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Biochemistry

एक उच्च प्रवाह Luciferase परख के प्रोटियोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए एकल कारोबार छेड़ने PCSK9

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/58265
Automatic Translation
1, 2, 2
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

Summary

यह प्रोटोकॉल एक आंतरिक रूप से कम गतिविधि, एक सेलुलर संदर्भ में एक कारोबार को छेड़ने की proteolytic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । विशेष रूप से, इस विधि PCSK9 की proteolytic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जाता है, लिपिड चयापचय जिसका proteolytic गतिविधि अपने परम hypercholesterolemic समारोह के लिए आवश्यक है की एक प्रमुख ड्राइवर.

Abstract

प्रोटीन convertase subtilisin/kexin प्रकार 9 (PCSK9) एक एकल कारोबार छेड़ने जो सीरम कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) के स्तर को नियंत्रित करता है और, फलस्वरूप, हृदय रोग है । हालांकि PCSK9 प्रोटियोलिसिस अपने पूर्ण hypercholesterolemic प्रभाव के लिए आवश्यक है, अपने proteolytic समारोह के मूल्यांकन को चुनौती दे रहा है: PCSK9 ही है, केवल एक ही कारोबार से गुजरना जाना जाता है, और प्रोटियोलिसिस के बाद, अपने सब्सट्रेट में बरकरार रखती है एक ऑटो अवरोधक के रूप में अपनी सक्रिय साइट । यहां प्रस्तुत तरीकों का वर्णन एक परख जो इन चुनौतियों पर काबू । परख एक सेल में आण्विक प्रोटियोलिसिस पर केंद्रित संदर्भ आधारित है और गुप्त luciferase गतिविधि है, जो आसानी से वातानुकूलित माध्यम में पढ़ा जा सकता है के लिए सफल दरार लिंक । mutagenesis, क्षणिक अभिकर्मक, और एक luciferase readout के अनुक्रमिक कदम के माध्यम से, परख या तो आनुवंशिक या आणविक PCSK9 की शर्तों के तहत एक उच्च प्रवाह तरीके से प्रोटियोलिसिस गड़बड़ी जांच कर सकते हैं । इस प्रणाली को अच्छी तरह से दोनों के लिए अनुकूल है जैव रासायनिक मूल्यांकन की खोज की नैदानिक पता चला भावना एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs), साथ ही के लिए छोटे PCSK9 प्रोटियोलिसिस के अणु अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए ।

Introduction

PCSK9 एलडीएल रिसेप्टर (एलडीएल-आर) क्षरण के लिए लक्ष्य, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल की स्थापना (एलडीएल-सी) और ड्राइविंग atherosclerotic हृदय रोग1,2। चिकित्सकीय लक्ष्यीकरण PCSK9 मजबूती से कम एलडीएल-सी और रोगियों के लिए हृदय परिणामों में सुधार, यहां तक कि जब एक आक्रामक लिपिड में जोड़ा-statins3,4के साथ चिकित्सा कम । वर्तमान में अनुमोदित चिकित्सा एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण तक सीमित हैं, तथापि, और लागत की कमी से पीड़ित-प्रभावशीलता5,6. इस समस्या को हल करने के लिए, कम महंगा चिकित्सकीय विकल्प, एक के लिए अधिक से अधिक लाभ, या दोनों, लाभ की संभावना रोगियों की पहचान का मतलब है, की जरूरत है ।

छोटे अणु दृष्टिकोण intracellular PCSK9 लक्ष्य सकता है, प्रशासन के एक बेहतर मार्ग उपलब्ध कराने, और लागत को कम करने, उंहें "पवित्र कंघी बनानेवाले की रेती" इस क्षेत्र में7। हालांकि, PCSK9 छोटे अणुओं द्वारा दवा के लिए मुश्किल साबित कर दिया है । एक को छेड़ने के रूप में, लक्ष्यीकरण PCSK9's proteolytic समारोह एक आकर्षक रणनीति है, के रूप में स्वयं प्रोटियोलिसिस PCSK9 परिपक्वता8 के दर को सीमित कदम है और एलडीएल-आर9पर अपनी अधिक से अधिक प्रभाव के लिए आवश्यक है । तारीख करने के लिए, तथापि, इस रणनीति सफल नहीं किया गया है, PCSK9's अद्वितीय जैव रसायन के कारण होने की संभावना: PCSK9 ही10सट, एक एकल कारोबार प्रतिक्रिया प्रदर्शन, और आत्म दरार के बाद, PCSK9 डोमेन सक्रिय साइट में एक के रूप में बंधे रहता है ऑटो-अवरोधक11, किसी भी आगे की readout गतिविधि को रोकने के ।

यह लेख उच्च प्रवाह फैशन8में PCSK9 proteolytic समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । साइट के माध्यम से निर्देशित mutagenesis, जांचकर्ताओं इस परख का उपयोग करने के लिए क्लिनिक में पाया SNPs कोडिंग के प्रभाव जांच कर सकते है उंहें प्रोटियोलिसिस पर प्रभाव के लिए आकलन, दर PCSK9 परिपक्वता के कदम सीमित । इसके अतिरिक्त, इस विधि उच्च प्रवाह स्क्रीन के डिजाइन में उपयोगी हो जाएगा PCSK9 प्रोटियोलिसिस, जो अंततः एलडीएल-R करने के लिए PCSK9 की प्रस्तुति को बाधित करने के लिए अनुमानित है के मॉडुलन की पहचान (और PCSK9's hypercholesterolemic प्रभाव मॉडुलन) . अंत में, इस प्रोटोकॉल आंतरिक रूप से कम गतिविधि के साथ अंय चिढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, बशर्ते कि मैं) एक विशिष्ट सब्सट्रेट-छेड़ो जोड़ी पाया जा सकता है, और द्वितीय) एक उपयुक्त intracellular लंगर सब्सट्रेट के लिए स्थापित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. Site-Mutagenesis का निर्देशन वेक्टर के निर्देश

