פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. לכמת את ריכוז הדנ א eluted באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume.
- רצף של פלסמיד DNA בהרחבה באמצעות שירות רצף סנגר (כגון ליבה או מתקן מסחרי). להכין דגימות ה-DNA בהתאם למפרטים של השירות. תחל בעבר בהצלחה בתגובות קודמות רצף מצוינים בטבלה4.
הערה: עקב הגברה PCR של פלסמיד כולו, הרצף של האזור כולו של קידוד PCSK9 מומלצת עבור כל מוטציה.
2. תפוקה גבוהה מבוססי לוציפראז Proteolysis Assay
-
תא ציפוי (יום 0)
- להשתמש בתאים HEK293T נמוך-המעבר לניסויים ולשנות התרבות של Dulbecco איגל בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS). לבצע כל תא עבודה בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה עד מוכן assay הפעילות לוציפראז. להעריך את מספר בארות ו לוחות הדרושים עבור הניסוי, צופה כי transfections יבוצעו דולר עבור כל תנאי נבדק.
- מביצועם HEK293T תאים מבקבוק האב אם תתייחס אליהם עם נפח מינימלי של 0.05% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) כדי לכסות את התאים. בטל את טריפסין-EDTA עם 2 כרכים של DMEM בתוספת 10% FBS והעברת התאים צינור סטרילי. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (ולא מכתים עם trypan blue). Centrifuge את הצינור ב x 500 g עבור 5 דקות כדי לשחזר את התאים.
- האחות בינוני המכילים טריפסין, לשקם את התאים בטווח הבינוני תרבות כדי ריכוז של 2 x 105 תאים למ"ל. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, העברת 100 µL של התאים כל טוב של צלחת 96-ובכן לבן (אטום-למטה), אשר נותן ריכוז זריעה הסופי של 2 x 104 תאים/טוב.
הערה: לניסויים הראשונית, זה עשוי להיות שימושי כדי בנוסף זרע של אחות, צלחת 96-ובכן ברור-התחתון, כדי לעקוב אחר גדילת התאים תוך היצמדות במהלך פרוטוקול ו מדריך פתרון עתידי. - דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
- להכין צלחת הבסיס של פלסמידים בתבנית 96-ובכן. לדלל כל פלסמיד במאגר • תנאי (טריס-HCl, pH 8.5) כדי 50 ng/µL היטב בודדים של צלחת 96-ובכן.
- להכין 4 בארות פלסמיד בקרה חיובית (WT)8, שליטה שלילי (S386A) פלסמיד8ו נטול פלסמיד מאגר (עבור transfections מעושה). אם תרופות או טיפולים אחרים מבוססי סלולר להיות מתוכננים, אז להכין בסיס לצלחת עם פלסמיד בקרה חיובית (WT) כל היטב יחד עם 4 בארות כל אחד את פלסמיד שליטה שלילי (S386A), המאגר ללא פלסמיד.
-
תרביות תאים (יום 1)
- להכין לתערובת תרביות תאים בתבנית 96-ובכן צלחת באמצעות לוחות 96 עמוק-טוב-טוב. לבצע את transfections דולר, הקפד להכין מספיק ריאגנטים לקחת בחשבון הפסדים pipetting והעברה.
הערה: החישובים הבאים להכין מספיק ריאגנט להפעלת לוח 96-ובכן אחד דולר (אומדן שמרני-וולס 420).- להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל, הוספת µL 50.4 של ריאגנט 2050 µL של מדיום מופחת-סרום. להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט precomplexation DNA, הוספת µL 33.6 של ריאגנט לתוך 1730 µL של מדיום מופחת-סרום.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot µL 16.8 של התערובת ריאגנט precomplexation DNA מדולל לבאר כל צלחת עמוקה-ובכן.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 3.2 µL (160 ng) של כל פלסמיד מהצלחת הראשית לבאר כל צלחת עמוקה-. טוב.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 20 µL תערובת ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל לכל אחד טוב של הצלחת ומערבבים את התוכן של כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. לכסות את הלוחות ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10-15 דקות כדי מתחמי השומנים: DNA טופס.
הערה: על תרביות תאים, הרכיבים הסופי לכל טוב יהיה כדלקמן: 40 ng של ה-DNA, 0.12 µL של תרביות תאים ריאגנט µL 0.08 של ריאגנט pre-complexation דנ א, ואת התוכן של כל אחד יהיה 10 µL סה כ נפח (מופחת-סרום בינוני).
