Summary
Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'attività proteolitica di una proteasi fatturato intrinsecamente bassa attività, unico in un contesto cellulare. In particolare, questo metodo viene applicato per valutare l'attività proteolitica di PCSK9, un driver chiave del metabolismo lipidico cui attività proteolitica è richiesto per la sua funzione ipercolesterolemici ultimate.
Abstract
Proteina convertasi subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) è una proteasi di singolo-fatturato che regola i livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL) del siero e, di conseguenza, la malattia cardiovascolare. Anche se PCSK9 proteolisi sono richiesto per il suo effetto completo ipercolesterolemico, la valutazione della sua funzione proteolitica è impegnativa: PCSK9 è noto solo per fendere se stesso, subisce solo un singolo fatturato e dopo proteolisi, conserva il suo substrato in suo sito attivo come inibitore di auto. I metodi presentati qui descrivono un'analisi che supera queste sfide. L'analisi si concentra sulla proteolisi intermolecolari in un contesto di basati su cellule e avvenuta scissione collegamenti per l'attività luciferasica secrete, che possono essere facilmente lette nel medium condizionato. Via passaggi sequenziali di mutagenesi, trasfezione transiente e una lettura di luciferasi, il dosaggio può sondare PCSK9 proteolisi in condizioni di perturbazione o genetici o molecolari in un modo ad alta velocità. Questo sistema è adatto per entrambi la valutazione biochimica di missenso clinicamente scoperto polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), anche per quanto riguarda lo screening di piccole molecole inibitori di PCSK9 proteolisi.
Introduction
PCSK9 è destinato il ricevitore di LDL (LDL-R) per la degradazione, innalzamento del colesterolo LDL (LDL-C) e guida la malattia cardiaca aterosclerotica1,2. Therapeutics targeting PCSK9 robusto abbassare LDL-C e per migliorare i risultati cardiovascolari per i pazienti, anche quando aggiunto ad una terapia ipolipemizzante aggressiva con le statine3,4. Tuttavia, terapie attualmente approvate sono limitate ad approcci basati su anticorpi e soffrono di una mancanza di redditività5,6. Per risolvere questo problema, le alternative terapeutiche meno costose, un mezzo per identificare i pazienti probabilmente ottenere maggiori benefici, o entrambi, sono necessari.
Approcci della piccolo-molecola bersaglio intracellulare PCSK9, fornirebbe una migliore via di somministrazione e ridurre i costi, che li rende il "Santo Graal" in questa zona7. Tuttavia, PCSK9 è dimostrato difficile da droga di piccole molecole. Come una proteasi, targeting funzione proteolitica di PCSK9 è un'attraente strategia, come self-proteolisi sono la tappa limitante di PCSK9 maturazione8 ed sono necessaria per il suo massimo effetto su LDL-R9. Fin qui, tuttavia, questa strategia non ha avuto successo, probabilmente a causa di biochimica unica di PCSK9: PCSK9 fende solo sé10, eseguendo una reazione di singolo-fatturato, e dopo auto-fenditura, la PCSK9 propeptide rimane legato nel sito attivo come un auto-inibitore11, impedendo la lettura di qualsiasi ulteriore attività di proteasi.
Questo articolo presenta un metodo per valutare la funzione proteolitica PCSK9 in moda di alto-rendimento8. Attraverso mutagenesi sito-diretta, gli investigatori possono utilizzare questo test per sondare gli effetti di codifica SNPs trovati nella clinica per valutarli per effetti sulla proteolisi, la tappa limitante di PCSK9 maturazione. Inoltre, questo metodo sarà utile nella progettazione di schermi ad alta produttività per identificare i modulatori della proteolisi PCSK9, che si prevedono, infine, interferire con la presentazione di PCSK9 al LDL-R (e modulare l'effetto ipercolesterolemico di PCSK9) . Infine, questo protocollo può essere adattato alle altre proteasi con attività intrinsecamente bassa, purché i) una coppia di substrato-proteasi specifiche possa essere trovata, e ii) un adeguato ancoraggio intracellulare può essere stabilita per il substrato.