  1. डिजाइन और आदेश कस्टम-संश्लेषित oligonucleotides मानक साइट के एक संशोधन का उपयोग कर ब्याज की एक उत्परिवर्तन स्थापित करने के लिए-निर्देश mutagenesis प्रोटोकॉल12। मानक नमकीन प्राइमर (अतिरिक्त शुद्धिकरण के बिना) पूरी तरह से स्वीकार्य हैं ।
    नोट: प्राइमर डिजाइन के लिए एक सामांय दृष्टिकोण तालिका 1में संकेत के रूप में आंशिक रूप से अतिव्यापी प्राइमरों बनाने शामिल है, एक पिघलने तापमान (टीएम) ब्याज की पोलीमरेज़ के लिए विशिष्ट कैलकुलेटर का उपयोग कर ।
  2. साइट के लिए पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) सेट अप बर्फ पर निर्देशित mutagenesis, के रूप में तालिका 2में संकेत दिया ।
  3. पीसीआर तालिका 3में इंगित के रूप में सायकल ।
  4. एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक पीसीआर के 2-5 µ एल भागो और एक सफल प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए उत्पादों की कल्पना ।
    नोट: एक सफल पीसीआर टेम्पलेट (~ ७.८ kB) के अनुमानित आकार मार्कर पर एक एकल, प्रमुख डीएनए बैंड दिखाएगा ।
  5. जोड़ें ०.५ µ एल (प्रति 25-µ l प्रतिक्रिया) DpnI की और 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
  6. बदल रासायनिक सक्षम ई कोलाईमें प्रतिक्रिया के 2 µ एल ।
    नोट: एक तेजी से बढ़ ई. कोलाई तनाव गर्मी समय कम हो जाएगा, लेकिन किसी भी क्लोनिंग तनाव स्वीकार्य हो जाएगा ।
  7. ५०-१०० µ जी/एमएल carbenicillin युक्त Luria-Bertani (पौंड) आगर पर रूपांतरणों प्लेट । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें ।
  8. एक लघु संस्कृति में विकसित करने के लिए 2-4 कालोनियों का चयन करें (५०-१०० µ g/एमएल carbenicillin) के साथ पौंड मीडियम की 2-5 मिलीलीटर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर २२० rpm पर संस्कृति मशीन जब तक यह पंकिल है ।
  9. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्लाज्मिड डीएनए शुद्धि (यानी, "miniprep") किट का उपयोग कर कोशिकाओं से प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें । एक microvolume spectrophotometer का उपयोग कर eluted डीएनए की एकाग्रता को बढ़ाता है ।
  10. प्लाज्मिड डीएनए बड़े पैमाने पर एक सैंज sequencing सेवा (जैसे एक कोर या वाणिज्यिक सुविधा) का उपयोग कर अनुक्रम । सेवा के विनिर्देशों के अनुसार डीएनए नमूने तैयार करें । प्राइमर पहले अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया तालिका 4में उल्लेख कर रहे हैं ।
    नोट: पूरे प्लाज्मिड की पीसीआर प्रवर्धन करने के लिए कारण, पूरे PCSK9 कोडिंग क्षेत्र के अनुक्रमण प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए सिफारिश की है ।