- בעדינות חילופי המדיום על תאים 293T לוחית 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מקפיד לא לשבש את התאים. להחליף את המדיום aspirated 95 µL של DMEM בתוספת 10% FBS.
הערה: זה יהיה זמן מתאים לטיפול תאי בתרופה בכל עניין. - להוסיף 10 µL של תערובת תרביות תאים לכל המתאים היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן הנמצא הבארות. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
הערה: הנפח הסופי של הבארות מגיע 105 µL, להביא בחשבון התאדות מעל 24 שעות.
- להכין לתערובת תרביות תאים בתבנית 96-ובכן צלחת באמצעות לוחות 96 עמוק-טוב-טוב. לבצע את transfections דולר, הקפד להכין מספיק ריאגנטים לקחת בחשבון הפסדים pipetting והעברה.
-
Assay (יום 2)
- להכין פתרון מניות ריאגנטים coelenterazine: 3 מ' סודיום אסקורבט [מומס באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), טרי] 5 מ' NaCl, 10 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA; מומס ב- PBS, טרי), coelenterazine 2 מ מ (מומס acidified מתנול המכיל 200 µL של HCl N 3 לכל 10 מ ל).
הערה: ניתן לאחסן את coelenterazine 2 מ מ 2 שבועות כאשר נשמר ב-80 מעלות צלזיוס, בהיעדר אור. - להכין 2 ריאגנטים x coelenterazine המדידה לוציפראז, עם נפרד ריאגנט כל התאים, בינוני, על פי טבלה 5. לערבב כל ריאגנטים להציל coelenterazine קודם, לסנן את התערובת דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף את coelenterazine. להגן על ריאגנטים אור עד שיהיו מוכנים להוסיף הצלחות.
הערה: בשל האובדן של פתרון של סינון, לבצע מספיק ריאגנט לקחת בחשבון הן את ההפסד סינון, אך גם מן העברות. טבלה 5 מראה את הריכוז הסופי של ריאגנטים 2 x (כמו גם את כמות המניות פתרון כדי להוסיף לקרוא את לוח 96-ובכן אחד עם ריאגנט אחד). - להסיר התאים החממה 24 שעות לאחר תרביות תאים. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר µL 50 בינוני ממוזגים מכל קידוח טריים, עם תחתית לבן (אטום) 96-ובכן צלחת.
- תווית הלוחות לגבי אם הם מכילים בינוני או תאים. אם אחד או יותר צלחת 96-ובכן היה transfected, תווית את הצלחות על מנת להבטיח כי כל צלחת המכילות בינוני מזווג עם צלחת האב שלה של תאים.
- בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של 2 x ריאגנט coelenterazine שאינם lytic לצלחת המכילה רק ממוזגים בינוני. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
- בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של ריאגנט lytic coelenterazine x 2 לצלחת המכילות את התאים. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
- לאחר הדגירה, הקריא את הארה של צלחת בינונית בלבד בקורא צלחת. . אז, לקרוא החוצה של הפריה חוץ גופית של צלחת המכילות תאים בקורא ה-צלחת אותו.
- למחוק את הצלחות ולשמור את הקבצים עבור ניתוח נתונים.
- להכין פתרון מניות ריאגנטים coelenterazine: 3 מ' סודיום אסקורבט [מומס באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), טרי] 5 מ' NaCl, 10 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA; מומס ב- PBS, טרי), coelenterazine 2 מ מ (מומס acidified מתנול המכיל 200 µL של HCl N 3 לכל 10 מ ל).
3. ניתוח נתונים
- לבצע ניתוח נתונים ראשוניים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני. צור גיליון המכיל את התוצאות של התא עם הלוחיות בינוני.
- באופן ידני לבדוק את הנתונים מכל הלוחות תא לזהות לקוי transfected בארות. וולס המציגים < 5% - 10% של המדידה של פלסמיד שליטה שלילי (S386A) צריכה להיחשב הכי גרוע transfected, שהופך את הפרשנות של החשוד נתונים אלה.
- לחשב את לומינסנציה רקע הממוצע של כל צלחת מן הבארות transfected מעושה. להחסיר את הרקע של כל צלחת לפי הערכים של הלוחית הזאת.