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Protocol
1. mutagenesi di proteasi vettoriale
- Progettare e ordinare oligonucleotidi sintetizzati personalizzato per installare una mutazione di interesse usando una modifica di protocolli di mutagenesi sito-diretta standard12. Primer standard dissalate (senza ulteriore purificazione) sono perfettamente accettabili.
Nota: Un approccio generale ai disegni di primer comporta la creazione di primer parzialmente sovrapposti come indicato nella tabella 1, utilizzando una calcolatrice fusione di temperatura (Tm) specifica per la polimerasi di interesse. - Impostare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) per la mutagenesi sito-diretta su ghiaccio, come indicato nella tabella 2.
- Il ciclo PCRs, come indicato nella tabella 3.
- Eseguire 2-5 µ l di ogni PCR su un gel di agarosio all'1% e visualizzare i prodotti per confermare un'amplificazione di successo.
Nota: Una riuscita PCR mostrerà una banda di DNA singola, prominente al marcatore di dimensione approssimativa del modello (~7.8 kB). - Aggiungere 0,5 µ l (per reazione di 25-µ l) di DpnI e incubare i campioni a 37 ° C per 1 h.
- Trasformare 2 µ l della reazione in Escherichia colichimicamente competente.
Nota: Un ceppo di e. coli rapida crescita ridurrà i tempi di incubazione, ma qualsiasi ceppo di clonazione sarà accettabile. - Piastra le trasformazioni su Luria-Bertani (LB) agar contenente carbenicillina di 50-100 µ g/mL. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.
- Selezionare 2-4 colonie a crescere in una cultura in piccola scala (2-5 mL di LB medium con carbenicillina di 50-100 µ g/mL). Incubare la coltura a 37 ° C a 220 giri/min fino a quando è torbido.
- Isolare il DNA dalle cellule utilizzando un kit di purificazione (cioè, "miniprep") del DNA del plasmide secondo le istruzioni del produttore del plasmide. Quantificare la concentrazione di DNA eluita utilizzando uno spettrofotometro di microvolume.
- Sequenza del plasmide DNA ampiamente utilizzando un servizio di sequenziamento Sanger (ad esempio un core o struttura commerciale). Preparare i campioni di DNA in base alle specifiche del servizio. Primer usati con successo nelle reazioni di sequenziamento preventiva sono indicati nella tabella 4.
Nota: Per l'amplificazione di PCR del plasmide intero, il sequenziamento di intera regione di codificazione di PCSK9 è consigliato per ogni mutante.
2. high-throughput proteolisi basati su Luciferase Assay
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Placcatura di cella (giorno 0)
- Utilizzare cellule HEK293T basso-passaggio per esperimenti e una cultura di Dulbecco modificato medium di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS). Eseguire tutto cella di lavoro in condizioni di sterilità in un cappuccio di coltura del tessuto fino al momento di saggiare l'attività luciferasica. Stimare il numero di pozzi e piatti necessari per l'esperimento, anticipando che transfezioni verranno eseguite in triplice copia per ogni condizione testata.
- Dissociare HEK293T cellule da una boccetta di padre trattandole con un volume minimo di 0.05% acido di tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per coprire le cellule. La tripsina-EDTA con 2 volumi di DMEM completati con 10% FBS e trasferimento di inattivare le cellule in una provetta sterile. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato (e colorazione con trypan blu). Centrifugare la provetta a 500 x g per 5 min recuperare le cellule.
- Aspirare il mezzo contenente tripsina e ricostituire le cellule nel terreno di coltura ad una concentrazione di 2 x 105 cellule/mL. Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 µ l delle cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti bianco (opaco fondo), che dà una concentrazione finale di semina di 2 x 104 cellule per pozzetto.