2. उच्च प्रवाह Luciferase-प्रोटियोलिसिस परख आधारित

  1. सेल चढ़ाना (0 दिन)
    1. प्रयोगों के लिए कम गद्यांश HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करें और Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में एक संस्कृति के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS). एक ऊतक संस्कृति हूड में बाँझ शर्तों के तहत सभी सेल काम करने के लिए तैयार जब तक परख luciferase गतिविधि के लिए । कुओं और प्रयोग के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या का अनुमान है, आशंका है कि transfections प्रत्येक स्थिति का परीक्षण के लिए तपसिल में प्रदर्शन किया जाएगा ।
    2. अलग कर देना कोशिकाओं को कवर करने के लिए ०.०५% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) की एक न्यूनतम मात्रा के साथ उन्हें इलाज के द्वारा एक माता पिता की कुप्पी से HEK293T कोशिकाओं. निष्क्रिय DMEM के 2 संस्करणों के साथ trypsin-EDTA 10% FBS के साथ पूरक और एक बाँझ ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती (और trypan नीले रंग के साथ धुंधला) । 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ५०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
    3. महाप्राण trypsin-युक्त मध्यम और संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं का पुनर्गठन करने के लिए एक एकाग्रता के लिए 2 x 105 कोशिकाओं/ एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, एक सफेद (अपारदर्शी-नीचे) ९६ अच्छी तरह से प्लेट, जो 2 x 104 कोशिकाओं की एक अंतिम बोने की एकाग्रता देता है की एक अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं के १०० µ एल हस्तांतरण/
      नोट: प्रारंभिक प्रयोगों के लिए, यह करने के लिए उपयोगी हो सकता है इसके अलावा एक बहन बीज, स्पष्ट नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली, ताकि प्रोटोकॉल और गाइड भविष्य समस्या निवारण के दौरान सेल विकास और पालन की निगरानी के लिए ।
    4. ३७ ° c और 5% CO2 में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    5. एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में plasmids की एक मास्टर प्लेट तैयार करें । रेफरेंस बफर में प्रत्येक प्लाज्मिड को पतला करें (Tris-HCl, pH ८.५) को ९६-वेल प्लेट के एक व् यक्ति में ५० एनजी/µ l
      1. 4 कुओं प्रत्येक सकारात्मक नियंत्रण के लिए तैयार (WT) प्लाज्मिड8, नकारात्मक नियंत्रण (S386A) प्लाज्मिड8, और प्लाज्मिड मुक्त बफर (नकली transfections के लिए) । यदि दवा या अंय सेलुलर आधारित उपचार की योजना बनाई जा रही है, तो सकारात्मक नियंत्रण के साथ मास्टर प्लेट तैयार (WT) प्लाज्मिड एक अच्छी तरह से, साथ 4 कुओं प्रत्येक नकारात्मक नियंत्रण (S386A) प्लाज्मिड और प्लाज्मिड मुक्त बफर के साथ ।
  2. अभिकर्मक (day 1)
    1. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में अभिकर्मक मिश्रण तैयार दीप अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर । तपसिल में transfections प्रदर्शन, pipetting और हस्तांतरण घाटे के लिए खाते के लिए पर्याप्त रिएजेंट तैयार करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है ।
      नोट: निम्नलिखित गणना पर्याप्त तपसिल में १ ९६ अच्छी तरह से थाली चलाने के लिए एजेंट तैयार (४२० कुओं के लिए रूढ़िवादी अनुमानित).
      1. एक पतला लिपिड अभिकर्मक एजेंट का एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए, कम सीरम माध्यम के २०५० µ एल के लिए ५०.४ µ एल रिएजेंट जोड़ने. एक डीएनए के एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए एक जटिल एजेंट, जोड़ने के ३३.६ µ एल में एजेंट के १७३० µ एल में कम सीरम मध्यम.
      2. एक मल्टीचैनल पिपेट, aliquot १६.८ µ एल का उपयोग कर पतला डीएनए के एक कुआं में अच्छी तरह से थाली के मिश्रण का एजेंट ।
      3. एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, aliquot ३.२ µ एल (१६० एनजी) प्रत्येक प्लाज्मिड की गहरी अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं में मास्टर प्लेट से ।
      4. एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, aliquot 20 µ एल के पतला लिपिड अभिकर्मक एजेंट मिश्रण के एक अच्छी तरह से थाली और मिश्रण की सामग्री के लिए एक अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । प्लेटों को कवर और उंहें कमरे के तापमान पर बैठने के लिए (RT) 10-15 करने के लिए मिनट लिपिड फार्म: डीएनए परिसरों ।
        नोट: अभिकर्मक पर, अच्छी तरह से प्रति अंतिम घटक के रूप में इस प्रकार होगा: ४० डीएनए के एनजी, अभिकर्मक के ०.१२ µ एल, और ०.०८ डीएनए पूर्व के µ एल-जटिल रिएजेंट, और एक अच्छी तरह से सामग्री के कुल मात्रा में 10 µ एल होगा (कम सीरम मध्यम) ।
    2. धीरे ९६ में 293T कोशिकाओं पर मध्यम विनिमय-अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्लेटें, देखभाल करने के लिए कोशिकाओं को बाधित नहीं । 10% FBS के साथ पूरक DMEM के ९५ µ l के साथ aspirated माध्यम बदलें ।
      नोट: यह एक उपयुक्त समय के लिए ब्याज की किसी भी दवा के साथ कोशिकाओं का इलाज होगा ।
    3. एक मल्टीचैनल पिपेट के माध्यम से प्रत्येक उपयुक्त अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें । धीरे से कुएँ में सामग्री मिलाने के लिए थाली घूमता रहा. ३७ ° c के साथ 5% सह2 के लिए 24 घंटे के लिए थाली मशीन
      नोट: कुओं की अंतिम मात्रा १०५ µ एल के लिए आता है, के लिए 24 एच पर वाष्पीकरण के लिए खाते ।