הערה: ערך זה עשוי להיות זניח בהתאם לקורא לצלחת משמש. - הנתונים על-ידי חישוב היחס של פעילות לוציפראז המדיום בהשוואה הפעילות לוציפראז הכללית במשך כל תהליך. כי הצלחת התא מכיל שני בינוני ממוזגים בנוסף תאים, לצלחת בינונית בלבד מכיל את אותה כמות של בינוני ממוזגים כמו הלוח התא, זה ראוי לעשות שימוש במשוואה הבאה:
הנה, RLU = יחידות הפריה חוץ גופית יחסית, המדידה המופחת-רקע מהקורא את הצלחת. - לחשב את לוציפראז המופרש אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הבארות שליטה שלילי (S386A).
- להעריך את האיכות הכוללת של הניסוי על-ידי חישוב של Z-פקטור13:
הערה: ערכי פעיל באות מהפקד חיובי (WT), הערכים שאינם פעילים מגיעים מן הבארות שליטה שלילי (S386A). ערכים קרוב יותר ל- 1 מצביעים על איכות ניסויית גבוהה יותר. לשקול לחזור על הניסוי או מיטוב זרימת העבודה אם הערך הוא מתחת ל-0. - להעביר את הנתונים מתוך התוכנית הגיליון האלקטרוני לתוך תוכנת ניתוח נתונים מדעיים.
- לנרמל את הפעילות לוציפראז המופרש לערכים אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הפקד שלילי (S386A), הגדרת הפקד חיוביים כמו 1 ופקד שלילי של-0.
- נקה את הנתונים עבור ליניאריים באמצעות שיטת הסרה (האלכסון) ברגרסיה, חריג חשוד טעות, הגדרת הקצב המרבי גילוי שווא על 1%.
- הערכת הבדלים משמעותיים סטטיסטית על-ידי השוואת הנתונים עבור כל המוטציות תנאי (או מוטציה) כדי הממוצע של הפעילות WT (מנורמל לערך של 1). לבצע אינטראקצית מרובים t-בדיקות, תיקון להשוואות מרובות באמצעות שיטת הולם-Sidak α = 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
וזמינותו תפוקה גבוהה proteolysis נשענת על התגברות על שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, כדי להתגבר על הפלט נמוך מהותית של יחיד-מחזור PCSK9 פרוטאז, פרוטאז PCSK9 חסר מעכבות את prodomain משמשת, עם הרצף המחשוף בזנב prodomain קשורה לוציפראז יכולים להיות מופרשים14. שנית, כדי לספק את הצורך פרוטאז לקפל מורכבים עם מעכבות את prodomain, שני polypeptides הם coexpressed טרנס בתוך ההקשר הסלולר15,16, באמצעות וקטור bicistronic. שלישית, כדי להבדיל את cleaved המצע uncleaved, PCSK9 פרוטאז נחתך ב C678, אשר מונע את היציאה של PCSK9 מורכבות תוך-פלזמית (ER) אבל אין השפעה על פונקציית הפרוטאוליטי17,18 . יחדיו, זה מאפשר הערכה של לוציפראז המופרש לשם הנוכחות ואת מידת PCSK9 proteolysis (איור 1 א'). פרק הזמן הכללית של וזמינותו הוא קצר, עם מדרגות מוטגנזה של וקטור assay (ימים 1 - 2) ואחריו את תרביות תאים ארעי (יום 3) ואת לוציפראז readout (יום ד') כל הושלמה ב מהר ככל 4 ימים, עם זמן מינימלי "על הידיים" ( איור 1B).
בסך הכל, assay הזה מאפשר הערכת PCSK9 proteolysis תחת מגוון תנאים, בו זמנית עם הנתונים נעשה על ידי וזמינותו לוציפראז. לאחר הרכישה, עיבוד, ניתן לאבחן את הנתונים חום מפה או טבלאי. בפרט, ניתוח mutational של קידוד SNPs מתאימים היטב לגישה זו. איור 2 מציג מפת החום של ספרייה מוטגנזה מכוונת רוויה הערכת יחודיות רצף המחשוף הפרוטאז PCSK9 באתרים המצע P6 דרך P6 ". התוצאות מציגות כי הרצף המחשוף האופטימלי הוא בעצם זהה רצף WT (SSVFAQ | SIPWNL). בפרט, המוטציה של P6 או P4 דרך P1' שאריות לקוי הוא נסבל על ידי פרוטאז, בקנה אחד עם החריץ רדוד, הידרופובי מחייב עבור תפקידים אלה במבנה הגביש של בוגר, ביקע PCSK9. מנקודת המבט של מעכב התפתחות, פרופיל ירידה לפרטים זה רצף צר הוא ממצא שימושי, כפי שהוא מציע לא המצע אידאלית מימטי יכול לגבור על רצף המחשוף אנדוגני. איור 3 מראה את הפעילות מחשוף יחסית (בהשוואה WT) של ספריה של missense SNPs תיאר במרפאה, מתוכנן על המבנה הראשוני PCSK9. של SNPs 84 מוערכים, מעל חצי הראו שינוי משמעותי בפעילות בהשוואה פרוטאז WT. תוצאות אלו מראים כי שינויים בפעילות הפרוטאוליטי PCSK9 הם אכן די נפוץ באוכלוסיה קלינית, שינויים כזה עשוי לסייע להסביר את ההשתנות ברמות הכולסטרול LDL ראיתי במרפאה.