Nota: Per gli esperimenti iniziali, può essere utile eseguire il seeding inoltre una sorella, clear-fondo piastra a 96 pozzetti, in modo da monitorare la crescita delle cellule e aderenza durante il protocollo e la Guida di risoluzione dei problemi futuri. - Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h.
- Preparare un piatto matrice dei plasmidi in un formato a 96 pozzetti. Diluire ogni plasmide in tampone di eluizione (Tris-HCl, pH 8.5) a 50 ng / µ l in un singolo pozzo di una piastra a 96 pozzetti.
- Preparare 4 pozzetti ciascuna per il controllo positivo (WT) plasmide8, controllo negativo (S386A) plasmide8e privo di plasmide buffer (per transfezioni finti). Se farmaci o altri trattamenti basati su cellulare sono previste, quindi preparano il piatto matrice con il plasmide di controllo positivo (WT) in ciascun pozzetto, insieme a 4 pozzetti ciascuna il plasmide di controllo negativo (S386A) e il buffer di plasmide-libero.
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Transfezione (giorno 1)
- Preparare la miscela di transfezione in un formato di piastra a 96 pozzetti utilizzando piastre da 96 pozzetti profondo-bene. Eseguire le transfezioni in triplice copia, avendo cura di preparare abbastanza reagenti per contabilizzare le perdite di pipettaggio e trasferimento.
Nota: I seguenti calcoli preparano abbastanza reagente per eseguire una piastra a 96 pozzetti in triplice copia (stimata conservativamente per 420 pozzi).- Fare un mix master di un reagente di transfezione del lipido diluito, aggiunta di 50,4 µ l di reagente a 2050 µ l di siero ridotto medio. Fare un mix master di un reagente di DNA precomplexation, aggiunta di 33,6 µ l di reagente in 1730 µ l di terreno di siero ridotto.
- Usando una pipetta multicanale, aliquotare 16,8 µ l di miscela diluita di reagente di precomplexation DNA in ciascun pozzetto della piastra profondo-bene.
- Usando una pipetta multicanale, aliquotare 3,2 µ l (160 ng) di ogni plasmide dalla piastra master in ciascun pozzetto della piastra profondo-bene.
- Usando una pipetta multicanale, aliquota 20 µ l della miscela reagente transfezione del lipido diluito a ogni bene della piastra e mescolare il contenuto di ogni pozzetto usando la pipetta multicanale. Coprire le piastre e li lasciate riposare a temperatura ambiente (TA) per 10-15 min per formare complessi lipidici: DNA.
Nota: Al momento di transfezione, i componenti finali per pozzetto sarà come segue: 40 ng di DNA, 0,12 µ l di reagente di transfezione e 0.08 µ l di reagente pre-complessazione del DNA e il contenuto di ogni bene sarà 10 µ l in volume totale (ridotto-siero medio).
- Delicatamente e scambiare il mezzo sulle cellule 293T nelle piastre da 96 pozzetti usando una pipetta multicanale, avendo cura di non per danneggiare le cellule. Sostituire il mezzo aspirato con 95 µ l di DMEM supplementato con 10% FBS.
Nota: Questo sarebbe un tempo adeguato per il trattamento delle cellule con qualsiasi farmaco di interesse. - Aggiungere 10 µ l della miscela di transfezione per ogni appropriato bene tramite una pipetta multicanale. Agitare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto nei pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% CO2 per 24 h.
Nota: Il volume finale dei pozzi arriva a 105 µ l, per tenere conto per evaporazione oltre 24 h.
- Preparare la miscela di transfezione in un formato di piastra a 96 pozzetti utilizzando piastre da 96 pozzetti profondo-bene. Eseguire le transfezioni in triplice copia, avendo cura di preparare abbastanza reagenti per contabilizzare le perdite di pipettaggio e trasferimento.
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Dosaggio (giorno 2)
- Preparare una soluzione di riserva per i reagenti coelenterazine: ascorbato di sodio 3 M [disciolto in tampone fosfato salino (PBS), preparato fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina di siero bovino (BSA; disciolto in PBS, preparata con ingredienti freschi) e 2 mM coelenterazine (disciolto in metanolo acidificato contenente 200 µ l di 3 N HCl 10 millilitri).