  3. परख (day 2)
    1. coelenterazine रिएजेंट के लिए एक शेयर समाधान तैयार करें: 3 एम सोडियम ascorbate [फास्फेट में भंग-बफर खारा (पंजाब), तैयार ताजा], 5 एम NaCl, 10 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA; पंजाब में भंग, ताजा तैयार), और 2 मिमी coelenterazine (भंग में acidified मेथनॉल युक्त 3 एन एचसीएल के २०० µ एल प्रति 10 मिलीलीटर).
      नोट: 2 मिमी coelenterazine 2 सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है जब यह-८० डिग्री सेल्सियस पर रखा है और प्रकाश के अभाव में ।
    2. luciferase readout के लिए 2x coelenterazine रिएजेंट तैयार करें, तालिका 5के अनुसार कक्षों और मध्यम के लिए एक अलग रिएजेंट प्रत्येक के साथ । मिश्रण सभी एजेंट coelenterazine पहले बचाने के लिए, एक ०.२२-µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मिश्रण फिल्टर, और फिर coelenterazine जोड़ें. जब तक वे प्लेटों में जोड़ा जा करने के लिए तैयार हैं प्रकाश से रिएजेंट की रक्षा.
      नोट: निस्पंदन से समाधान की हानि के कारण, निस्पंदन से दोनों नुकसान के लिए खाते के लिए पर्याप्त एजेंट बनाने के लिए, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानांतरण से । 5 तालिका 2x रिएजेंट के अंतिम एकाग्रता से पता चलता है (के रूप में अच्छी तरह के रूप में शेयर समाधान की राशि के लिए बाहर १ ९६ पढ़ने में जोड़ने के लिए अच्छी तरह से एक एजेंट के साथ थाली) ।
    3. अभिकर्मक के बाद मशीन 24 एच से कोशिकाओं को हटा दें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, एक अच्छी तरह से एक ताजा, सफेद तली (अपारदर्शी) ९६ प्लेट के लिए वातानुकूलित माध्यम के ५० µ एल हस्तांतरण ।
      1. प्लेटों को इस रूप में लेबल करें कि उनमें मध्यम या कोशिकाएं हों । यदि १ ९६ से अधिक अच्छी तरह से प्लेट transfected था, तो प्लेटों को लेबल करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक मध्यम-युक्त प्लेट कक्षों की अपनी पैरेंट प्लेट के साथ बनती है ।
    4. एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, 2x गैर के ५० µ एल जोड़ने-lytic coelenterazine एजेंट केवल वातानुकूलित माध्यम युक्त थाली के लिए । धीरे चट्टान या आरटी में 5-10 मिनट के लिए प्रकाश के अभाव में थाली हिला ।
    5. एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, 2x lytic coelenterazine एजेंट की कोशिकाओं को युक्त प्लेट को ५० µ एल जोड़ें । धीरे चट्टान या आरटी में 5-10 मिनट के लिए प्रकाश के अभाव में थाली हिला ।
    6. इस मशीन के बाद, एक थाली पाठक में मध्यम केवल थाली के luminescence बाहर पढ़ें । फिर, बाहर ही प्लेट रीडर में सेल युक्त प्लेट की luminescence पढ़ें ।
    7. प्लेटें छोड़ें और डेटा विश्लेषण के लिए फ़ाइलें सहेजें ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके आरंभिक डेटा विश्लेषण निष्पादित करें । कक्ष और मध्यम पट्टियों से परिणाम वाली स्प्रेडशीट बनाएं ।
  2. खराब transfected कुओं की पहचान के लिए सेल प्लेटों से डेटा का मैंयुअल रूप से निरीक्षण करें । ऐसे वेल्स जो नकारात्मक नियंत्रण (S386A) प्लाज्मिड के readout का < 5%-10% दिखाते हैं, उसे खराब transfected माना जाना चाहिए, जिससे उन डेटा की व्याख्या संदिग्ध हो जाती है ।
  3. नकली-transfected कुओं से प्रत्येक प्लेट की औसत पृष्ठभूमि luminescence की गणना. उस प्लेट के मूल्यों से प्रत्येक थाली की पृष्ठभूमि घटाना ।
    नोट: यह मान प्लेट रीडर उपयोग के आधार पर नगण्य हो सकता है ।
  4. प्रत्येक कुआं के लिए समग्र luciferase गतिविधि की तुलना में मध्यम में luciferase गतिविधि के अनुपात की गणना करके डेटा की प्रक्रिया करें । क्योंकि कक्ष प्लेट में कक्षों के अलावा दोनों वातानुकूलित माध्यम होते हैं, और मध्यम-केवल प्लेट में कक्ष प्लेट के रूप में वातानुकूलित माध्यम की समान मात्रा होती है, इसलिए निम्न समीकरण का उपयोग करना उचित है:
    Equation 1
    यहां, RLU = रिश्तेदार luminescence इकाइयों, पृष्ठभूमि-प्लेट रीडर से घटाया readout ।
  5. सकारात्मक नियंत्रण (WT) और नकारात्मक नियंत्रण (S386A) कुओं का मतलब स्रावित luciferase की गणना ।
  6. एक Z-कारक13की गणना करके प्रयोग की समग्र गुणवत्ता का मूल्यांकन करें:
    Equation 2
    नोट: सक्रिय मान धनात्मक नियंत्रण (WT) से आते हैं और निष्क्रिय मान नकारात्मक नियंत्रण (S386A) कुओं से आते हैं । मान 1 के करीब एक उच्च प्रयोगात्मक गुणवत्ता से संकेत मिलता है । यदि मान 0 से नीचे है तो प्रयोग को दोहराने या वर्कफ़्लो को ऑप्टिमाइज़ करने पर विचार करें ।
  7. स्प्रेडशीट प्रोग्राम से डेटा को वैज्ञानिक डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में स्थानांतरित करना ।
  8. धनात्मक नियंत्रण (WT) और ऋणात्मक नियंत्रण (S386A) के माध्य मानों के लिए गुप्त luciferase गतिविधि को सामान्य करें, 1 के रूप में धनात्मक नियंत्रण सेट कर रहा है और ऋणात्मक नियंत्रण 0 के रूप में ।
  9. प्रतीपगमन और ग़ैर निष्कासन (भगदड़) विधि का उपयोग कर outliers के लिए डेटा साफ़ करें, अधिकतम false खोज दर 1% करने के लिए सेट कर रहा है ।
  10. प्रत्येक उत्परिवर्ती हालत (या उत्परिवर्ती) के लिए WT गतिविधि के माध्य (1 के मान को सामान्यीकृत) के लिए डेटा की तुलना करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के लिए मूल्यांकन करें । होल्म-Sidak विधि और α = ०.०५ का उपयोग करते हुए एकाधिक तुलना के लिए सुधारते हुए, कई ख़राब t-परीक्षण निष्पादित करें ।