איור 1: הכולל סכמטית וזמינותו המחשוף תפוקה גבוהה טרנס PCSK9. (א) לוח זה מראה סכימטי הביוכימי של וזמינותו המוצג כאן. המצע מורכב הרצף האות PCSK9 (אפור כהה), prodomain (אדום) קשורה לוציפראז זה יכול להיות מופרש (NLuc, ירוק) על ידי הרצף פצילות PCSK9 (צהוב). פרוטאז מורכב הרצף אות (אפור כהה), התחום קטליטי (אפור בהיר), והתחום ציסטאין-היסטידין עשיר (CHR) המכיל את העיגול C679X. הזוג המצע-פרוטאז היא coexpressed ב stoichiometric סכומים וקטור bicistronic מבוסס-2A, לבצע מניפולציות גנטיות. על coexpression, סובסטרט של פרוטאז משותפת לקפל, נשארים מוחרם תוך-פלזמית (ER). עם מחשוף פעילות, לוציפראז שוחרר מן המתחם, מופרש, איפה זה יכול יזוהו על-ידי לוציפראז וזמינותו של המדיום ממוזגים. לפליטת פוטנציאל לפעילות המחשוף כוללים, אך אינם מוגבלים, מניפולציות גנטיות (ההפרעות A) או הנוכחות של מולקולות קטנות (ההפרעות B). (B) לוח זה מראה על ציר הזמן עבור וזמינותו הכללית. מוטגנזה על פלסמיד WT מתבצע בימים-1 ו- 0, ואחריו תרביות של תאים ביום 1 ואת וזמינותו לוציפראז ביום 2, עבור ציר זמן הכולל של 4 ימים. איור זה כבר ממאמרו של חריפה. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: רצף ירידה לפרטים הפרוטאז PCSK9. (א) מפה חום זו מציגה את הפעילות הפרוטאוליטי, מנורמל רקע, WT, עבור כל מוטציה חומצה אמינית בודדת של ספריית מוטגנזה מכוונת הרוויה P6 דרך P6 "רצף המחשוף. זהות רצף WT מוצג בתחתית, עם הערכים של הרצף WT המוצג הן בראש ואת מודגשת על ידי מלבנים לבנים. ערך של 0 (שחור) מצביעה על רקע פעילות, וערך של +1 (ירוק) מציין את הערך WT. (B) החום הזה המפה מראה את סטיית התקן של הערכים proteolysis מספריית מוטגנזה מכוונת רוויה זהה, עם ערכים נמוכים יותר בערכים שחור ומעלה באדום. ערכי המתוארים מלבנים מקווקווים מייצגים מוטציות אשר הראו ערכי proteolysis שונה באופן משמעותי מזו הפרוטאז WT, כפי שנקבע על ידי הולם-Sidak-מתוקן, אינטראקצית t-בדיקות עם α < 0.05. הנתונים המוצגים הם 3 ניסויים עצמאית, שכל אחד מהם מכיל 3 משכפל. איור זה כבר ממאמרו של חריפה. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעת PCSK9 SNPs על פונקציית הפרוטאוליטי. (א) לוח זה מראה המבנה הראשוני של PCSK9, המכיל את רצף אות (SS; מתאר שחור), prodomain (המתאר אדום), התחום קטליטי (חלוקה אפור), ציסטאין-היסטידין עשיר תחום (CHR; קו המתאר הכחול). (B) לוח זה מראה את המיקום של SNPs 84 קליניים (צהובים מלבנים עם קווי מתאר שחור) ממוקמת ב- proteolysis וזמינותו, ממופה על גבי המבנה הראשוני. (ג) חלונית זו מציגה את הערכים של SNPs 47 בפעילות הפרוטאוליטי שינו באופן משמעותי בהשוואה של פרוטאז WT, כפי שנקבע על ידי אינטראקצית הולם-Sidak-מתוקן ' t-בדיקות עם α < 0.05. הערכים ממופים אל המבנה הראשי PCSK9, עם ערך של-1 (אדום) המציין אין פעילות הפרוטאוליטי וערך של +1 (ציאן) המעידים על שיפור 2-fold מעל פרוטאז WT. איור זה כבר ממאמרו של חריפה. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: האתר מכוון עיצוב פריימר PCR מוטגניות. PCR תחל יש חפיפה חלקית רצפים, לפי הדגם שמוצג. דוגמא של זוג מוצלח פריימר מוצג מתחת לשולחן. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| רכיב | מניות | נפח (µL) | סופי |