Nota: Il coelenterazine di 2 mM possa essere memorizzati per 2 settimane quando viene mantenuta a-80 ° C e in assenza di luce. - Preparare 2 x coelenterazine reagenti per la lettura della luciferasi, con un separato reagente per le cellule e medie, secondo la tabella 5. Mescolare tutti i reagenti salva la coelenterazine prima, filtrare la miscela attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm e quindi aggiungere il coelenterazine. Proteggere i reagenti dalla luce fino a quando non sono pronti per essere aggiunti ai piatti.
Nota: A causa della perdita di soluzione da filtrazione, rendere abbastanza reagente per rappresentare sia la perdita da filtrazione, nonché da trasferimenti. La tabella 5 Mostra la concentrazione finale di reagenti 2 x (come pure la quantità di soluzione di riserva per aggiungere per leggere su una piastra a 96 pozzetti con un reagente). - Rimuovere le cellule dall'incubatrice 24 ore dopo la trasfezione. Usando una pipetta multicanale, trasferire 50 µ l del medium condizionato da ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fresca, con fondo bianco (opaca).
- Etichettare le piastre per determinare se essi contengono medio o cellule. Se più di una piastra a 96 pozzetti era transfettata, etichettare le piastre in modo da garantire che ogni piatto medio-contenenti è accoppiato con la sua zolla di padre delle cellule.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di reagente non litici coelenterazine: 2x per la piastra che contiene solo il medium condizionato. Delicatamente roccia o agitare la piastra in assenza di luce per 5-10 minuti a TA.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di reagente di litica coelenterazine x 2 per la piastra che contiene le cellule. Delicatamente roccia o agitare la piastra in assenza di luce per 5-10 minuti a TA.
- Dopo l'incubazione, letto la luminescenza della piastra sola medio in un lettore di piastra. Quindi, leggere la luminescenza della piastra che contiene delle cellule nel lettore della piastra stessa.
- Scartare le piastre e salvare i file per l'analisi dei dati.
- Preparare una soluzione di riserva per i reagenti coelenterazine: ascorbato di sodio 3 M [disciolto in tampone fosfato salino (PBS), preparato fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina di siero bovino (BSA; disciolto in PBS, preparata con ingredienti freschi) e 2 mM coelenterazine (disciolto in metanolo acidificato contenente 200 µ l di 3 N HCl 10 millilitri).
3. analisi dei dati
- Eseguire un'analisi iniziale dei dati utilizzando il software di foglio di calcolo. Creare un foglio di calcolo contenente i risultati di cella e le piastre di terreno.
- Controllare manualmente i dati delle placche in cella per identificare pozzi mal trasfettate. Pozzi che mostrano < 5% - 10% della lettura del plasmide controllo negativo (S386A) dovrebbe essere considerata come scarsamente transfettate, rendendo l'interpretazione di quei dati sospetto.
- Calcolare la luminescenza di fondo media di ciascuna piastra dai pozzetti mock-transfettate. Sottrarre lo sfondo di ogni piatto dai valori di quel piatto.
Nota: Questo valore può essere trascurabile a seconda del lettore della piastra utilizzato. - Elaborare i dati da calcolare la proporzione di attività luciferasica nel medio rispetto all'attività complessiva di luciferase per ciascun pozzetto. Perché la piastra di cella contiene entrambi medium condizionato oltre alle cellule, e la piastra solo medio contiene la stessa quantità del medium condizionato alla piastra, è opportuno utilizzare la seguente equazione:
Qui, RLU = luminescenza relativa unità, la lettura di sfondo-sottratto dal lettore della piastra. - Calcolare la media luciferasi secrete del controllo positivo (WT) e i pozzetti di controllo negativo (S386A).