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Representative Results

उच्च प्रवाह प्रोटियोलिसिस परख तीन प्रमुख चुनौतियों पर काबू पाने पर निर्भर करता है । सबसे पहले, एक एकल कारोबार PCSK9 के आंतरिक रूप से कम उत्पादन पर काबू पाने के लिए, एक PCSK9 निरोधात्मक की कमी के लिए डोमेन का प्रयोग किया जाता है, एक luciferase है कि14गुप्त किया जा सकता है से जुड़ी डोमेन की पूंछ पर दरार अनुक्रम के साथ । दूसरा, के लिए की जरूरत को संतुष्ट करने के लिए अपनी निरोधात्मक डोमेन के साथ जटिल में गुना, दो polypeptides एक सेलुलर संदर्भ में ट्रांस में coexpressed रहे है15,16, एक bicistronic वेक्टर के द्वारा । तीसरा, बिना सट सब्सट्रेट से सट कर अंतर करने के लिए, PCSK9 का टीज़र C678 पर कटा हुआ है, जो endoplasmic जालिका (ER) से PCSK9 कॉम्प्लेक्स के निकास को रोकता है लेकिन proteolytic फंक्शन17,18 पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता . एक साथ लिया, यह उपस्थिति और PCSK9 प्रोटियोलिसिस (आंकड़ा 1a) की डिग्री के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में गुप्त luciferase के एक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । परख की सामांय समय सीमा है, साइट के कदम-परख वेक्टर (1-2 दिन) क्षणिक अभिकर्मक (3 दिन) और luciferase readout (4 दिन) के बाद सभी के रूप में जल्दी में पूरा के साथ के चरणों के साथ कम है, के साथ ंयूनतम "हाथ" समय पर ( चित्र 1b) ।

कुल मिलाकर, इस परख शर्तों की एक किस्म के तहत PCSK9 प्रोटियोलिसिस के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, एक luciferase परख द्वारा किया readout के साथ । अधिग्रहण और प्रसंस्करण के बाद, डेटा या तो गर्मी नक्शे या तालिका स्वरूप में visualized किया जा सकता है । विशेष रूप से, कोडिंग SNPs के उत्परिवर्तन विश्लेषण अच्छी तरह से इस दृष्टिकोण के लिए अनुकूल हैं । चित्रा 2 ' P6 के माध्यम से P6 सब्सट्रेट साइटों पर PCSK9 की दरार अनुक्रम विशिष्टता का मूल्यांकन एक संतृप्ति mutagenesis पुस्तकालय के एक गर्मी नक्शा से पता चलता है. परिणाम बताते है कि इष्टतम दरार अनुक्रम मूलतः WT अनुक्रम के रूप में ही है (SSVFAQ । SIPWNL) । विशेष रूप से, P1 ' अवशेषों के माध्यम से P6 या पी 4 के उत्परिवर्तन खराब को छेड़ने से सहन किया है, परिपक्व, सट PCSK9 के क्रिस्टल संरचना में इन पदों के लिए उथले, hydrophobic बाध्यकारी नाली के अनुरूप । अवरोधक विकास की दृष्टि से, इस संकीर्ण अनुक्रम विशिष्टता प्रोफ़ाइल एक उपयोगी खोज है, क्योंकि यह पता चलता है कि कोई आदर्श सब्सट्रेट mimetic अंतर्जात दरार अनुक्रम प्रतिस्पर्धा कर सकता है । चित्रा 3 SNPs क्लिनिक में वर्णित की एक पुस्तकालय, PCSK9 प्राथमिक संरचना पर बाहर प्रतिचित्रित के सापेक्ष दरार गतिविधि (WT की तुलना में) से पता चलता है । ८४ SNPs का मूल्यांकन किया, आधे से अधिक गतिविधि में WT को छेड़ने की तुलना में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया । इन परिणामों का सुझाव है कि PCSK9 proteolytic गतिविधि में परिवर्तन वास्तव में काफी नैदानिक जनसंख्या में आम हैं, और इस तरह के परिवर्तन के लिए एलडीएल कोलेस्ट्रॉल क्लिनिक में देखा स्तर में परिवर्तनशीलता की व्याख्या करने में मदद कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च ट्रांस PCSK9 दरार परख में प्रवाह का समग्र योजनाबद्ध । (क) इस पैनल के एक जैव रासायनिक योजनाबद्ध यहां प्रस्तुत परख दिखाता है । सब्सट्रेट PCSK9 संकेत अनुक्रम (डार्क ग्रे) और (लाल) PCSK9 क्लीवेज अनुक्रम (पीला) द्वारा (NLuc, हरा) स्रावित किया जा सकता है कि luciferase से जुड़ा हुआ डोमेन के होते हैं । छेड़ने के संकेत अनुक्रम (डार्क ग्रे), उत्प्रेरक डोमेन (प्रकाश ग्रे), और cysteine-histidine अमीर (CHR) C679X जनचेतना युक्त डोमेन के होते हैं । सब्सट्रेट-छेड़ो जोड़ी एक 2a-आधारित bicistronic वेक्टर में stoichiometric मात्रा में coexpressed है, आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी । coexpression पर, चिढ़ाना और सब्सट्रेट सह गुना और endoplasmic जालिका (एर) में तनहा रहते हैं । क्लीवेज गतिविधि के साथ ही luciferase को कॉम्प्लेक्स से मुक्त कर दिया जाता है और स्रावित होता है, जहाँ से इसका पता लगाया जा सकता है वातानुकूलित माध्यम की luciferase परख. दरार गतिविधि के लिए संभावित perturbations शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, आनुवंशिक हेरफेर (गड़बड़ी ए) या छोटे अणुओं की उपस्थिति (गड़बड़ी बी). (ख) यह पैनल समग्र परख के लिए समयरेखा दिखाता है । साइट-WT प्लाज्मिड पर निर्देशित mutagenesis दिन पर किया जाता है-1 और 0, 1 दिन पर अभिकर्मक और 2 दिन पर luciferase परख के बाद, 4 दिनों की कुल समयरेखा के लिए । यह आंकड़ा Chorba एट अल से अनुकूलित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: PCSK9 की अनुक्रम विशिष्टता को छेड़ो । (क) इस गर्मी नक्शा proteolytic गतिविधि से पता चलता है, पृष्ठभूमि और WT को सामान्यीकृत, P6 ' दरार अनुक्रम के माध्यम से P6 के एक संतृप्ति mutagenesis पुस्तकालय के प्रत्येक एकल अमीनो एसिड उत्परिवर्ती के लिए । WT अनुक्रम पहचान नीचे दिखाया गया है, WT अनुक्रम के लिए मानों के साथ दोनों शीर्ष पर दिखाया गया है और सफेद आयतों द्वारा प्रकाश डाला । 0 (black) का कोई मान पृष्ठभूमि गतिविधि इंगित करता है, और + 1 (हरा) का मान WT मान इंगित करता है । (B) यह हीट मैप समान संतृप्ति mutagenesis लाइब्रेरी से प्रोटियोलिसिस मानों के मानक विचलन को दिखाता है, लाल में काले और उच्चतर मानों में कम मानों के साथ. सफेद डैश्ड आयतों में उल्लिखित मान म्यूटेंट का प्रतिनिधित्व करते है जो कि WT के लिए काफी अलग प्रोटियोलिसिस मान दिखाती है, जैसा कि होल्म-Sidak-सही, α < ०.०५ के साथ न बिगड़े हुए t-परीक्षणों द्वारा निर्धारित किया गया है । दिखाया डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से कर रहे हैं, प्रत्येक युक्त 3 प्रतिकृति. यह आंकड़ा Chorba एट अल से अनुकूलित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: proteolytic समारोह पर PCSK9 SNPs के प्रभाव । (A) यह पैनल PCSK9 की प्राथमिक संरचना दिखाता है, जिसमें संकेत अनुक्रम (SS; काली बाह्यरेखा), डोमेन (लाल बाह्यरेखा), उत्प्रेरक डोमेन (धूसर बाह्यरेखा), और cysteine-histidine रिच डोमेन (CHR; नीला बाह्यरेखा) शामिल हैं । (ख) इस पैनल के स्थान से पता चलता है ८४ नैदानिक SNPs (काले रूपरेखा के साथ पीले रंग की आयतों) प्रोटियोलिसिस परख में रखा, प्राथमिक संरचना पर मैप । (ग) यह पैनल WT की तुलना में काफी बदल proteolytic गतिविधि के साथ ४७ SNPs के मूल्यों से पता चलता है, के रूप में होल्म द्वारा निर्धारित-Sidak-α < ०.०५ के साथ सही-ख़राब टीपरीक्षणों । मान के साथ PCSK9 प्राथमिक संरचना पर मैप की जाती हैं, का मान-1 (लाल) कोई proteolytic गतिविधि इंगित करता है और एक मान + 1 (सियान) WT पर एक 2-गुना सुधार का संकेत है । यह आंकड़ा Chorba एट अल से अनुकूलित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: साइट-निर्देशित mutagenic पीसीआर प्राइमर डिजाइन । पीसीआर प्राइमरों आंशिक रूप से अतिव्यापी दृश्यों, डिजाइन के अनुसार दिखाया गया है । एक सफल प्राइमर जोड़ी का एक उदाहरण तालिका के नीचे दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