| הנדסה גנטית H2O | 17.5 | לנפח הכולל µL 25 | |
| מאגר התגובה פולימראז | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | מיקרומטר 200 | 0.5 | 4 מיקרומטר |
| תבנית (פראי-סוג (WT)) | 2 ng/µL | 0.5 | 1 ng (סה כ) |
| תחל (Fwd) | 20 מיקרומטר | 0.625 | 500 ננומטר |
| תחל (Rev) | 20 מיקרומטר | 0.625 | 500 ננומטר |
| אמינות גבוהה DNA פולימראז | U 2/ΜL | 0.25 | 0.5 U (סה) |
בטבלה 2: רכיבים של ה-PCR עבור מוטגנזה. הרכיבים יש להוסיף לפי הסדר שבו הם רשומים, עם התערובת שמרה על הקרח עד התגובה מתחילה.
| שלב | Temp (° C) | זמן | |
| דנטורציה הראשונית | 1 | 98 | 30 s |
| דנטורציה | 2 | 98 | 10 s |
| חישול | 3 | (התבנית mT) * + 1 | 20 s |
| סיומת | 4 | 72 | s 30/kilobase (kb) (4 דקות) |
| רכיבה על אופניים | 5 (םירוציק בשלב 2, סה כ 35 מחזורים) | ||
| סיומת הסופי | 6 | 72 | 5 דקות |
| . תחזיק | 7 | 12 | . תחזיק |
| * - לבחור Tm תבנית התחתון בזוג פריימר | |||
טבלה 3: המוצע אופניים פרמטרים עבור ה-PCR. הפרמטרים המוצע לייצג נקודת התחלה טובה, אך עשויים לדרוש אופטימיזציה.
| פריימר | חישול מיקום | רצף (5' ל 3') |
| 1 | CMV יזם | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | קצה קרבוקסילי של NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
בטבלה 4: אומת צבעי יסוד רצף. כל פריימר שימש בהצלחה ב רצף האזור קידוד של פלסמידים הפניה בשיטה זו.
| רכיב (מניות) | הלא-Lytic (בינוני) | Lytic (תאים) | פרק 96-וולס (לוח 1) |
| סודיום אסקורבט (3 מ') | 300 מ"מ | 300 מ"מ | 700 ΜL |
| NaCl (5 מ') | 5 מ מ | 5 מ מ | 7 ΜL |
| BSA (10 מ"ג/מ"ל, 1%) | 0.10% | - | 700 ΜL |
| טריטון X-100 | - | 0.10% | 7 ΜL |
| PBS | כדי µL 50/טוב | כדי µL 50/טוב | כדי 7000 µL |
| לסנן דרך ממברנה מיקרומטר 0.22 ולהעביר 5880 µL של פילטרט של תוך צינור טריים | |||
| Coelenterazine (2 מ מ) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| נפח כולל: 6000 µL | |||
טבלה 5: רכיבים של 2 x coelenterazine ריאגנטים עבור המפרט לוציפראז. ריאגנטים שאינם lytic והן lytic נדרשים עבור כל טוב זה ניתוח כדי להעריך בנפרד המדיום ממוזגים והתאים transfected. ריאגנטים מעורב, סינון לפני התוספת של coelenterazine. לאחר התוספת coelenterazine, להגן הכימית האור עד מוכן לשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוציפראז, כמו גם את המדרגיות גישות תפוקה גבוהה. בנוסף, וזמינותו מוערך proteolysis בהקשרה טבעית, הסלולר. יתר על כן, עם זה assay, SNPs קלינית מזוהה נבחנים והשפעותיהם על PCSK9 proteolysis ללא הצורך בכל רקמה אנושית או החולה; רק הידע גנוטיפ עניין הכרחי.