- Valutare la qualità complessiva dell'esperimento calcolando un fattore Z13:
Nota: I valori attivi provengono dal controllo positivo (WT) e i valori inattivi dai pozzetti di controllo negativo (S386A). Valori più vicini a 1 indicano una qualità superiore sperimentale. Provare a ripetere l'esperimento o ottimizzazione del workflow se il valore è inferiore a 0. - Trasferire i dati dal foglio di calcolo nel software di analisi di dati scientifici.
- Normalizzare l'attività di luciferase secrete per i valori medi del controllo positivo (WT) e il controllo negativo (S386A), impostando il controllo positivo come negativo ed 1 come 0.
- Pulire i dati per valori anomali utilizzando il metodo di rimozione (disfatta) di regressione e outlier, impostazione della velocità massima scoperta falsa all'1%.
- Valutare per differenze statisticamente significative confrontando i dati per ogni condizione mutante (o mutante) alla media dell'attività WT (normalizzato per un valore pari a 1). Eseguire più spaiati t-test, correzione per i confronti multipli utilizzando il metodo di Holm-Sidak e α = 0.05.
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Representative Results
Il saggio di proteolisi di alto-rendimento si basa su superare tre grandi sfide. In primo luogo, per superare l'uscita intrinsecamente bassa di una proteasi PCSK9 singolo-fatturato, una proteasi di PCSK9 manca l'inibitoria propeptide è utilizzato, con la sequenza di clivaggio Tail il propeptide collegata a una luciferasi che possono essere secrete14. In secondo luogo, per soddisfare la necessità per la proteasi piegare complesso con suoi inibitori propeptide, che due polipeptidi sono coespressi in trans in un contesto cellulare15,16, tramite un vettore di sialophosphoprotein. In terzo luogo, per differenziare la sfaldati dal substrato ApoAlert, la proteasi PCSK9 viene troncata a C678, che impedisce l'uscita della PCSK9 complesso dal reticolo endoplasmatico (ER), ma non ha alcun effetto sulla funzione proteolitica17,18 . Presi insieme, questo permette una valutazione della luciferasi secrete come proxy per la presenza ed il grado di proteolisi PCSK9 (Figura 1A). Il calendario generale del dosaggio è breve, con la procedura di mutagenesi sito-diretta del vettore analisi (giorni 1 - 2) seguito dalla trasfezione transiente (giorno 3) e lettura di luciferasi (giorno 4) tutti i completato appena 4 giorni, con un tempo minimo "hands-on" ( Figura 1B).
Nel complesso, questo test permette la valutazione simultanea di PCSK9 proteolisi in una varietà di condizioni, con la lettura fatta da un'analisi di luciferase. Dopo l'acquisizione e l'elaborazione, i dati possono essere visualizzati in formato tabulare o mappa di calore. In particolare, l'analisi mutazionale di codifica SNPs sono adatto a questo approccio. La figura 2 Mostra una mappa di calore di una libreria di mutagenesi di saturazione valutando la specificità di sequenza di clivaggio della proteasi PCSK9 in siti di substrato P6 attraverso P6'. I risultati mostrano che la sequenza di clivaggio ottimale è essenzialmente la stessa come la sequenza di WT (SSVFAQ | SIPWNL). In particolare, la mutazione del P6 o P4 attraverso P1' residui è mal tollerata dalla proteasi, coerente con la scanalatura poco profonda, idrofobo, associazione per queste posizioni nella struttura di cristallo di maturare, spaccati PCSK9. Dal punto di vista dello sviluppo di inibitore, questo profilo di specificità di sequenza stretta è un'individuazione utile, come suggerisce che nessun substrato idealizzato mimetico potrebbe prevalere la sequenza di clivaggio endogeno. La figura 3 Mostra l'attività di fenditura relativa (rispetto al WT) di una libreria di SNPs missenso descritto nella clinica, tracciata sulla struttura primaria PCSK9. Dell'84 SNPs valutati, oltre la metà ha mostrato un cambiamento significativo nell'attività rispetto alla proteasi WT. Questi risultati suggeriscono che le alterazioni nell'attività proteolitica PCSK9 sono infatti abbastanza comune nella popolazione clinica, e tali alterazioni possono contribuire a spiegare la variabilità nei livelli di colesterolo LDL veduti nella clinica.