घटक शेयर मात्रा (µ एल) अंतिम
Ultrapure एच२ओ १७.५ को 25 µ l कुल मात्रा
पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया बफर 5X 5 1X
Deoxynucleotides (dNTPs) २०० µ m ०.५ 4 µ मी
टेम्पलेट (वाइल्ड-टाइप (WT)) 2 एनजी/µ एल ०.५ 1 एनजी (कुल)
प्राइमरी (Fwd) २० µ मी ०.६२५ ५०० एनएम
प्राइमर (Rev) २० µ मी ०.६२५ ५०० एनएम
उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 2 U/µ l ०.२५ ०.५ यू (कुल)

तालिका 2: साइट के लिए एक पीसीआर के घटक-निर्देश mutagenesis । घटक क्रम में जोड़ा जाना चाहिए जिसमें वे सूचीबद्ध हैं, मिश्रण के साथ बर्फ पर रखा जब तक प्रतिक्रिया शुरू होता है ।

चरण अस्थाई (° c) समय
प्रारंभिक विकार 1 ९८ 30 एस
विकार 2 ९८ 10 एस
एनीलिंग 3 (Tm टें पलेट) * + 1 20 एस
एक्सटेंशन 4 ७२ 30 s/kilobase (kb) (4 मिनट)
साइकल चलाना 5 (चरण 2, ३५ चक्र कुल करने के लिए जाओ)
अंतिम विस्तार 6 ७२ 5 min
पकड़ 7 12 पकड़
*-प्राइमरी जोड़ी का लोअर टीएम टेम्पलेट चुनें

तालिका 3: पीसीआर के लिए साइकिल के मापदंडों का सुझाव दिया । सुझाए गए पैरामीटर्स एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है ।

प्राइमर एनीलिंग ठिकाण अनुक्रम (5 ' से 3 ')
1 सीएमवी प्रवर्तक CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
2 PCSK9 A95 TCTCGCAGTCAGAGCGCAC
3 सी-टर्मिनस च्या NLuc TGTGCGAACGCATTCTGGCG
4 PCSK9 C301 GCCAGCGCCTGGCTAGG
5 PCSK9 E501 GAGGCCCAAGGGGGCAAG