קיימות מספר מגבלות טכניות של וזמינותו. למרות וזמינותו מוערך proteolysis בתוך התא, זה דורש גם ביטוי של וקטור. מאחר וזמינותו מחייבת את תרביות תאים ארעית של הקו תא HEK293T, תרביות תאים יעילות מוסיף ההשתנות טוב-כדי-טוב פנימי. ואילו PCSK9 S386A פרוטאז-המלח משמש הפקד שלילי עבור proteolysis, זה משמש גם הפקד חיובי עבור תקנים עצמו, מאז תאים אלו מייצרים פונקציונליים, אף על פי intracellularly לכודים, לוציפראז. הערכת הנתונים הגולמיים של הלוחות הסלולר מסייעת לזהות תאים אלה עם וריאציות דוחה ביעילות תרביות תאים, נתונים אלה יכולים להיות מושלך (ואת הניסוי חוזר על עצמו, אם רצונך בכך). יתר על כן, עיבוד הנתונים עבור שיעור לוציפראז מופרשים אל מחוץ לוציפראז הכולל הפיק מסייעת להתאים עבור הבדלים קטנים יותר פלסמיד משלוח ופלט תעתיק. וריאציות כזה יהיה צפוי להשפיע על התוצרים לוציפראז של התאים, המדיום ממוזגים באופן דומה. בנוסף, הווקטורים המשמש assay זה נתונות היווצרות של שורות תאים יציב inducible, isogenic עם קו 293 T-Rex Flp-In זמינים מסחרית, אשר כבר מועסקים עם הצלחה כאמצעי לעקוף את הדרישה בתיווך השומנים תרביות תאים. . זה עשוי להיות תכונה מושכת בשעת החלת וזמינותו על הקרנה מולקולה קטנה עבור מעכבי proteolysis PCSK9. נכון להיום, אין כזה מעכבי זוהו, עוד דבר המלמד את החשיבות של זה וזמינותו.
ההנדסה הפרוטאז PCSK9 יוצר גם מספר מגבלות וחיסונים. ראשית, וזמינותו מודד proteolysis PCSK9 הבין-מולקולרי, יותר מאשר את proteolysis התפלגות המתרחשת עם WT PCSK9. בעוד שתי פעילויות לתאם בדרך כלל, אין זה סביר כי כאן יחס כזה קיים בכל המצבים ביולוגי, לפיכך, במצבים מסוימים, האימות של תופעות אלה בהמחשוף ב- cis PCSK9 assay, ככל הנראה על ידי שיטה חלופית כמו immunoblot, ייתכן שיהיה צורך. בנוסף, וזמינותו יכול רק להעריך missense SNPs (וגם לא את ההשפעה של וריאציות ללא קידוד). לבסוף, למרות PCSK9 proteolysis היא הצעד הגבלת קצב הפרשת PCSK9, צמצום PCSK9 proteolysis צפוי להיגרם אובדן-של-פונקציה PCSK9 משתנה (בנוגע של פנוטיפ קליני כולסטרול), זה לא נכון לגבי כל SNPs, המציין כי לפחות כמה מוטציות, נוספים ביולוגיה היא לשחק8.
השירות של assay הזה טמון ביכולת להעריך את תפקוד הפרוטאוליטי פרוטאז ממהותם נמוך-פלט. אלה למושגים עיצוב צריך לתרגם פרוטאזות חוץ PCSK9 הסובלים אתגרים דומים. כדי לבצע שינוי זה, זה הכרחי לשמור על הקשר בין הפרשת המחשוף, לוציפראז. אסטרטגיה איפה המצע מוחלף סוג אני עוגן ממברנה לקשר את לוציפראז באמצעות רצף המחשוף ספיציפית פרוטאז עניין יספק דרישה זו.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכת PCSK9 proteolysis אופנה תפוקה גבוהה. שיטה זו יהיה מועיל הן להערכת ההשפעה של SNPs קליני על PCSK9 proteolysis, וכן להקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים את התמיכה מימון נדיב מן NHLBI/NIH (K08 HL124068 ו- HMOT1243 אימייל), NCATS/NIH דרך UCSF קלינית Translational המדע מכון זרז לתוכנית (UL1 TR000004), הסנאט אקדמי UCSF, קרן הלמן, תודה גלעד מדעי מחקר מלומד פרס, פרס לב וכלי דם מתאווים פייזר (הכל אל חריפה ס ג'ון), הווארד יוז המכון הרפואי (ועד גיא טל מ Galvan וקוואן לשווקת מ').
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