Figura 1: Schema generale del dosaggio ad alta produttività in trans PCSK9 clivaggio. (A) questo pannello mostra uno schema biochimico del saggio qui presentato. Il substrato è costituito dalla sequenza del segnale di PCSK9 (grigio scuro) e il propeptide (rosso) collegata alla luciferasi che possono essere secreto (NLuc, verde) dalla sequenza di clivaggio di PCSK9 (giallo). La proteasi è costituito dalla sequenza segnale (grigio scuro), il dominio catalitico (grigio chiaro) e il dominio (CHR) ricco di cisteina-istidina contenente il troncamento di C679X. La coppia di substrato-proteasi è coespressi alle quantità stechiometrica in un vettore basato su 2A sialophosphoprotein, suscettibile di manipolazione genetica. Su coexpression, la proteasi e substrato co-piegare e rimanere sequestrati nel reticolo endoplasmico (ER). Con attività di fenditura, la luciferasi sono liberato dal complesso e secreta, dove può essere rilevato mediante il saggio di luciferasi del medium condizionato. Potenziali perturbazioni all'attività di fenditura includono, ma non sono limitati a, manipolazione genetica (perturbazione A) o la presenza di piccole molecole (perturbazione B). (B), questo pannello mostra la sequenza temporale per l'analisi globale. Mutagenesi sito-diretta sul plasmide WT viene eseguita nei giorni -1 e 0, seguito dalla transfezione il giorno 1 e l'analisi di luciferase il giorno 2, per una totale sequenza temporale di 4 giorni. Questa figura è stata adattata da Chorba et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sequenza specificità della proteasi PCSK9. (A) questa calore mappa mostra l'attività proteolitica, normalizzate in background e WT, per ogni singolo aminoacido mutante di una libreria di mutagenesi di saturazione del P6 attraverso P6' sequenza di clivaggio. L'identità di sequenza WT è mostrato nella parte inferiore, con i valori per la sequenza WT visualizzate sia nella parte superiore ed evidenziato da rettangoli bianchi. Il valore 0 (nero) indica attività in background e un valore di + 1 (verde) indica il valore WT. (B), questo calore mappa mostra la deviazione standard dei valori di proteolisi dalla stessa libreria di mutagenesi di saturazione, con valori inferiori in neri e più alti valori in rosso. Valori delineati in rettangoli bianchi tratteggiate rappresentano mutanti che hanno mostrato valori di proteolisi significativamente differente da quello della proteasi WT, come determinato da Holm-Sidak-corretto, spaiati t-test con α < 0.05. I dati riportati sono da 3 esperimenti indipendenti, ciascuna contenente 3 replicati. Questa figura è stata adattata da Chorba et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: effetti di PCSK9 SNPs sulla funzione proteolitica. (A), questo pannello mostra la struttura primaria di PCSK9, contenenti la sequenza segnale (SS; contorno nero), il propeptide (contorno rosso), il dominio catalitico (contorno grigio) e la cisteina-istidina ricco dominio (CHR; contorno blu). (B) questo pannello mostra la posizione di 84 SNPs clinica (gialli rettangoli con contorni neri) collocato nell'analisi della proteolisi, mappato sulla struttura primaria. (C) questo pannello mostra i valori dei 47 SNPs con significativamente alterata attività proteolitica rispetto alla proteasi WT, come determinato da Holm-Sidak-rettificato spaiato t-test con α < 0.05. I valori vengono mappati sulla struttura primaria PCSK9, con un valore di -1 (rosso) che indica nessuna attività proteolitica e un valore di + 1 (ciano) che indica un miglioramento 2 volte sopra la proteasi WT. Questa figura è stata adattata da Chorba et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: disegno di primer PCR mutagene Site-directed. Gli iniettori di PCR sono parzialmente sovrapposti sequenze, secondo il disegno indicato. La tabella seguente è riportato un esempio di una coppia di primer di successo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
| Componente | Stock | Volume (µ l) | Finale |
| Ultrapura H2O | 17,5 | a 25 µ l di volume totale | |
| Tampone di reazione della polimerasi | 5 X | 5 | 1 X |
| Deossinucleotidi (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Modello (wild-type (WT)) | 2 ng / µ l | 0,5 | 1 ng (totale) |
| Primer (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Primer (Rev) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Polimerasi del DNA ad alta fedeltà | 2 U/Μ l | 0.25 | 0,5 U (totale) |
Tabella 2: componenti di una PCR per mutagenesi. I componenti dovrebbero essere aggiunti nell'ordine in cui sono elencati, con la miscela tenuta su ghiaccio fino a quando la reazione comincia.