तालिका 4: अनुक्रमण के लिए मान्य प्राइमरों. प्रत्येक किताब सफलतापूर्वक इस पद्धति में संदर्भित plasmids के कोडन क्षेत्र अनुक्रमण में इस्तेमाल किया गया है ।

घटक (स्टॉक) Non-Lytic (माध्यम) Lytic (cells) ९६ कुओं के लिए राशि (1 प्लेट)
सोडियम ascorbate (3 मी) 300mm 300mm ७०० µ l
NaCl (5 मी) 5 मिमी 5 मिमी 7 µ l
BSA (10 मिलीग्राम/एमएल, 1%) ०.१०% - ७०० µ l
ट्राइटन एक्स-१०० - ०.१०% 7 µ l
Pbs को ५० µ l/अच्छी तरह से को ५० µ l/अच्छी तरह से को ७००० µ l
फ़िल्टर के माध्यम से ०.२२ µm झिल्ली और हस्तांतरण ५८८० µ एल छानने का में ताजा ट्यूब
Coelenterazine (2 मिमी) ४० µ m ४० µ m १२० µ l
कुल मात्रा: ६००० µ l

तालिका 5: luciferase readouts के लिए 2x coelenterazine रिएजेंट के अवयव । दोनों गैर lytic और lytic रिएजेंट प्रत्येक अच्छी तरह से विश्लेषण किया जाता है के लिए आवश्यक हैं, ताकि अलग से वातानुकूलित मध्यम और transfected कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए । रिएजेंट मिश्रित और coelenterazine के अतिरिक्त करने से पहले फ़िल्टर किए गए हैं । coelenterazine इसके अलावा, उपयोग के लिए तैयार जब तक प्रकाश से एजेंट की रक्षा ।

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Discussion

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के ऊपर वर्णित एक विधि के लिए एकल कारोबार छेड़ने PCSK9 की आंतरिक रूप से कम गतिविधि पर काबू पाने और एक मजबूत तरीके से अपने proteolytic समारोह का मूल्यांकन वर्तमान । परख के प्रमुख अवधारणा एक enzymatically परिवर्धित readout में एक एकल कारोबार घटना परिवर्तित करने पर निर्भर करता है । परख की ताकत अपेक्षाकृत कम समय फ्रेम और luciferase रिपोर्टर के उपयोग में आसानी, साथ ही उच्च प्रवाह दृष्टिकोण के लिए अपनी दरिद्रता शामिल हैं । इसके अलावा, परख अपने मूल, सेलुलर संदर्भ में प्रोटियोलिसिस का मूल्यांकन करता है । इसके अलावा, इस परख के साथ, नैदानिक पहचान SNPs किसी भी मानव या रोगी ऊतक के लिए की आवश्यकता के बिना PCSK9 प्रोटियोलिसिस पर उनके प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है; केवल रूचि के जीनोटाइप का ज्ञान आवश्यक है ।

परख की कई तकनीकी सीमाएं मौजूद हैं । हालांकि परख कोशिका के भीतर प्रोटियोलिसिस का मूल्यांकन करता है, यह भी वेक्टर के एक एक्सप्रेस की आवश्यकता है । क्योंकि परख HEK293T सेल लाइन के क्षणिक अभिकर्मक की आवश्यकता है, अभिकर्मक दक्षता आंतरिक अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी परिवर्तनशीलता को कहते हैं । जबकि तंग मृत S386A PCSK9 प्रोटियोलिसिस के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, यह भी अभिकर्मक ही के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, के बाद से इन कोशिकाओं कार्यात्मक उत्पादन, हालांकि intracellularly फंस, luciferase । सेलुलर प्लेटों के कच्चे डेटा का मूल्यांकन अभिकर्मक दक्षता में सकल बदलाव के साथ उन कोशिकाओं को पहचानने में मदद करता है, और इन आंकड़ों को खारिज किया जा सकता है (और प्रयोग दोहराया अगर वांछित) । इसके अलावा, कुल luciferase उत्पादन से बाहर गुप्त luciferase के अनुपात के लिए डेटा प्रसंस्करण प्लाज्मिड वितरण और transcriptional उत्पादन दोनों में छोटे बदलाव के लिए समायोजित करने में मदद करता है । ऐसी विविधताओं से कोशिकाओं के luciferase outputs और वातानुकूलित माध्यम इसी तरह प्रभावित होने की उम्मीद की जाएगी. इसके अतिरिक्त, इस परख के लिए इस्तेमाल किया वैक्टर inducible के गठन के लिए उत्तरदायी हैं, isogenic स्थिर सेल लाइनों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Flp-में टी-रेक्स २९३ लाइन, जो लिपिड के लिए आवश्यकता बाईपास करने के लिए एक साधन के रूप में सफलता के साथ नियोजित किया गया है-मध्यस्थता अभिकर्मक. यह एक आकर्षक जब PCSK9 प्रोटियोलिसिस अवरोधकों के लिए एक छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए परख लागू करने की सुविधा होने की संभावना है । तारीख करने के लिए, नहीं ऐसे अवरोधकों की पहचान की गई है, आगे इस परख के महत्व को रेखांकित किया ।

PCSK9 की इंजीनियरिंग की भी कई जीवविज्ञान सीमाएं बनती हैं. पहला, परख आण्विक PCSK9 प्रोटियोलिसिस उपाय, बजाय intramolecular प्रोटियोलिसिस कि WT PCSK9 के साथ होता है । हालांकि इन दो गतिविधियों को आम तौर पर सहसंबंधी बनाना, यह संभावना नहीं है कि इस तरह के एक सहसंबंध सभी जैविक स्थितियों में मौजूद है, और, इस प्रकार, कुछ स्थितियों में, इन प्रभावों के सत्यापन में एक सीआईएस PCSK9 दरार परख में, एक वैकल्पिक पद्धति जैसे immunoblot की जरूरत हो सकती है । इसके अतिरिक्त, परख केवल बकवास SNPs का मूल्यांकन कर सकते है (और न गैर के प्रभाव कोडिंग रूपांतरों) । अंत में, हालांकि PCSK9 प्रोटियोलिसिस दर PCSK9 स्राव के कदम को सीमित है, और PCSK9 प्रोटियोलिसिस की कमी के कारण एक नुकसान-समारोह PCSK9 संस्करण (नैदानिक कोलेस्ट्रॉल phenotype के विषय में) की उंमीद है, यह सब SNPs के लिए सच नहीं है, यह दर्शाता है कि कुछ उत्परिवर्तनों के लिए कम से कम, अतिरिक्त जीवविज्ञान8खेल में है ।

इस परख की उपयोगिता के लिए एक आंतरिक रूप से कम उत्पादन को छेड़ने के proteolytic समारोह का मूल्यांकन करने की क्षमता में निहित है । ये डिजाइन अवधारणाओं PCSK9 कि इसी तरह की चुनौतियों से पीड़ित के अलावा अंय को छेड़ने के लिए अनुवाद करना चाहिए । इस संशोधन करने के लिए, यह दरार और luciferase स्राव के बीच कड़ी बनाए रखने के लिए आवश्यक है । एक रणनीति है जहां सब्सट्रेट एक प्रकार मैं झिल्ली एंकर एक दरार ब्याज की इस आवश्यकता को पूरा करना चाहिए के लिए विशिष्ट अनुक्रम के माध्यम से luciferase से जुड़े लंगर के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल एक उच्च प्रवाह फैशन में PCSK9 प्रोटियोलिसिस के मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन । इस विधि दोनों PCSK9 प्रोटियोलिसिस पर नैदानिक SNPs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, साथ ही PCSK9 के छोटे अणु अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक NHLBI/NIH (K08 HL124068 और एलआरपी HMOT1243), NCATS NIH नैदानिक और शोधों विज्ञान संस्थान उत्प्रेरक कार्यक्रम (UCSF UL1), TR000004 शैक्षणिक सीनेट, UCSF फाउंडेशन, के माध्यम से के माध्यम से उदार वित्त पोषण सहायता का धंयवाद एक गिलाद विज्ञान अनुसंधान विद्वान पुरस्कार, एक फाइजर आकांक्षा हृदय पुरस्कार (जॉन एस Chorba के लिए सभी) और हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान (अदरी एम. Galvan और Kevan एम. शोकत) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR Tubes USA Scientific 1402-2900 For PCR
Q5 Hot Start New England Biolabs M0493L High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix New England Biolabs N0447L dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT Authors n/a Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A Authors n/a Available from authors
Agarose LE Gold Biotechnology A-201-100 For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base ThermoFisher Scientific 4466612 For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102 For DNA gels
Tris Base ThermoFisher Scientific BP152-1 For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid ThermoFisher Scientific A38-500 For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution Millipore Sigma 3690 EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder Gold Biotechnology D010 DNA ladder
DpnI New England Biolabs R0176S Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin Teknova L1010 LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C862003 Chemically competent cells
LB Broth, Miller ThermoFisher Scientific BP1426-2 LB
Carbenicillin Gold Biotechnology C-103-5 Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I Omega BioTek D6942-02 DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer ThermoFisher Scientific ND-2000C Spectrophotometer
293T Cells American Tissue Culture Collection (ATCC) CRL-3216 HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate ThermoFisher Scientific 11995065 DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera Axenia Biologix F001 FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300062 Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023 PBS
Countess automated cell counter ThermoFisher Scientific C10227 Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid Grenier Bio-One 655083 White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural USA Scientific 1402-9596 96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates ThermoFisher Scientific 278743 96 well deep well plate
Lipofectamine 3000 ThermoFisher Scientific L3000008 Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent ThermoFisher Scientific L3000008 DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate Millipore Sigma A4034 Sodium ascorbate
Sodium chloride Millipore Sigma S9888 NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals Millipore Sigma 12659 BSA
Methanol (HPLC) ThermoFisher Scientific A4524 MeOH
Hydrochloric acid VWR JT9535-2 Concentrated HCl
Coelenterazine Gold Biotechnology CZ2.5 Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile ThermoFisher Scientific 09-720-3 Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ Rainin 17013810 Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ Rainin 17013808 Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ Rainin 17013807 Multichannel pipette
Reagent reservoir Corning 4870 Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL ThermoFisher Scientific 05-539-12 15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL Corning 430829 50 mL tubes
Spark Microplate Reader Tecan N/a Plate Reader
Excel Microsoft 2016 for Mac Spreadsheet software
Prism GraphPad Software v7 Scientific data analysis software

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References

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जैव रसायन १३८ अंक प्रोटीन convertase subtilisin/kexin प्रकार 9 चिढ़ाना सब्सट्रेट विशिष्टता उच्च प्रवाह परख luciferase कम घनत्व लिपोप्रोटीन कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता दवा स्क्रीनिंग
एक उच्च प्रवाह Luciferase परख के प्रोटियोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए एकल कारोबार छेड़ने PCSK9
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Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9. J. Vis. Exp. (138), e58265, doi:10.3791/58265 (2018).

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