| Passo | Temperatura (° C) | Tempo | |
| Denaturazione iniziale | 1 | 98 | 30 s |
| Denaturazione | 2 | 98 | 10 s |
| Ricottura | 3 | (Tm modello) * + 1 | 20 s |
| Estensione | 4 | 72 | 30 s/kilobasi (kb) (4 min) |
| Escursioni in bicicletta | 5 (Vai al passaggio 2, totale 35 cicli) | ||
| Estensione finale | 6 | 72 | 5 min |
| Tenere premuto | 7 | 12 | Tenere premuto |
| * - Scegli la bassa Tm modello della coppia di primer | |||
Tabella 3: parametri suggeriti in bicicletta per la PCR. I parametri suggeriti rappresentano un buon punto di partenza ma possono richiedere ottimizzazione.
| Primer | Posizione di ricottura | Sequenza (5' a 3') |
| 1 | Promotore CMV | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminale di NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabella 4: convalidato primer per il sequenziamento. Ogni iniettore è stato utilizzato con successo nella regione di codificazione dei plasmidi a cui fa riferimento in questo metodo di sequenziamento.
| Componente (stock) | Non litici (Medium) | Litiche (celle) | Importo da 96 pozzetti (1 piatto) |
| Ascorbato di sodio (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 Μ l |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 Μ l |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0,10% | - | 700 Μ l |
| X-100 Triton | - | 0,10% | 7 Μ l |
| PBS | In 50 µ l/pozzetto | In 50 µ l/pozzetto | A 7000 µ l |
| Filtrare attraverso una membrana di 0,22 µm e trasferire 5880 µ l di filtrato in nuova provetta | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 Μ l |
| Volume totale: 6000 µ l | |||
Tabella 5: componenti di 2 x coelenterazine reagenti per letture di luciferasi. Entrambi non litici e litici reagenti sono necessari per ogni bene che viene analizzata, in modo da valutare separatamente il medium condizionato e cellule transfected. I reagenti sono mescolati e filtrati prima dell'aggiunta della coelenterazine. Dopo l'aggiunta di coelenterazine, è necessario proteggere il reagente dalla luce fino a che pronto per l'uso.
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Discussion
Le procedure sperimentali descritte sopra presentano un metodo per superare l'attività intrinsecamente bassa della singolo-fatturato proteasi PCSK9 e valutare la sua funzione proteolitica in modo robusto. Il concetto chiave del dosaggio si basa sulla conversione di un evento singolo-fatturato in una lettura enzimaticamente amplificata. I punti di forza del test includono la relativamente breve periodo di tempo e facilità d'uso del reporter di luciferase, come pure la sua scalabilità agli approcci di alto-rendimento. Inoltre, il test valuta la proteolisi nel suo contesto nativo, cellulare. Inoltre, con questa analisi, SNP identificati clinicamente può essere valutata per i loro effetti sulla proteolisi di PCSK9 senza la necessità di qualsiasi tessuto umano o il paziente; solo la conoscenza del genotipo di interesse è necessaria.
Esistono alcune limitazioni tecniche del dosaggio. Se il test restituisce proteolisi all'interno della cellula, richiede anche una sovraespressione del vettore. Poiché il dosaggio richiede la trasfezione transiente della linea cellulare di HEK293T, efficienza di trasfezione aggiunge la variabilità intrinseca del pozzetto a altro. Mentre la proteasi-morti S386A PCSK9 serve come controllo negativo per proteolisi, serve anche come controllo positivo per la transfezione stessa, dal momento che queste cellule producono funzionale, seppur intracellulare intrappolato, luciferasi. Valutando i dati grezzi delle piastre cellulare consente di identificare quelle cellule con lordi variazioni nell'efficienza di trasfezione e questi dati possono essere scartati (e l'esperimento ripetuto se desiderato). Inoltre, elaborazione dei dati per la proporzione di luciferasi secrete fuori la luciferasi totale prodotto aiuta a regolare per piccole variazioni nella consegna di plasmide sia uscita trascrizionale. Tali variazioni dovrebbe interessare allo stesso modo le uscite di luciferasi delle cellule e il medium condizionato. Inoltre, i vettori utilizzati per questo test sono favorevoli alla formazione di linee cellulari stabili inducibile, isogeniche con la linea di Flp-In T-Rex 293 commercialmente disponibile, che è stata usata con successo come un mezzo per bypassare il requisito per lipido-mediata transfezione. Questo rischia di essere una caratteristica attraente applicando l'analisi di uno screening di piccole molecole inibitori di PCSK9 proteolisi. Fin qui, nessun tali inibitori sono stati identificati, sottolineando ulteriormente l'importanza di questo test.
L'ingegneria della proteasi PCSK9 crea anche diversi limiti biologici. In primo luogo, la misura intermolecolari PCSK9 proteolisi, piuttosto che la proteolisi intramolecolare che si verifica con WT PCSK9. Mentre generalmente correlare queste due attività, è improbabile che una tal correlazione esiste in tutte le situazioni biologiche e, quindi, in alcune situazioni, la verifica di tali effetti in una fenditura in cis PCSK9 analisi, probabilmente con un metodo alternativo ad esempio immunoblot, può essere necessaria. Inoltre, il dosaggio può valutare solo missenso SNPs (e non l'effetto delle variazioni di non-codificazione). Infine, anche se PCSK9 proteolisi sono la tappa limitante della secrezione di PCSK9, e la riduzione della proteolisi PCSK9 dovrebbe causare una variante di PCSK9 perdita di funzione (per quanto riguarda il fenotipo clinico di colesterolo), questo non è vero per tutti gli SNPs, che indica che almeno per alcune mutazioni, ulteriore biologia sono a giocare8.
L'utilità di questo test sta nella sua capacità di valutare la funzione proteolitica di una proteasi intrinsecamente bassa resa. Questi concetti di design dovrebbero tradurre alle proteasi diverso da PCSK9 che soffrono di problemi simili. Per eseguire questa modifica, è necessario mantenere il collegamento tra secrezione di clivaggio e luciferasi. Una strategia dove il substrato è sostituito con un tipo mi ancoraggio di membrana collegata a luciferasi tramite una sequenza di clivaggio specifica per la proteasi di interesse dovrebbe soddisfare questo requisito.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo per la valutazione di PCSK9 proteolisi in una moda di alto-rendimento. Questo metodo sarà utile per valutare l'effetto di SNPs clinici sulla proteolisi di PCSK9, sia per lo screening di piccole molecole inibitori di PCSK9.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il generoso sostegno finanziario dal NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH attraverso la UCSF clinica e traslazionale Science Institute catalizzatore Program (UL1 TR000004), il Senato accademico di UCSF, la Fondazione di Hellman, una Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio di cardiovascolare Pfizer ASPIRE (tutte John S. Chorba) e l'Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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